抗CD269(BCMA)人源化抗體的制作方法

本發明涉及結合CD269(BCMA)的人源化抗體或抗體片段，從而破壞CD269和其天然配體(BAFF和APRIL)之間的相互作用，以及它們在治療漿細胞介導的疾病如多發性骨髓瘤和自身免疫疾病中的用途。
背景技術：
：B細胞成熟抗原(BCMA)是腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)的第17個成員。它的天然配體是涉及(通過與進一步的配體相互作用)調節體液免疫、B細胞發育和內穩態的不同方面的B細胞激活因子(BAFF；也稱為BLyS或TALL-1，TNFSF13B)以及增殖誘導配體。BCMA在惡性漿細胞上高度表達，所述惡性漿細胞例如是骨髓B細胞非霍奇金淋巴瘤的多發性骨髓瘤(MM)，以及比MM更具侵略性并構成漿細胞紊亂的所有病例的約4％的漿細胞白血病(PCL)中的惡性漿細胞。除MM和PLC之外，還在患有霍奇金淋巴瘤的患者的霍奇金和里德-斯特恩伯格細胞(HodgkinandReed-Sternbergcells)上檢測到BCMA(Chiu等人(2007)Blood109：729-739)。類似于它在漿細胞上的功能，結合于BCMA的配體顯示了調節表達BCMA的多發性骨髓瘤細胞的生長和存活(Novak等人(2004)Blood103：689-694)。BAFF和APRIL通過BCMA的信號傳導被認為是惡性漿細胞的促存活因子；因此，BCMA陽性腫瘤細胞的清除和/或配體-受體相互作用的破壞應改善多發性骨髓瘤和自身抗體依賴的自身免疫疾病的治療結果。目前存在多種可用于治療多發性骨髓瘤的方法(Raab等人(2009)Lancet374：324-339)。化學療法導致多數受試者僅能部分控制多發性骨髓瘤；僅極少數進行化學療法導致完全消退。因此經常應用結合方法，通常涉及另外施以皮質類固醇，例如地塞米松或強的松。然而，皮質類固醇被副作用，例如減少骨密度所困擾。使用某人自己的干細胞(自體的)或使用來自近親屬或相配型的無血緣供體(異體的)的細胞，干細胞移植也被提出。在多發性骨髓瘤中，進行的多數移植是自體類型。雖然不是可治愈的，但是這樣的移植在選擇的患者中顯示出延長生命(Suzuki(2013)JpnJClinOncol43：116-124)。可供選擇地，最近沙利度胺和其衍生物已被應用于治療但也與次佳的成功率和高成本相關。最近蛋白酶抑制劑硼替佐米(PS-341)被批準用于治療復發性和難治性MM，并且被單獨或與已確定的藥物聯合用于許多臨床試驗，導致令人鼓舞的臨床結果(Richardson等人(2003)NewEnglJMed348：2609-2617；Kapoor等人(2012)SeminHematol49：228-242)。聯合治療的成本是相對高的，并且成功率仍具有顯著的改進的余地。由于同時使用多種藥物時副作用的積累，治療選擇的聯合也不是理想的。用于治療漿細胞疾病，具體是多發性骨髓瘤的新方法是需要的。特異地靶向漿細胞的能力也對治療自身免疫疾病具有巨大益處。通常首先使用非類固醇抗炎藥(NSAID)或疾病緩解性抗風濕藥(DMARD)來治療輕度形式的自身免疫疾病。通常使用類固醇與強免疫抑制劑如靶向周期中細胞的環磷酰胺(一種細胞毒性劑)治療涉及由于活動性疾病導致的器官功能障礙的更嚴重形式的系統性紅斑狼瘡(SLE)。僅最近，在患有自身免疫疾病的患者的血清中高水平存在的靶向細胞因子BAFF的抗體貝利單抗被食品藥品監督管理局(FDA)批準其用于SLE。然而，在人體內僅新形成的B細胞依賴于BAFF以存活，而記憶B細胞和漿細胞對選擇性的BAFF抑制不太敏感(Jacobi等人(2010)ArthritisRheum62：201-210)。對于類風濕性關節炎(RA)，TNF抑制劑是最先被許可的生物制劑，然后是阿巴西普、利妥昔單抗和托珠單抗以及其他：它們抑制涉及關節炎癥和破壞的關鍵炎癥路徑，然而由于相對的免疫抑制，以提高感染風險作為代價(Chan等人(2010)NatRevImmunol10：301-316，Keyser(2011)CurrRheumatolRev7：77-87)。盡管批準了這些生物制劑，患SR和SLE的患者常常顯示自身免疫標志物的持續性，其最可能與骨髓中存在壽命長的、固著的漿細胞相關，所述漿細胞耐受例如通過利妥昔單抗和高劑量糖皮質激素和環磷酰胺療法的CD20介導的切除.已經在本領域描述了結合CD269(BCMA)的抗體和其在治療不同B細胞相關的醫學紊亂中的用途。Ryan等人(MolecularCancerTherapeutics，20076(11)，3009)描述了通過使用BCMA蛋白的第5至54位氨基酸的肽免疫大鼠獲得的抗BCMA抗體。WO2012/163805描述了BCMA結合蛋白，如嵌合抗體和人源化抗體，它們用于阻礙BAFF和/或APRIL與BCMA相互作用的用途以及它們在治療漿細胞惡性腫瘤例如多發性骨髓瘤的潛在用途。在其中公開的抗體通過使用BCMA蛋白的第4至53位氨基酸的重組肽免疫小鼠獲得。WO2010/104949也公開了優選結合BCMA的胞外域的不同抗體以及它們在治療B細胞介導的醫學病癥和紊亂中的用途.WO2002/066516和WO2012/066058公開了結合BCMA和另外的靶標兩者的二價抗體以及它們在治療B細胞相關醫學紊亂中的潛在用途.在兩個公開中的任一個公開中均沒有提供關于二價抗體的結合特性和特異性表位的細節。技術實現要素：鑒于現有技術，作為本發明的基礎的技術問題是提供適用于治療與病原性漿細胞相關的人類疾病如多發性骨髓瘤和自身免疫疾病的制劑。該問題通過獨立權利要求的特征解決。本發明的優選實施方式通過從屬權利要求提供。因此，本發明的目的是提供結合CD269(BCMA)，具體是結合CD269(BCMA)的胞外域的表位的人源化抗體或抗體片段。本文公開的抗體包括人源化序列、特別是優選的VL和VH結合區的人源化序列，該人源化序列保持如關于嵌合抗體J22.9-xi描述的適當的配體親和性。在本發明的不同實施方式中，用于獲得所述人源化序列的氨基酸序列修飾可以在原始嵌合抗體J22.9-xi的CDR區或在骨架區發生，其中所述骨架區應理解為在屬于免疫球蛋白超家族并且比CDR更低“可變”的蛋白質的可變域的區域。完全驚訝的是本文提供的具體的人源化序列，優選涉及結合的VL和VH區的CDR區，顯示了如在實驗例中證實的特異性的和強的結合，并保持了原始嵌合抗體J22.9-xi的結合特征，保持的程度為保持它們的希望的治療效果的程度。因此，本發明涉及包括VH域的抗體或抗體片段，所述VH域包括以下CDR序列：-RYWX1S(H-CDR1；SEQIDNO.15)，其中X1：I、F、L、V、Y.C、G、A、S、T)；-EINPX2X3STINYAPSLKDK(H-CDR2；SEQIDNo.16)，其中X2X3：SS、NS、TS、GS、KS、RS、SD、SN、DE；-SLYX4DYGDAX5DYW(H-CDR3；SEQIDNO.17)，其中X4：Y、L、A、V、F、I、W和/或X5：Y、L、F、I、V、A、C，其中所述抗體或其片段特異地結合CD269(BCMA)的胞外域的表位。尤其驚訝的是本文描述的人源化抗體展示出與原始嵌合抗體相比的序列改變，尤其是在所述嵌合抗體的CDR中的序列改變，該人源化抗體保持了針對它們的治療效果的靶標的足夠的結合特性。技術人員不會預料到人源化變體的結合特征會相似于原始嵌合抗體或小鼠抗體。考慮到可變域，尤其是CDR的序列改變，本文證實的人源化序列的有益的結合特征被認為是驚人的技術效果。在部分人源化抗體和完全人源化抗體之間的結合特征的比較也顯示了完全人源化序列的改善。這表現出完全預料不到的結果。對嵌合體(部分人源化的)的初始修飾導致在結合親和性的一些損失。然而，進一步的人源化的引入繼而導致增強的結合，其中“完全人源化的”序列顯示與原始嵌合體相似的結合特性，從而在進行這樣顯著的序列修飾而不嚴重損失結合親和性之間顯示出驚人的技術效果。在優選的實施方式中，如本文描述的抗體或抗體片段的特征在于VH域包括CDR序列RYWIS(SEQIDNO.18)或RYWFS(SEQIDNO.19)。在優選的實施方式中，如本文描述的抗體或抗體片段的特征在于VH域包括CDR序列EINPNSSTINYAPSLKDK(SEQIDNo.20)或EINPSSSTINYAPSLKDK(SEQIDNo.21)。在本發明的進一步的實施方式中，VH域的第54位氨基酸可以涉及任何給定的氨基酸或修飾的氨基酸。如下面的實例中所示，在該殘基出的N氨基酸的潛在糖基化不顯著破壞抗體特異和較強地結合于靶表位。鑒于該信息，本發明涉及包括如本文描述的CDR2序列的抗體或抗體片段，其中任何給定的氨基酸或修飾的氨基酸可以在CDR2序列中的VH域的第54位氨基酸處出現。在優選的實施方式中，如本文描述的抗體或抗體片段的特征在于，所述VH域包括CDR序列SLYYDYGDAYDYW(SEQIDNO.22)。本發明進一步涉及包括VL域的抗體或抗體片段，所述VL域包括以下CDR序列：-KASQSVX1X2NVA(L-CDR1；SEQIDNO.23)，其中X1X2：ES、SS、TS、QS、HS、DH；-SASLRFS(L-CDR2；SEQIDNO24)；和/或-QQYNNYPLTFG(L-CDR3；SEQIDNO.25)，其中，所述抗體或其片段特異地結合CD269(BCMA)的胞外域的表位。另外，對于LC序列，驚人的是CDR3序列的修飾序列對結合于BCMA靶標不具有顯著的有害作用。此外，本發明的抗體當在溶液中，無論是分離或純化的，或在體外，以及在體內時，在施用后還顯示了預料不到的和有益的穩定性特征，這不會從對原始嵌合抗體進行的序列改變而預料到。在優選的實施方式中，如本文描述的抗體或抗體片段的特征在于，VL域包括CDR序列KASQSVDSNVA(SEQIDNO.26)。在優選的實施方式中，如本文描述的抗體或抗體片段包括含有以下序列的VH域：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWX1SWVRQAPGKGLVWVGEINPX2X3STINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYX4DYGDAX5DYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO.4)，其中X1：I、F、L、V、Y.C、G、A、S、T；X2X3：SS、NS、TS、GS、KS、RS、SD、SN、DE，優選SS；X4：Y、L、A、V、F、I、W；和X5：Y、L、F、I、V、A、C。在優選的實施方式中，如本文描述的抗體或抗體片段的特征在于，所述抗體或抗體片段包括VH域，所述VH域包括根據SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8或SEQIDNO.9的序列.在優選的實施方式中，如本文描述的抗體或抗體片段包括VH域，所述VL域包括序列EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVX1X2NVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELKR(SEQIDNO.12)，其中X1X2：ES、SS、TS、QS、HS、DH。在優選的實施方式中，如本文描述的抗體或抗體片段包括VH域，所述VL域包括根據SEQIDNO.14的序列.在優選的實施方式中，如本文描述的抗體或抗體片段包括含有根據SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8或SEQIDNO.9的序列的VH域以及含有根據SEQIDNO.14的序列的VH域。本發明進一步涉及如本文描述的抗體或抗體片段，包括VH域，其中所述VH域包括根據以下的序列X1VQLX2X3SGGGLVQPGGSLX4LSCAASGX5X6FX7X8YWZ1SWVRX9APGKGLEWX10GEINPZ2SSTINYAPSLKX11X12FX13ISRDNAKNTLYLQMX14X15X16RX17EDTAX18YYCASLYYDYGDAZ3DYWGQGTX19VTVSS(SEQIDNo.41)，其中X1：Q、E；X2：Q、V；X3：Q、E；X4：K、R；X5：I、F；X6：D、T；X7：S、D；X8：R、D；X9：R、Q；X10：I、V；X11：D、G；X12：K、R；X13：I、T；X14：S、N；X15：K、S；X16：V、L；X17：S、A；X18：L、V；X19：S、L；并且其中Z1中的至少一個：I、F、L、V、Y.C、G、A、S、T，優選I或F；Z2：S、N、T、G、K、R、D，優選S和/或Z3：Y、L、F、I、V、A、C，優選Y；并且其中所述抗體或其片段特異地結合CD269(BCMA)的胞外域的表位。該實施方式涵蓋不同的人源化抗體，具體是其VH序列，通過在如本文描述的CDR中進行的有利的人源化定義的所有變體。本發明進一步涉及如本文描述的抗體或抗體片段，包括VL域，其中所述VL域包括根據以下的序列DIVMTQSX1X2X3X4X5X6SVGDX7VX8X9TCKASQSVESNVAWYQQKPX10QX11PKX12LIX13SX14X15LRFSGVPARFX16GSGSGTDFTITISX17LQSEDX18AX19YX20CQQYNNYPLTFGAGTKLELKR(SEQIDNo.42)，其中X1：Q、P；X2：R、A；X3：F、T；X4：M、L；X5：T、S；X6：T、V；X7：R、E；X8：S、T；X9：V、L；X10：R、G；X11：S、A；X12：A、L；X13：F、Y；X14：A、D；X15：S、D；X16：T、S；X17：N、S；X18：L、F；X19：E、V；X20：F、Y；并且其中所述抗體或其片段特異地結合CD269(BCMA)的胞外域的表位。該實施方式涵蓋不同的人源化抗體，具體是其VL序列，通過在如本文描述的CDR中進行的有利的人源化定義的所有變體。關于人源化抗體變體的優選實施方式如本文詳細公開的，根據J22.9-xi的本發明的優選實施方式的序列是人源化的以提供用于施用于人受試者的更相容的試劑。生成并測試J22.9-xi的不同人源化序列變體的對人和獼猴CD269(BCMA)兩者的結合親和性和特異性。來自結合測定的結果證實人源化序列保持了嵌合試劑J22.9-xi的需要的結合特性。在下面的序列中，下劃線區域表示CDR或推定的CDR。關于人源化VH變體的優選實施方式下面提供了本發明的人源化抗體序列的另外的信息。嵌合序列：HC小鼠(SEQIDNo.1)：QVQLQQSGGGLVQPGGSLKLSCAASGIDFSRYWMSWVRRAPGKGLEWIGEINPDSSTINYAPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCASLYYDYGDAMDYWGQGTSVTVSSHC小鼠序列表示最初開發的用于嵌合抗體J22.9-xi的重鏈可變區(VH)，所述嵌合抗體J22.9-xi包括獲得自小鼠抗體的VL和VH域，能夠結合CD269(BCMA)的胞外域的表位，并且所述VL和VH域分別融合于人CL和CH域。部分人源化序列：HC部分人源化(SEQIDNo.2)：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYWMSWVRQAPGKGLEWVGEINPDSSTINYAPSLKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAMDYWGQGTLVTVSSHC部分人源化序列表示與本文公開的嵌合抗體相比修飾的氨基酸序列(通過氨基酸替換)，其中關于其序列修飾VL和VH結合區以使其更適用于對人施用。人源化VH序列：hHC01(SEQIDNo.3)：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLVWVGEINPDSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAMDYWGQGTLVTVSS移除翻譯后修飾基序的人源化VH序列：hHC02(SEQIDNo.4)：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWX1SWVRQAPGKGLVWVGEINPX2X3STINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYX4DYGDAX5DYWGQGTLVTVSS其中：X1：I、F、L、V、Y.C、G、A、S、T，優選I或F；X2X3：SS、NS、TS、GS、KS、RS、SD、SN、DE，優選SS；X4：Y、L、A、V、F、I、W，優選Y；和/或X5：Y、L、F、I、V、A、C，優選Y；“hHC01”和“hHC02”人源化序列表示新的氨基酸序列，該新的氨基酸序列包括與本文描述的原始嵌合序列和部分人源化序列相比的序列改變。PTM突變是意圖移除來自所述蛋白質的潛在有害的翻譯后修飾基序，同時保持有利的結合特性。hHC01和hHC02的第1、5、6、19、27、28、34、39、46、48、54、69、84、85、86、88、93、107和/或115位與原始嵌合抗體序列相比優選是突變(替換)的。替換的重要性主要涉及產生的氨基酸而非起源的氨基酸。因此，改變也可以從原始嵌合氨基酸或其他變體如部分人源化序列的對應氨基酸進行。下面的替換與嵌合(SEQIDNo1)序列相比是新的：-HC(VH)序列的氨基酸M34被替換為任何氨基酸，優選I、L、F、V、Y.C、G、A、S、T；-HC(VH)序列的氨基酸E46被替換為V；-HC(VH)序列的氨基酸D54和S55被替換為任何氨基酸組合，優選SS、TS、GS、KS、RS、SD、SN、DE；-HC(VH)序列的氨基酸Y101被替換為任何氨基酸，優選L、A、V、F、I、W；和/或-HC(VH)序列的氨基酸M107被替換為任何氨基酸，優選L、Y、F、I、V、A、C。可在與BCMA直接相互作用需要的那些殘基處修飾的序列：hHC03-涉及到與BCMA相互作用的修飾氨基酸(SEQIDNo5)：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYX1MX2WVRQAPGKGLVX3VGX4INPDSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASX5X6X7DYGDX8MDYWGQGTLVTVSS其中優選的氨基酸是X1：W、F、Y，優選W；X2：S、T、N、Q、D、E，優選S；X3：W、F、Y，優選W；X4：E、Q，優選E；X5：L、I、V、G、A，優選L；X6：Y、X，優選Y；X7：Y、F、L、I、V、M，優選Y；和/或X8：A、G、V，優選A。“hHC03”人源化序列表示新的氨基酸序列，該新的氨基酸序列包括與原始嵌合序列和部分人源化序列兩則相比的氨基酸序列改變。這些序列改變意圖反映在結合BCMA靶標的可以被替換的氨基酸中的潛在改變，同時保持有利的結合特性。替換的重要性主要涉及產生的氨基酸而非起源的氨基酸。因此，改變也可以從原始嵌合氨基酸或其他變體的對應氨基酸進行。例如：-HC(VH)序列的氨基酸W33是W、F、Y；-HC(VH)序列的氨基酸S35是S、T、N、Q、D、E；-HC(VH)序列的氨基酸W47是W、F、Y；-HC(VH)序列的氨基酸E50是E、Q；-HC(VH)序列的氨基酸L99是L、I、V、G、A；-HC(VH)序列的氨基酸Y100是Y、X；-HC(VH)序列的氨基酸Y101是Y、F、L、I、V、M；和/或-HC(VH)序列的氨基酸A106A、G、V。通常，當獨立于骨架序列作為一個整體考慮時，在人源化過程中對CDR區所做的任何改變也可以被認為是CDR序列的特征。這樣修飾的CDR序列可以被認為是在本文描述的整個骨架區中所述修飾的CDR序列的上下文之內，或獨立于本文描述的整個骨架區中所述修飾的CDR序列的上下文的本發明的限定性特征。例如，在hHC01至hHC03中以下劃線識別的CDR序列可以被認為是獨立于周圍的骨架序列的本發明的限定性特征。人源化HC(VH)序列的特定例子：hHC04(SEQIDNO6)：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWISWVRQAPGKGLVWVGEINPNSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSShHC05(SEQIDNO7)：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWFSWVRQAPGKGLVWVGEINPNSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSShHC06(SEQIDNO8)：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWISWVRQAPGKGLVWVGEINPSSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSShHC07(SEQIDNO9)：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWFSWVRQAPGKGLVWVGEINPSSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSS比對：對在HC序列的不同替換位置的CLUSTALW(1.83)多序列比對在圖8中提供了適當的序列比較。“廣義序列”表示HC序列，其中每個X代表對任何給定的氨基酸的潛在氨基酸改變。優選的氨基酸替換是上文描述的用于每個潛在突變位置的那些。關于人源化VL變體的優選實施方式嵌合序列：LC小鼠(SEQIDNo.43)：DIVMTQSQRFMTTSVGDRVSVTCKASQSVDSNVAWYQQKPRQSPKALIFSASLRFSGVPARFTGSGSGTDFTLTISNLQSEDLAEYFCQQYNNYPLTFGAGTKLELKRLC小鼠序列表示最初開發的用于嵌合抗體J22.9-xi的輕鏈的可變區(VL)，所述嵌合抗體J22.9-xi包括獲得自小鼠抗體的VL和VH域，能夠結合CD269(BCMA)的胞外域的表位，并且所述VL和VH域分別融合于人CL和CH域。部分人源化序列：LC部分人源化(SEQIDNO10)：DIVMTQSPATLSVSVGDEVTLTCKASQSVDSNVAWYQQKPGQAPKLLIYSDDLRFSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELKRLC部分人源化序列表示與本文發明的實施例中公開的嵌合抗體相比修飾的序列(通過氨基酸替換)，其中關于其序列修飾VL和VH結合區以使其更適用于對人施用。人源化VL序列：hLC01(SEQIDNO11)：EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVDSNVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELKR移除翻譯后修飾基序的人源化VL序列：hLC02(SEQIDNO12)：EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVX1X2NVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELKR其中：X1X2：ES、SS、TS、QS、HS、DH、優選ES。“hLC01”和“hLC02”人源化序列表示新的氨基酸序列，該新的氨基酸序列包括與本文描述的原始嵌合序列和部分人源化序列兩者相比的序列改變。PTM突變是意圖移除來自所述蛋白質的潛在有害的翻譯后修飾基序，同時保持有利的結合特性。與原始嵌合抗體序列相比，hLC01和hLC02的第1、8、9、10、13、15、17、19、20、21、22、30、41、43、45、49、58、63、70、77、83、85和/或87位優選是突變(替換)的。替換的重要性主要涉及產生的氨基酸而非起源的氨基酸。因此，也可以從原始嵌合氨基酸或其他變體的對應氨基酸進行改變。下面的替換相對于嵌合序列和部分人源化序列是新的：-LC(VL)序列的氨基酸D1被替換為E；-LC(VL)序列的氨基酸V15被替換為P；-LC(VL)序列的氨基酸D17被替換為E；-LC(VL)序列的氨基酸V19被替換為A；-LC(VL)序列的氨基酸T22被替換為S；-LC(VL)序列的氨基酸D30和S31被替換為任何氨基酸組合，優選ES、SS、TS、QS、HS、DH；-LC(VL)序列的氨基酸V58被替換為I；和/或-LC(VL)序列的氨基酸D70被替換為E。可在與BCMA直接相互作用需要的那些殘基處在其CDR結合區修飾的序列：hLC03-涉及與BCMA相互作用的修飾氨基酸(SEQIDNO13)：EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVDX1X2VX3WX4QQKPGQAPRALIX5X6AX7X8RX9SGIPARFSGSX10X11GTEFTLTISSLQSEDFAVYYCX12QX13NNX14PX15TFGAGTKLELKR其中優選氨基酸為：X1：S、H、T、N、D、Q；X2：N、E、Q；X3：A、G、V、S、T、L、I；X4：Y、F、L、I、V、A、G；X5：Y、F、L；X6：S、T；X7：S、T、D、N、H、E、Q；X8：L、V、I、M；X9：F、L、I、V、Y、M；X10：G、X；X11：S、X；X12：Q、V、L、I、M；X13：Y、F、L、I、Q；X14：Y、F、R、Q、K；和/或X15：L、I、V、F。“hLC03人源化序列”表示新的氨基酸序列，該新的氨基酸序列包括與原始嵌合序列和部分人源化序列兩者相比的氨基酸序列改變。這些序列改變意圖反映在結合BCMA靶標的可以被替換的氨基酸中的潛在改變，同時保持有利的結合特性。替換的重要性主要涉及產生的氨基酸而非起源的氨基酸。因此，改變也可以從原始嵌合氨基酸或其他變體的對應氨基酸進行。例如：-LC(VL)序列的氨基酸S31是S、H、T、N、D、Q；-LC(VL)序列的氨基酸N32是N、E、Q；-LC(VL)序列的氨基酸A34是A、G、V、S、T、L、I；-LC(VL)序列的氨基酸Y36是Y、F、L、I、V、A、G；-LC(VL)序列的氨基酸Y49是Y、F、L；-LC(VL)序列的氨基酸S50是S、T；-LC(VL)序列的氨基酸S52是S、T、D、N、H、E、Q；-LC(VL)序列的氨基酸L53是L、V、I、M；-LC(VL)序列的氨基酸F55是F、L、I、V、Y、M；-LC(VL)序列的氨基酸G66是G、X；-LC(VL)序列的氨基酸S67是S、X；-LC(VL)序列的氨基酸Q89是Q、V、L、I、M；-LC(VL)序列的氨基酸Y91是Y、F、L、I、Q；-LC(VL)序列的氨基酸Y94是Y、F、R、Q、K；和/或-LC(VL)序列的氨基酸L96是L、I、V、F。通常，當獨立于骨架序列作為一個整體時，對CDR區所做的任何改變也可以被認為是CDR序列的特征。這樣修飾的CDR序列可以被認為是在本文描述的整個骨架區中所述修飾的CDR序列的上下文之內，或獨立于本文描述的整個骨架區中所述修飾的CDR序列的上下文的本發明的限定性特征。例如，在hLC01至hLC03中以下劃線識別的CDR序列可以-以未修飾的或替換的形式-被認為是獨立于周圍的骨架序列的本發明的限定性特征。人源化LC序列的例子：hLC04(SEQIDNO14)：EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVESNVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELKR比對：對在LC序列內的各個潛在改變位點的CLUSTALW(1.83)多序列比對在圖9中提供了適當的序列比較。“廣義序列”表示LC序列，其中每個X代表潛在氨基酸改變。優選的氨基酸替換是上文描述的用于每個潛在突變位置的那些。因此，本發明涉及根據hHC01、hHC02、hHC03、hHC04、hHC05、hHC06、hHC07、hLC01、hLC02、hLC03和/或hLC04的人源化序列，或任何給定的其組合。本發明涵蓋對任何本文提出的給定的潛在變體殘基(如在“廣義”序列中識別為X)的潛在修飾的所有可能的組合。通過組合一個或多個這些不同的替換，可以產生展示最初開發的并在本文中證實的嵌合抗體的希望的結合特性的人源化變體。本文描述的抗體或其部分也涵蓋與明確公開或通過序列式公開的那些人源化序列具有至少80％，優選90％序列一致性的序列。關于抗體表位的優選實施方式本發明因此涉及結合CD269(BCMA)的分離的抗體或抗體片段，其中抗體結合包括CD269(BCMA)的第13至第32個殘基中的一個或多位氨基酸的表位。CD269的第13至第32個殘基的氨基酸序列示于SEQIDNo.40。在SEQIDNo.39中提供CD269的N末端序列。CD269的胞外域提供為SEQIDNo.38。包括根據SEQIDNo.38的CD269的胞外域的抗原用于免疫以產生本文描述的小鼠抗體和嵌合抗體的結合特異性。使用整個CD269蛋白或其包括膜結合的或胞內域的片段作為抗體產生期間的抗原，可以產生結合CD269的隱藏域或胞內域的抗體，借此使得這樣的制劑不適于或不利于治療應用。因此本發明的抗體通過它們與CD269的胞外域的結合定義。在胞外域內的特異表位也表示本發明優選的新的并且預料不到的特征。從小鼠抗體或嵌合抗體制備的Fab片段以與純化的BCMA胞外域的復合結晶，并且解出了復合結構。結構分析揭示了本發明的抗體的表位的細節信息以及其生物相關性。本發明的抗體結合包括胞外域的CD269(BCMA)的第13至第32個殘基中的一個或多個氨基酸的表位是有利特性，因為該區域顯示了與CD269的兩種天然配體BAFF和APRIL的結合位點的顯著重疊。至今沒有在本領域描述的抗CD269抗體顯示了與BAFF和APRIL結合位點的這樣的全面重疊。在一種實施方式中，本發明的分離的抗體或抗體片段的特征在于，抗體結合包括CD269(BCMA)的第13、15、16、17、18、19、20、22、23、26、27或32位氨基酸中的一個或多個的表位。在另一種實施方式中，本發明的分離的抗體或抗體片段的特征在于，抗體結合由CD269(BCMA)的第13、15、16、17、18、19、20、22、23、26、27和32位氨基酸組成的表位。這些殘基表示直接與本發明的抗體相互作用的氨基酸，正如本文提供的晶體結構數據所鑒定。關于提供CD269的N末端序列的SEQIDNo.39，對這些殘基進行了編號。在本發明的一種實施方式中，分離的抗體或抗體片段的特征在于，結合于CD269(BCMA)的抗體破壞BAFF-CD269和/或APRIL-CD269相互作用。本發明的抗體與CD269的胞外域的結合破壞了BAFF-CD269的相互作用。由于APRIL和BAFF的結合位點位于與抗體表位相似的位點，抗體與CD269的結合也阻斷APRIL-CD269的相互作用。本發明的抗體的特異表位與APRIL和BAFF的結合位點的比較揭示了在天然配體和本文描述的抗體的結合位點中的全面重疊，所述APRIL和BAFF的晶體結構已經解出并繪制了他們的相互作用。這表示本發明的有利和預料不到的方面，并且使得BAFF-CD269和/或APRIL-CD269的相互作用的破壞可靠并且有效。本發明因此涉及本文描述的分離的抗體或抗體片段，其中抗體通過結合包括CD269(BCMA)的第13、15、17、18、19、22、26、27、30、31、32、33、34、35個殘基中的一個或多個氨基酸的表位，尤其由第13、15、17、18、19、22、26、27、32位氨基酸組成的表位破壞APRIL-CD269相互作用。這些氨基酸分別對應于APRIL在CD269上的結合位點，以及結合如本文描述的抗體和APRIL兩者的CD269的重疊殘基。在另一種實施方式中，本發明因此涉及本文描述的分離的抗體或抗體片段，其中抗體通過結合包括CD269(BCMA)的第13、15、16、17、18、19、22、25、26、27、29、30、31、32、34、35位殘基中的一個或多個氨基酸的表位，尤其由第13、15、16、17、18、19、22、26、27、32位氨基酸組成的表位破壞BAFF-CD269相互作用。這些氨基酸分別對應于BAFF在CD269上的結合位點，以及結合如本文描述的抗體和BAFF兩者的CD269的重疊殘基。雖然在本領域已描述了結合CD269的抗體，其也潛在地破壞APRIL或BAFF與CD269的相互作用，沒有提供涉及這樣的抗體的特異性表位的相關公開內容.不能假設之前描述的抗體與本發明的抗體一樣也結合具有這樣的全面重疊的表位。即使APRIL或BAFF與CD269的相互作用已經顯示被破壞，這可能由于結合相當不同的表位以及隨后發生APRIL或BAFF錨定的位阻而潛在地發生。之前沒有記載由現有的抗體導致的APRIL或BAFF與CD269的相互作用破壞的程度。本發明的抗體使有效并可靠的破壞成為可能，這潛在地表示與本領域中描述的那些抗體相比改進的技術效果。可進行體外阻斷測定以確定并比較BAFF和/或APRIL破壞，例如使用人BCMA的胞外域與重組BAFF或APRIL。在優選的實施方式中，與本文描述的抗體顯示的高親和性結合的表位特異性，代表了新的和預料不到的技術效果.本質上，J22.9抗體和其人源化變體的例外高的親和性，不僅提供了天然配體的結合的“破壞”或“阻斷”；而且本發明的抗體的超高親和性，確保了當抗體存在時，本質上完全或幾乎完全排除天然配體結合它們的BCMA靶標。如以下實施例中公開的，如本文描述的人源化抗體的親和性驚人地高并且相對好于在現有技術中嘗試的相似方法。在pM范圍內的Kd一般被視為在一般實踐中不能預見的出色的親和性。在另一方面，本發明的人源化抗體或抗體片段以高親和性結合CD269，例如，當通過表面等離子體共振如Biacore測量時，抗體以100nM、90、80、70、60、50、40、30nM或更低的親和力，以20nM或更低的親和力，或以15nM或更低的親和力，或以5nM或更低的親和力，或以1000pM或更低的親和力，或以500pM或更低的親和力，或以100pM或更低，或以80pM或更低，或例如約50pM的親和力結合于人CD269.在進一步的實施方式中，當通過表面等離子體共振如Biacore測量時，抗體以約1pM至約100nM，或約100pM至約50nM，或約200pM至約20nM結合于人CD269。本發明的進一步優選的實施方式在一種實施方式中，本發明涉及包括通過直接與CD269靶標相互作用的一個或多個氨基酸和/或通過經水相互作用進行相互作用的一個或多個氨基酸定義的氨基酸序列的抗體或抗體片段(見表1至6)。涉及如本文描述的抗體與表位的結合的大量的水相互作用代表了結合的不尋常和驚人的方面。尤其，抗體指向本文描述的特別表位的高親和性，與涉及抗體與表位之間的結合表面的大量的水相互作用組合，代表了本發明的驚人的和預料不到的方面。本發明因此涉及包括如本文描述的氨基酸序列的抗體或抗體片段，其中所述序列表征為，關于本文公開的嵌合體或關于本文公開的人源化序列變體的對應殘基，存在涉及通過根據表5的水橋(waterbridge)與靶標表位的相互作用表面的特異性氨基酸殘基，所述特異性氨基酸殘基選自包括輕鏈的Ser31、Asn32、Tyr36、Ser50、Ser52、Gly66、Gln89、Tyr91和/或Tyr94，和/或重鏈的Trp33、Ser35、Trp47、Glu50、Leu99和/或Tyr101的組。雖然關于抗體的水橋形成的例子是以J22.9-xi嵌合體進行的，但是發明人聲稱由于與測試的原始嵌合抗體相比在人源化變體中保持了結合特征，使得在本發明的人源化變體中保持了該技術效果。在重鏈中，僅有的突變的水橋殘基為Y101，但它的水相互作用涉及主鏈(即骨架)原子，并因此可被合理地假定為由于使側鏈突變而不會改變；在輕鏈中，沒有涉及水橋的殘基的突變。本發明的抗體可以進一步表征為，涉及經水橋與本文描述的抗體相互作用的表位的氨基酸殘基。在表5中提供了相關特征。例如在一種實施方式中，本發明因此的特征在于，輕鏈的殘基Ser31與CD269的Thr32經水分子相互作用。本發明的抗體的結合特性的這樣的描述旨在用于如表5提供的每個相互作用。此外，在本發明中包括了本文描述的抗體的序列變體，其中涉及“水橋”相互作用的一個或多個殘基是修飾的，以便以水“橋”為代價將直接的側鏈相互作用“替換”入序列。例如，可以在氨基酸序列中進行突變或改變，從相互作用表面置換水而不顯著影響相互作用的親和性。本發明因此涉及包括如本文描述的氨基酸序列的抗體或抗體片段，其中所述序列被表征為，關于本文公開的嵌合體或關于本文公開的人源化序列變體的對應殘基，涉及通過根據表5的水橋與靶標表位的相互作用表面的那些氨基酸殘基的序列變異，所述氨基酸殘基選自包括輕鏈的Ser31、Ser31、Asn32、Tyr36、Ser50、Ser52、Gly66、Gln89、Tyr91和/或Tyr94，和/或重鏈的Trp33、Ser35、Trp47、Glu50、Leu99和/或Tyr101的組.在本文描述的人源化抗體的對應位置的變異可涉及任何給定的氨基酸替換，優選，會有效從相互作用中置換水而保持關于表位親和性和特異性的相似結合特性的氨基酸替換。在本發明的一種實施方式中，分離的抗體或抗體片段的特征在于，抗體是糖基化的，優選包括N-連接寡糖鏈，優選在重鏈的Asn297處。抗體的糖基化是指碳水化合物或聚糖與抗體的連接。N-連接聚糖連接于天冬酰胺或精氨酸側鏈的氮上。連接至耙蛋白的碳水化合物鏈起到不同的功能。例如，除非它們首先進行糖基化，某些蛋白質不正確折疊。而且，連接在蛋白質中的精氨酸的酰胺氮上的多糖對某些分泌的糖蛋白給予穩定性。這種情況下的糖基化對適當折疊不是限制性的需求，而是非糖基化的蛋白可以更快地被降解。如本發明的實施例所證實的，其中公開的抗體的去糖基化導致與糖基化形式的抗體相比治療效果的下降。驚人的是，糖基化在保持抗體的活性上會起到顯著的作用。糖基化因此代表本發明的與預料不到的技術優勢相關的優選實施方式。如本文的實施例所證實的，雖然用J22.9-xi-N-聚糖(去糖基化的)處理的動物的總體腫瘤負荷與接受同種型對照抗體的動物沒有顯著差異，但是與isoAb處理組相比，這些小鼠的壽命顯著地提高。由于J22.9-xi-N-聚糖顯示為不能誘導ADCC或CDC，該結果表明J22.9-xi與BCMA單獨的結合阻礙腫瘤生長。可以合理地考慮，這是由于受體和它的天然配體(APRIL和BAFF)間的相互作用的阻斷。本發明的這個方面和本文描述的抗體代表了驚人的技術效果，該技術效果不能從現有技術的抗體中得到。J22.9-xi-N-聚糖(去糖基化的)可以被考慮為描述的試驗中用于評估潛在的治療效果的對照樣品，該對照樣品能夠使抗體與其靶標表位結合，而沒有ADCC或CDC的下游效應。本發明的抗體，優選具有糖基化的抗體，因此證明了這樣的有效的位點結合，所述結合能夠防止(或顯著破壞)通過天然配體的結合而導致細胞毒性。本文描述的抗體的該特征沒有被描述于本領域中描述的相似的抗體。雖然關于抗體的糖基化的例子用J22.9-xi嵌合體進行，但是發明人聲稱由于與測試的原始嵌合抗體相比保持了人源化變體的結合特征，因此在本發明的人源化變體中保持了該技術效果。糖基化的優選位置(重鏈的Asn297)沒有與任何突變殘基直接連接，并位于人的完整IgG的恒定區。因此，合理假設與嵌合抗體相比，在存在于任何J22.9變體的這個位置的糖基化模式是沒有差異的。本發明的用途和功能方面本發明的抗體能夠結合本文描述的表位，阻斷該表位的天然配體的相互作用并誘導CDC和ADCC。抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)是通過本發明的產生希望的治療效果的抗體誘導的一個因素。ADCC是細胞介導的免疫防御機制，其中免疫系統的效應細胞主動地裂解膜表面抗原已被特異性抗原結合的靶細胞。表達CD269的細胞與本發明的抗體結合后，可以誘導ADCC。經典的ADCC是通過自然殺傷(NK)細胞介導的；巨噬細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞也可以介導ADCC。由于ADCC依賴于在先的抗體應答，ADCC是適應性免疫應答的一部分。小鼠實驗可以表明ADCC是如本文描述的治療性抗體作用的重要機制。本發明的優選的實施方式涉及如本文描述的分離的抗體或抗體片段，供用作治療與病原性B細胞存在相關的醫學紊亂的藥物。在本發明的一種實施方式中，醫學紊亂是CD269相關的紊亂，優選與病原性B細胞相關，其優選為漿細胞和/或記憶B細胞的疾病。漿細胞疾病可以是漿細胞的癌癥，例如多發性骨髓瘤、漿細胞瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥或漿細胞白血病。漿細胞疾病可以是B淋巴細胞的癌癥，如霍奇金病。在本發明的一種實施方式中，醫學紊亂是與自身反應性漿細胞和/或自身反應性記憶B細胞相關的自身免疫疾病，如炎癥性自身免疫疾病，例如系統性紅斑狼瘡或類風濕性關節炎。因此，本發明也涵蓋用于如本文公開的醫學紊亂的治療方法，優選包括向需要這樣的治療的受試者施用治療有效量的抗體。本發明的進一步方面涉及包括如本文所述的抗體或抗體片段的抗體藥物綴合物(ADC)。抗-CD269抗體藥物綴合物“抗CD269ADC”可以被描述為與治療劑綴合的抗CD269抗體或其片段。在某些實施方式中，ADC包括抗CD269抗體(例如本文描述的J22.9-xi的人源化變體)。當施用于患有CD269表達醫學病癥如癌癥或自身免疫紊亂的受試者時，如本文描述的ADC或ADC衍生物對表達CD269的細胞產生臨床有益效果。在一種實施方式中，抗CD269抗體或其衍生物綴合于細胞毒素劑，以致產生的ADC或ADC衍生物表現出對表達CD269的癌細胞的細胞毒性作用，優選當被所述表達CD269的癌細胞占據或內化時。抗CD269的ADC或ADC衍生物優選被內化并積累在表達CD269的細胞中，在所述表達CD269的細胞中ADC或ADC衍生物發揮治療作用(例如細胞毒性作用)。具體地，對綴合于抗體或抗體衍生物的特別適合的部分是化學治療劑、前體藥物轉化酶、放射性同位素或化合物、或毒素。例如，可以將抗CD269抗體或其衍生物與細胞毒性劑如化學治療劑或毒素(例如細胞抑制劑或殺細胞劑)綴合。本發明的另一方面涉及優選分離的核酸分子，所述核酸分子選自由以下組成的組：a)包括以下的核苷酸序列的核酸分子-其編碼根據前述權利要求的任一項所述的分離的抗體或抗體片段，-其編碼選自由根據SEQID1至31和41至42的那些序列組成的組中的氨基酸序列，-包括SEQIDNo.32至36的序列或序列片段，b)與根據a)的核苷酸序列互補的核酸分子；c)包括以下核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列具有足以在功能上與根據a)或b)的核苷酸序列類似/等價的序列一致性，優選與根據a)或b)的核苷酸序列的序列一致性為至少80％，優選為90％，更優選為95％；d)由于遺傳密碼的結果簡并為根據a)至c)的核苷酸序列的核酸分子；以及e)根據a)至d)的核苷酸序列通過刪除、添加、替換、易位、倒位和/或插入進行修飾，并且與根據a)至d)的核苷酸序列在功能上類似/等價的核酸分子。本發明的進一步的方面涉及能夠產生本文描述的抗體或抗體片段和/或包括如本文所述的核酸分子的宿主細胞，如細菌細胞或哺乳動物細胞，優選雜交瘤細胞或細胞系。本發明進一步的方面涉及藥物組合物，其包含如本文描述的分離的抗體或抗體片段、如本文描述的核酸分子或如本文描述的宿主細胞，以及藥學上可接受的載體。本發明的另外的和令人驚訝的方法是如本文公開的抗體的改進的穩定性。所述抗體在適當的條件下可以容易地儲存較長時間而結合親和性沒有任何丟失。關于在-80℃或4℃下儲存之后的活性穩定性已經進行了適當測試，該測試證實了在前述兩種溫度下儲存之后抗體的出人意料的良好穩定性和活性的保持(圖3c)。該改進的穩定性對于嵌合抗體而言是明顯的，并且對于其人源化變體而言也是出人意料的。出人意料地，在長期儲存條件下，人源化變體的穩定性高于嵌合抗體。如本文描述的抗體的進一步的優點是如在實施例中證實的骨髓瘤細胞的系統性耗竭。之前在現有技術中公開的抗體沒有被證實展示出希望的以系統性方式的抗漿細胞作用。針對現有技術的抗體進行的研究僅公開了用骨髓瘤細胞皮下注射并后續處理分離的細胞群。本發明提供了能夠在其靜脈內注射后系統性耗竭癌性多發性骨髓瘤細胞的抗體，如實施例證實的。靶細胞的有效耗竭代表了除了本發明的抗體的有效特性之外，之前未在現有技術中被描述的技術效果。具體實施方式如本文使用的，抗體通常是指由基本上通過免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段編碼的一種或多種多肽組成的蛋白質。在使用術語“抗體”時，術語“抗體片段”也被認為是與之相關的。公認的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區基因，以及無數的免疫球蛋白可變區基因。輕鏈被分類為κ和λ。重鏈被分為γ、μ、α、δ或ε，其反過來分別定義免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。基本的免疫球蛋白(抗體)結構單位已知包括四聚體或二聚體。每種四聚體由完全相同的兩對多肽鏈組成，每對具有一條“輕”(L)鏈(約25kD)和一條“重”(H)鏈(約50-70kD)。每條鏈的N-末端定義約100至110或更多個氨基酸的可變區，其主要負責抗體識別。術語“可變輕鏈”和“可變重鏈”分別是指輕鏈和重鏈的可變區。任選地，抗體或抗體的免疫球蛋白部分可以被化學綴合于或表達為與其他蛋白質的融合蛋白。本發明的抗體意圖結合哺乳類的，尤其是人的蛋白靶標。蛋白質名稱的使用可以與小鼠或人類形式的蛋白質相對應。“特異性結合”應該如通過本領域技術人員理解的，其中所述技術人員清楚地知道可以同于測試結合和結合特異性的各種實驗程序。某些交叉反應或背景結合在許多蛋白-蛋白相互作用中可能不可避免；這不是用于使抗體和表位之間的結合的“特異性”減損。當考慮在理解抗體和表位之間的相互作用中的術語“特異性”時，術語“針對(directedagainst)”也是適用的。本發明的抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，單可變區片段(ssFv)、單域抗體(如來自納米抗體的VHH片段)、單鏈片段(scFv)、Fab片段、F(ab′)2片段、由Fab表達文庫產生的片段、抗獨特型抗體和表位結合片段或上述任意的組合，條件是它們保持原始的結合特性。在本發明的方法中也可以使用微型抗體和多價抗體如雙抗體、三抗體、四價抗體和肽體(peptabodies)。本發明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何類(即IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亞類。因此，本文使用的術語抗體也包括通過整個抗體的修飾或使用重組DNA方法從頭合成的抗體和抗體片段。可以通過
技術領域：
已知的任何方法制備包括本發明的抗體的一個或多個CDR或源自所述抗體的一個或多個CDR的人源化抗體。例如，可以使用四個一般步驟使單克隆抗體人源化。這些步驟是：(1)確定起始抗體輕鏈可變域和重鏈可變域的核苷酸序列和預期的氨基酸序列、(2)設計人源化抗體，即決定人源化過程中使用哪一個抗體骨架區、(3)實際的人源化方法/技術和(4)人源化抗體的轉染和表達。參見，例如美國專利號4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089；6,180,370；5,225,539；6,548,640。術語人源化抗體的意思是免疫球蛋白的骨架區的至少一部分，和任選地涉及結合的CDR區或其他區域的一部分源自或調整為人免疫球蛋白序列。例如，可以例如不按照編碼H和L鏈的小鼠和/或人基因組DNA序列或編碼H和L鏈的cDNA克隆，通過重組DNA技術制備小鼠單克隆抗體的人源化的、嵌合的或部分人源化形式的小鼠單克隆抗體。可以通過由重組DNA技術將非人抗體的CDR區連接至人恒定區來產生人源化形式的小鼠抗體(Queen等人，1989；WO90/07861)。可供選擇地，本發明的方法中使用的單克隆抗體可以是人單克隆抗體。例如，可以使用噬菌體展示方法獲得人抗體(WO91/17271；WO92/01047)。如本文使用的，人源化抗體也指非人(例如鼠科動物、駱駝、美洲駝、鯊魚)抗體的形式，其是含有源自非人免疫球蛋白的最少序列的特異性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如抗體的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其他抗原結合序列)。如本文使用的，人抗體或人源化抗體的意思是具有與由人產生的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序列的抗體和/或使用本領域已知或本文公開的任何用于制備人抗體的技術制備人抗體或人源化抗體。可以通過競爭性結合實驗或其他方式選擇具有與特定小鼠抗體相同的表位特異性的人抗體。本發明的人源化抗體驚人地在很大程度上分享了小鼠抗體有用的功能特性。也可以提供來自用免疫原性劑免疫的人血清形式的人多克隆抗體。任選地，可以通過使用淀粉樣纖維狀和/或非纖維狀多肽或其片段作為親和試劑的親和純化來濃縮這樣的多克隆抗體。單克隆抗體可以獲得自根據WO99/60846中描述的技術的血清。本發明進一步涉及如本文描述的抗體或其片段(例如可變區)在識別適用于選擇性地結合于靶標的分子或親和試劑中的用途。根據本發明的親和試劑、抗體或其片段可以是聚乙二醇化的，其中聚乙二醇化是指聚乙二醇(PEG)聚合物鏈共價連接至本發明的抗體。可以通過PEG的反應衍生物與靶標分子的溫育常規實現聚乙二醇化。對抗體的聚乙二醇化可以潛在地遮蓋試劑免遭宿主免疫系統，導致試劑的免疫原性和抗原性降低或試劑的水動力學大小增加，這可以通過減少腎清除率而延長試劑的循環時間。抗體的可變區是指單獨的抗體輕鏈的可變區或抗體重鏈的可變區，或組合。重鏈和輕鏈的可變區各自由通過三個互補決定區(CDR)(又名高變區)連接的四個骨架區(FR)組成.每條鏈的CDR通過FR很接近地保持在一起，并且與來自其他鏈的CDR共同形成抗體的抗原結合部位.存在至少兩種確定CDR的技術：(1)基于跨物種序列變異性的方法(即Kabat等人.免疫相關蛋白的序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，(第五版，1991，國立衛生研究院，馬里蘭州貝塞斯達))；以及(2)基于抗原抗體復合體的晶體學研究的方法(Al-lazikani等人.(1997)J.Molec.Biol.273：927-948)。如本文使用的，CDR可以指通過任一種方法或通過兩種方法的組合定義的CDR。在一些實施方式中，本發明提供了抗體，其包括與本發明的抗體的至少1個CDR、至少2個、至少3個或更多個CDR基本上相同的至少1個CDR、至少2個、至少3個或更多個CDR。其他實施方式包括具有與本發明的抗體或源自本發明的抗體的至少2、3、4、5或6個CDR基本上相同的至少2、3、4、5或6個CDR的抗體。在一些實施方式中，至少1、2、3、4、5或6個CDR是與發明的抗體的至少1、2或3個CDR具有至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。理解的是出于本發明的目的，普遍地保留了結合特異性和/或全部活性，雖然相比于所述抗體活性的程度可能變化(可能更大或更小).抗體的半衰期和細胞毒性潛能主要依賴于Fc域與不同Fcγ受體的相互作用。在抗體半衰期的情況下，新生的Fc受體(FcRn)起主要的作用。該受體表達于能夠吸收血清蛋白進入其再循環內體中的數種細胞類型和組織上，如單核細胞和血管內皮細胞。在某些內體中，pH降低至接近6，并且在這些條件下，抗體能夠結合于FcRn.這種相互作用保護抗體免受降解，直到所述抗體被再次釋放入生理pH破壞與受體的結合的血液中(Roopenian和Akilesh(2007)NatRevImmunol7：715-725)。在pH為6下抗體對FcRn的親和性越高，該抗體的半衰期越長。已知的用于穩定這種相互作用的Fc片段突變總結于Presta(2008，CurrOpinImmunol20：460-470)中。治療性抗體可以通過結合于它們的靶標時的數種機制起作用。結合本身可以觸發信號轉導，該信號轉導可以導致程序性細胞死亡(Chavez-Galan等人(2009)CellMolImmunol6：15-25)。它也可以通過結合于受體或配體阻斷受體與其配體的相互作用。如果對存活重要的信號受到影響，這種干擾可以導致細胞凋亡(Chiu等人(2007)Blood109：729-739)。關于細胞耗竭，存在兩個已知的主要效應機制。第一個是對靶細胞的補體依賴性的細胞毒作用(CDC)。存在三種已知的不同途徑。然而，在抗體的情況下，CDC的重要途徑是經典途徑，該途徑通過C1q結合于IgG或IgM的恒定區開始(Wang和Weiner(2008)ExpertOpinBiolTher8：759-768)。第二個機制稱為抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。該效應功能的特征在于募集表達用于抗體的各自的同種型的Fc受體的免疫細胞。ADCC主要通過激活能夠單獨或作為免疫復合體結合于IgG分子的Fcγ受體(FcγR)介導。小鼠展示三種活化的Fcγ受體(FcγRI、FcγRIII和FcγRIV)，并且人展示五種活化的Fcγ受體(FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA和FcγRIIIB)。這些受體表達于天然免疫細胞如粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和自然殺傷細胞，并且因此將天然免疫細胞與適應性免疫系統連接。根據細胞類型，在識別抗體標記的靶細胞時，存在承載FcgR的細胞的數種作用方式。粒細胞通常釋放血管活性和細胞毒性物質或化學引誘物，但是也能夠進行吞噬作用。單核細胞和巨噬細胞以吞噬作用、氧化爆發、細胞毒性或釋放促炎性細胞因子響應，而天然殺傷細胞釋放顆粒酶和穿孔素并且也可以通過靶細胞上的FAS與它們的Fas配體的相互作用觸發細胞死亡(Nimmerjahn和Ravetch(2008)NatRevImmunol8：34-47；Wang和Weiner(2008)ExpertOpinBiolTher8：759-768；Chavez-Galan等人(2009)CellMolImmunol6：15-25)。也可以通過強化Fc域與激活Fcγ受體(FcγR)的結合來改善抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。這也可以通過如Presta中總結的在Fcγ域中的突變來獲得(2008，CurrOpinImmunol20：460-470)。改變ADCC的另一種途徑是操作存在于每個IgG在Asn297處的糖部分。已知從糖分子的末端的去巖藻糖基化和去除唾液酸以增加抗體的細胞毒性潛能(Anthony和Ravetch(2010)JClinImmunol30Suppl1：S9-14)。保持本發明的所述特性的要求保護的核酸、蛋白質和抗體的序列變體，例如通過要求保護的％序列一致性定義的，也被包含在本發明的范圍內。這樣的變體顯示了可供選擇的序列，但是基本上保持相同的結合特性，如靶標特異性，因為提供的特異性序列稱為功能性類似物或為功能上類似的.序列一致性涉及當進行序列比對時相同核苷酸或氨基酸的百分比。本領域普通技術人員將領會到，由于遺傳密碼的簡并性，存在許多編碼本文描述的多肽的核苷酸序列。這些多核苷酸中的一些對任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性或序列一致性。盡管如此，本發明特別地考慮了由于密碼子使用的差異引起變化的多聚核苷酸。本發明還涵蓋落入描述的序列一致性的序列中的刪除、替換和其他改變。可通過替換發生的蛋白質序列的修飾也被包括在本發明的范圍內。如本文定義的替換是對蛋白質的氨基酸序列進行的修飾，其中一個或多個氨基酸被置換為相同數目的(不同的)氨基酸，產生含有與初級蛋白不同氨基酸序列的蛋白質，優選不顯著變更蛋白質的功能。如添加，替換可以是天然的或人工的。在本領域熟知可以在不顯著改變蛋白質的功能的情況下進行氨基酸替換。這是特別正確的，當修飾涉及“保守”氨基酸替換，其是一種氨基酸替換為另一種類似特性的氨基酸。這樣的“保守”氨基酸可以是天然氨基酸或合成氨基酸，其由于大小、電荷、極性和構象可以被替換而不顯著影響蛋白質的結構和功能。頻繁地，許多氨基酸可以被保守氨基酸替換而不有害地影響蛋白質的功能。總之，非極性氨基酸Gly、Ala、Val、Ile和Leu；非極性芳香族氨基酸Phe、Trp和Tyr；中性極性氨基酸Ser、Thr、Cys、Gln、Asn和Met；帶正電荷的氨基酸Lys、Arg和His；帶負電荷的氨基酸Asp和Glu，代表保守氨基酸的組。該清單不是窮舉。例如，熟知的是Ala、Gly、Ser和有時候Cys可以互相替換，即使它們屬于不同的組。替換變體在移除的抗體分子中具有至少一個氨基酸殘基和在其位置插入的不同的殘基。最感興趣的用于替換的突變形成位點包括高變區，但是也考慮FR的改變。如果這樣的替換導致生物學活性的改變，那么命名為下表中的“示例性替換”，或下文參考氨基酸類別進一步描述的更大的改變可以被引入并且篩選產物。潛在的氨基酸替換：原始殘基優選的保守替換示例性替換的例子Ala(A)ValVal；Leu；IleAsg(R)LysLys；Gln；AsnAsn(N)GlnGln；His；Asp、Lys；ArgAsp(D)GluGlu；AsnCys(C)SerSer；AlaGln(Q)AsnAsn、GluGlu(E)AspAsp；GlnGly(G)AlaAlaHis(H)ArgAsn；Gln；Lys；ArgIle(I)LeuLeu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸Leu(L)Ile正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；PheLys(K)ArgArg；Gln；AsnMet(M)LeuLeu；Phe；IlePhe(F)TyrLeu；Val；Ile；Ala；TyrPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)TyrTyr；PheTyr(Y)PheTrp；Phe；Thr；SerVal(V)LeuIle；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸通過選擇替換實現抗體的生物學特性的大量修飾，所述替換在它們對保持(a)替換區域的多肽骨架的結構(例如片狀或螺旋構象)，(b)分子在靶標位點的電荷或疏水性，或(c)大多數的側鏈的作用方面顯著不同。保守氨基酸替換不限于天然存在的氨基酸，還包括合成氨基酸。通常使用的合成氨基酸是為中性非極性類似物的不同鏈長的ω氨基酸和環己基丙氨酸；為中性非極性類似物的瓜氨酸和蛋氨酸亞砜，為芳香族中性類似物的苯基甘氨酸；為帶負電荷的類似物的磺基丙氨酸和為帶正電荷的氨基酸類似物的鳥氨酸。如天然存在的氨基酸，該清單不是窮舉的，而僅僅是本領域熟知的替換的示例。可以通過用包括本發明的抗體的編碼序列的表達載體轉染宿主細胞產生本發明的抗體。通過將抗體的這些編碼序列有效地與常規的能夠在宿主細胞中控制復制和表達和/或能夠從宿主細胞中分泌的調控序列組合來產生表達載體或重組質粒。調控序列包括啟動子序列例如CMV啟動子和可以源自其他已知抗體的信號序列。相似地，可以產生第二個表達載體，其具有編碼互補的抗體輕鏈或重鏈的DNA序列。在某些實施方式中，該第二個表達載體與第一個是相同的，除了在相關的編碼序列和可選擇標記的范圍內，如此以盡可能遠地確保每個多肽鏈功能性地表達。可供選擇地，抗體的重鏈和輕鏈編碼序列可以位于單個載體上。通過常規技術用第一和第二載體兩者共轉染選擇的宿主細胞(或通過單個載體簡單地轉染)以產生本發明的轉染的宿主細胞，所述宿主細胞包括重組或合成的輕鏈和重鏈兩者。然后通過常規技術培養轉染的細胞以產生本發明的工程化的抗體。通過適當的測定如ELISA或RIA從培養物中篩選包括重組重鏈和/或輕鏈兩者的組合的抗體。可以采用相似的常規技術以構建其他抗體。本領域技術人員可以選擇適用于在本發明的方法和組合物的構建中采用的克隆和亞克隆步驟的載體。例如，可以使用常規pUC系列的克隆載體。一種載體pUC19是可商購獲得的。這樣的載體的組件，例如復制子、選擇基因、增強子、啟動子、信號序列等，可以從商業或天然來源獲得，或通過已知的用于指導在選擇的宿主中的重組DNA的產物的表達和/或分泌的程序合成。出于該目的，也可以選擇其他適當的表達載體，其許多類型已知在本領域中用于哺乳動物、細菌、昆蟲、酵母和真菌表達.本發明也涵蓋用含有本發明的抗體的編碼序列的重組質粒轉染的細胞系。用于這些克隆載體的克隆和其他操作的宿主細胞也是常規的。適用于本發明的抗體的表達的宿主細胞或細胞系包括哺乳動物細胞如NS0、Sp2/0、CHO(例如DG44)、COS、HEK，成纖維細胞(例如3T3)和骨髓瘤細胞，例如在CHO或骨髓瘤細胞中表達。可以使用人細胞，因此使分子能夠被人糖基化模式修飾。可供選擇地，可以采用其他原核或真核細胞系。適合的哺乳動物宿主細胞的選擇和轉化、培養、擴增、篩選和產物生成及純化的方法在本領域是已知的。根據本發明，提供了產生本發明的與人CD269結合并中和人CD269活性的抗CD269抗體的方法，所述方法包括以下步驟：提供編碼抗體的重鏈的第一載體；提供編碼抗體的輕鏈的第二載體；用所述第一載體和第二載體轉化哺乳動物宿主細胞(例如CHO)；在引導抗體從所述宿主細胞中分泌到所述培養基中的條件下培養步驟(c)的宿主細胞；回收步驟(d)中分泌的抗體。一旦表達，可以使用本文描述的方法評估抗體的希望的結合特性。本發明涵蓋免疫綴合物(可交換地指“抗體藥物綴合物”或“ADC”)，所述免疫綴合物包括如本文描述的根據本發明的抗體，所述抗體包括但不限于綴合于一種或多種細胞毒性劑如化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素，細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性綴合物)的抗體。用于將治療劑與蛋白質尤其是抗體綴合(如本發明的抗CD269抗體藥物綴合物)的技術是熟知的(見例如，Arnon等人，″用于癌癥治療中藥物的靶向免疫的單克隆抗體(MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy)，″單克隆抗體和癌癥治療(MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy)(Reisfeld等人編，AlanR.Liss，Inc.，1985)；Hellstrom等人，″用于藥物遞送的抗體(AntibodiesForDrugDelivery)，″控制的藥物遞送(ControlledDrugDelivery)(Robinson等人編，MarcelDekker，Inc.，第二版.1987)；Thorpe，″癌癥治療中的細胞毒性劑的抗體載體(AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy：AReview)，″單克隆抗體′84：生物和臨床應用(MonoclonalAntibodies′84：BiologicalAndClinicalApplications)(Pinchera等人編，1985)；″癌癥治療中放射性標記抗體的治療性用途的分析、結果和未來展望(Analysis，Results，andFutureProspectiveoftheTherapeuticUseofRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy)，″用于癌癥檢測和治療的單克隆抗體(MonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy)(Baldwin等人編，AcademicPress，1995)；以及Thorpe等人，1982，Immunol.Rev.62：119-58。也參見，例如PCT公開WO89/12624.)典型地，ADC或ADC衍生物包括治療劑和抗CD269抗體或其衍生物之間的連接體區。如上文記載的，在典型的實施方式中，接頭在胞內條件下是可切割的，使得在胞內環境下切割接頭從抗體釋放治療劑。例如，在一些實施方式中，連接體通過存在于胞內環境的切割劑切割(例如在溶酶體或內體或小窩中)。連接體可以是例如由胞內肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶體蛋白酶或內體蛋白酶)切割的肽基接頭。在其他實施方式中，可切割連接體是pH敏感的，即對在某種pH值下的水解作用敏感。典型地，pH敏感接頭是在酸性條件下可水解的。在又一種實施方式中，接頭是在還原條件下可裂解的(例如二硫化物接頭)。各種二硫化物接頭在本領域是已知的(見例如Wawrzynczak等人，免疫綴合物中：癌癥的放射性成像和治療中的抗體綴合物(InImmunoconjugates：AntibodyConjugatesinRadioimageryandTherapyofCancer)(C.W.Vogeled.，OxfordU.Press，1987.也參見美國專利號4,880,935.)。典型地，接頭基本上對胞外環境不敏感。在其他的非互相排斥的實施方式中，接頭促進細胞內化。在某些實施方式中，當綴合于治療劑時(即在如本文描述的ADC或ADC衍生物的接頭-治療劑部分的環境中)，接頭促進細胞內化。在再一種實施方式中，當綴合于治療劑和抗CD269抗體或其衍生物時(即在如本文描述的ADC或ADC衍生物的環境中)，接頭促進細胞內化。可以與本組合物和方法使用的多種接頭描述于2003年7月31日提交的、名稱為“用于治療癌癥、自身免疫疾病或感染疾病的藥物綴合物和其用途(DrugConjugatesandTheirUseforTreatingCancer，AnAutoimmuneDiseaseoranInfectiousDisease)”的WO2004010957，以及2002年7月31日提交的、，名稱為“用于治療癌癥、自身免疫疾病或感染疾病的藥物綴合物和其用途(DrugConjugatesandTheirUseforTreatingCancer，AnAutoimmuneDiseaseoranInfectiousDisease)”的美國臨時申請號60/400,403(其公開內容通過引用并入本文中)。在某些實施方式中，免疫綴合物包括如本文描述的抗體，所述抗體包括但不限于抗體和化學治療劑或其他毒素。可以使用的酶活性毒素和其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿單孢菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒蛋白IIA鏈、α-帚曲霉素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陸(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥阜草(sapaonariaofficinalis)抑制劑、多花白樹毒蛋白、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢霉烯類(tricothecenes)。各種放射性核素可以用于放射性綴合抗體的產生。本發明的抗體或其片段也可以綴合至一種或多種毒素，所述毒素包括但不限于加利車霉素、美登木素生物堿、多拉司他汀(dolastatins)、奧羅他汀(aurostatins)、單端孢霉烯和CC1065，以及這些毒素的具有毒素活性的衍生物。適合的細胞毒性劑包括但不限于，包括多拉纈氨酸-纈氨酸-多拉異亮氨酸-多拉脯氨酸-苯丙氨酸(MMAF)和單甲基奧瑞他汀E(monomethylauristatinE)(MMAE)，以及酯形式的MMAE、DNA小溝結合劑、DNA小溝烷基化劑、烯二炔、萊克西調理素(lexitropsin)、多卡霉素、包括紫杉醇和多西紫杉醇的紫杉烷、嘌呤霉素、多拉司他汀、美登木素生物堿以及長春花生物堿。特異性細胞毒性劑包括拓撲替康、嗎啉代阿霉素、根霉素、氰基嗎啉代阿霉素，多拉司他汀-10，棘霉素，考布他汀(combretatstatin)，杯形生長抑制素(chalicheamicin)，美登素，DM-1，DM-4，紡錘菌素.其它適合的細胞毒性劑包括抗微管蛋白劑，如奧瑞他汀，長春花生物堿，鬼臼毒素，紫杉烷，漿果赤霉素衍生物，念珠藻素(cryptophysin)，美登木素生物堿，考布他汀(combretastatin)或多拉司他汀。抗微管蛋白劑包括二甲基纈氨酸-纈氨酸-多拉異亮氨酸-多拉脯氨酸-苯丙氨酸-對-亞苯基二胺(AFP)，MMAF，MMAE，奧瑞他汀E，長春新堿，長春花堿，長春地辛，長春瑞濱，VP-16，喜樹堿，紫杉醇，多西他賽，埃博霉素A，埃博霉素B，諾考達唑，秋水仙素，秋水酰胺(colcimid)，雌莫司汀，西馬多丁，圓皮海綿內酯，美登素，DM-1，DM-4或五加苷素(eleutherobin)。在一些實施方式中，免疫綴合物包括與多拉他汀或多拉司他汀肽類似物和衍生物奧瑞他汀綴合的抗體(美國專利號5,635,483；5,780,588)，多拉他汀和奧瑞他汀已經顯示干擾微管動力學、GTP水解以及核和細胞分裂(Woyke等人(2001)抗微生物劑和化學治療(Antimicrob.AgentsandChemother).45(12)：3580-3584)并具有抗癌(美國專利號5,663,149)和抗真菌活性(Pettit等人(1998)抗微生物劑和化學治療(Antimicrob.AgentsandChemother).42：2961-2965)。多拉他汀和奧瑞他汀(其是多拉他汀的五肽衍生物)藥物部分可以通過肽藥物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端連接于抗體(WO02/088172)。示例性的奧瑞他汀實施方式包括N-末端連接的單甲基奧瑞他汀藥物部分DE和DF，其公開于“能夠綴合至配體的單甲基纈氨酸化合物(MonomethylvalineCompoundsCapableofConjugationtoLigands)”，美國專利號7,498,298。如本文使用的，縮寫“MMAE”是指單甲基奧瑞他汀E。如本文使用的，縮寫“MMAF”是指多拉纈氨酸-纈氨酸-多拉異亮氨酸-多拉脯氨酸-苯丙氨酸。典型地，可以通過在兩個或更多個氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵制備基于肽的藥物部分。可以制備這樣的肽鍵，例如，根據肽化學領域熟知的液相合成方法(見Schroder和K.Lubke，″肽(ThePeptides)，″第1卷，第76-136頁，1965，學術出版社)。美登木素生物堿可以用作偶聯于根據本發明的抗體或其片段的活性劑。美登木素生物堿是有絲分裂抑制劑，其通過抑制微管蛋白聚合起作用。從東非灌木齒葉美登木(Maytenusserrata)中首次分離出美登素(美國專利號3,896,111)。隨后，發現某些微生物也可以產生美登木素生物堿，如美登醇和C-3美登醇酯(美國專利號4,151,042)。可以從由微生物如束絲放線菌屬(Actinosynnema)的發酵產生的安絲菌素前體制備高細胞毒性美登木素生物堿藥物。通過化學連接抗體至美登木素生物堿分子制備抗體-美登木素生物堿綴合物而不顯著減少抗體或美登木素生物堿分子的生物活性。見例如美國專利號5,208,020。每個抗體分子平均綴合3-4個美登木素生物堿分子，顯示了在提高靶細胞細胞毒性而不負面地影響抗體的功能或溶解性方面的有效性，雖然即使一個分子的毒素/抗體也被預期提高細胞毒性高于使用無修飾的抗體。美登木素生物堿在本領域是熟知的，并且可以通過已知的技術合成或從天然來源分離。選擇的抗生素的加利車霉素家族的例子可以用作偶聯于根據本發明的抗體或其片段的活性劑.抗生素的加利車霉素家族能夠在亞皮摩爾濃度下產生雙鏈DNA破壞。對加利車霉素家族的綴合物的制備，見美國專利號5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296。另一種可以綴合抗體的抗腫瘤藥物是抗葉酸劑QFA。加利車霉素和QFA兩者都具有胞內作用部位，并且不容易穿過質膜。因此，這些藥劑通過抗體介導的內化的細胞攝取大大提高了它們的細胞毒性作用。其他可以綴合于抗體的抗腫瘤劑包括BCNU、鏈脲霉素(streptozoicin)、長春新堿和5-氟尿嘧啶，在美國專利號5,053,394、5,770,710中描述的統稱為LL-E33288復合物的藥劑家族，以及埃斯培拉霉素(esperamicins)(美國專利號5,877,296)。本發明進一步考慮在抗體和具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內切酶如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成免疫綴合物。對于選擇性破壞腫瘤，抗體可以包括高放射性的原子。從本發明的意義上來說，藥學上可接受的載體可以是在有害意義上不顯著干擾本發明的抗體的生物活性的有效性的任何非毒性物質。顯然，載體的特征會依賴于給藥的途徑。這樣的組合物可包含除了活性物質和載體之外，在本領域熟知的稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩定劑、增溶劑和其他物質。藥學上可接受的賦形劑和載體溶液的制劑對本領域技術人員來說是熟知的，如同在多種治療方案例如口服、非胃腸、靜脈內、鼻內和肌內給藥和制劑中，用于使用本文描述的具體的組合物的適當的給藥和治療方案的發展。含有活性成分(抗體或抗體片段)的藥物，或者稱為藥物組合物可以是適用于口服的形式，例如片劑、錠劑(troche)、糖錠(lozenge)、水性或油性懸浮液、可分散粉末或顆粒、乳劑、硬或軟膠囊、或糖漿劑或酏劑。可以根據制造藥用組合物領域已知的任何方法制備用于口服使用的組合物，并且這樣的組合物可以含有一種或多種選自由以下組成的組的藥劑：甜味劑、調味劑、著色劑和防腐劑以提供藥學上美觀并可口的制劑.片劑含有與適用于制造片劑的非毒性藥學上可接受的賦形劑混合的活性成分。這些賦形劑可以是例如，惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；制粒劑和崩解劑，例如玉米淀粉或海藻酸；結合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯樹膠，以及潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可以是無包衣的或它們可以通過已知的技術包衣以延遲在胃腸道中的分解和吸收，從而在更長的一段時間內提供持續的作用。例如可以采用延時物質如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它們也可以被包衣。本發明也指用于局部施用、口服、吸入或皮膚、皮下或靜脈內注射的藥用組合物。技術人員知道用于具體的施用形式需要的載體和添加劑。當通過靜脈內注射、皮膚注射或皮下注射施用治療有效量的本發明的活性物質(抗體或抗體片段)時，活性物質可以是無熱原的、非胃腸可接受的水溶液的形式。本發明還涉及在治療具有如本文公開的醫學紊亂的受試者中施用治療相關量的本文描述的抗體。如本文使用的，術語“治療有效量”的意思是足以顯示有意義的患者利益的藥物組合物或方法的每種活性組分的總量。本發明的藥物組合物中的活性物質的量取決于要治療的病癥的性質和嚴重性，以及患者已接受的在先治療的性質。可以施用更大劑量直到患者獲得了最優的治療效果，并且在該點，不再進一步增加劑量。這樣的非胃腸可接受的溶液的制備應該注意pH、等滲性和穩定性等，該制備在本領域的技術內。用于靜脈內、皮膚或皮下注射的優選的藥物組合物除了活性物質外，還應該含有等張溶媒，如氯化鈉注射液，林格氏注射液，葡萄糖注射液，葡萄糖和氯化鈉注射液，乳酸林格氏注射液或本領域已知的其他溶媒。本發明的藥物組合物也含有穩定劑、防腐劑、緩沖劑、抗氧化劑或本領域技術人員已知的其它添加劑。施用的抗體的劑量顯然取決于本領域熟知的許多因素，例如抗體的化學性質和藥物制劑，和患者的體重、體表、年齡和性別，以及施用的時間和途徑。對于成人，劑量示例性地可以為每天0.001μg至1g，優選為每天0.1μg至100mg，更優選為每天1μg至100mg，甚至更優選為每天5μg至10mg。在連續輸注中，劑量示例性地為每分鐘每千克體重0.01μg至100mg，優選為1μg至10mg。在本發明的另一方面，提供了如本文描述的根據本發明的抗體用于治療選自以下的B細胞介導的或漿細胞介導的疾病或抗體介導的疾病或紊亂：多發性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、非分泌型多發性骨髓瘤、冒煙型多發性骨髓瘤、意義未定的單克隆丙種球蛋白病(MGUS)、孤立性漿細胞瘤(骨、髓外的)、淋巴漿細胞淋巴瘤(LPL)、原發性巨球蛋白血癥(Waldenstrom′sMacroglobulinemia)、漿細胞白血病、原發性淀粉樣變性(AL)、重鏈疾病、系統性紅斑狼瘡(SLE)、POEMS綜合征/骨硬化性骨髓瘤、I型和II冷球蛋白血癥、輕鏈沉積病、肺出血腎炎綜合征(Goodpasture′ssyndrome)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、急性腎小球腎炎、天皰瘡和類天皰瘡癥紊亂以及獲得性大皰性表皮松解(Epidermolysisbullosaacquisita)；或任何具有BCMA表達的非霍奇金淋巴瘤B細胞白血病或霍奇金淋巴瘤(HL)，或患者產生對重組蛋白替代療法的中和抗體的任何疾病，其中所述方法包括向所述患者施用治療有效量的本文描述的抗體的步驟。可以將B細胞紊亂分為B細胞發育/免疫球蛋白產生的缺陷(免疫缺陷)和過度的/不受控制的增殖(淋巴瘤、白血病)。如本文使用的，B細胞紊亂是指兩種類型的疾病，并且提供了用抗體治療B細胞紊亂的方法。在本發明的一個方面，疾病是多發性骨髓瘤還提供了如本文描述的抗體在制造用于治療如本文描述的疾病和紊亂的藥物中的用途.例如在本發明的一個方面，提供了如本文描述的抗體用于治療或預防響應于BCMA和配體BAFF和APRIL之間的相互作用的調節(如抑制或阻斷)的疾病和紊亂的用途。在本發明的一種實施方式中，分離的抗體或抗體片段用于治療B淋巴細胞癌癥，例如霍奇金淋巴瘤.在本發明的一種實施方式中，分離的抗體或抗體片段用于治療自身免疫疾病，如與炎癥相關的醫學紊亂，優選具有炎性組分的自身免疫疾病，其中自身免疫疾病選自大動脈炎、巨細胞動脈炎、家族性地中海熱、川崎病、結節性多動脈炎、皮膚結節性多動脈炎、肝炎相關的動脈炎、白塞氏綜合征、韋格納肉芽腫病、ANCA-血管炎(ANCA-vasculitidies)、許爾-斯特勞斯綜合征(Churg-Strausssyndrome)、顯微鏡下多血管炎、結締組織疾病血管炎、紫癜、冷球蛋白血癥血管炎、皮膚白細胞碎裂性脈管炎、熱帶主動脈炎、肉樣瘤病、科根綜合征、威斯科特-奧爾德里奇綜合征(Wiskott-AldrichSyndrome)、麻風結節性動脈炎、CNS的原發性血管炎、血栓閉塞性脈管炎、副腫瘤血管炎(Paraneoplasticateritis)、蕁麻疹、Dego病、骨髓增生異常綜合征、持久性隆起紅斑、高免疫球蛋白D、過敏性鼻炎、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、牙周炎、類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化、淀粉樣變性、克羅恩病(MorbusChron)、潰瘍性結腸炎、自身免疫性肌炎、糖尿病、多發性硬化癥、格林巴利綜合征(Guillain-BarreSyndrome)、組織細胞增生癥、骨關節炎、過敏性皮炎、牙周炎、慢性鼻竇炎、牛皮癬、牛皮癬關節炎、顯微鏡下結腸炎、肺纖維化、腎小球腎炎、惠普爾氏病(Whipple′sdisease)、斯蒂爾病(Still′sdisease)、結節性紅斑、耳炎、冷球蛋白血癥、干燥綜合征(Sjogren′ssyndrome)、紅斑狼瘡、再生障礙性貧血、骨髓纖維瘤、慢性炎癥性脫髓鞘性多發性神經病、木村病、系統性硬化癥、慢性主動脈周圍炎、慢性前列腺炎、特發性肺纖維化、慢性肉芽腫病、特發性賁門失弛緩癥、博萊霉素誘導的肺部炎癥、阿糖胞苷誘導的肺部炎癥、自身免疫性血小板減少癥(Autoimmunthrombocytopenia)、自身免疫性中性粒細胞減少癥(Autoimmunneutropenia)、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性淋巴細胞減少癥、恰加斯氏病(Chagas′disease)、慢性自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性肝炎、橋本氏甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎(atropicthyroiditis)、甲狀腺機能亢進(Gravesdisase)、自身免疫性多腺性綜合征、自身免疫性艾迪生綜合征(AutoimmuneAddisonSyndrome)、尋常型天皰瘡、落葉型天皰瘡、皰疹樣皮炎、自身免疫性脫發、白癜風、抗磷脂綜合征、重癥肌無力、僵人綜合征、古德帕斯徹綜合征(Goodpasture’ssyndrome)、交感性眼炎、毛囊炎、夏普綜合征(Sharpsyndrome)和/或伊文思綜合征(Evanssyndrome)，特別是枯草熱、牙周炎、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎，優選是類風濕性關節炎或多發性硬化癥。序列本發明的優選的抗體序列：優選的核苷酸序列屬于CD269(BCMA)的本發明的優選的序列：包括人源化序列修飾的優選的廣義氨基酸序列：附圖說明通過以本文公開的實施例和附圖的示例性方式說明本發明。本文提供的附圖代表本發明的具體的實施方式，并且不意圖限制本發明的范圍。附圖被認為提供了增強一個或多個非限制性實施方式的技術支撐的可能和潛在優選實施方式的進一步描述。附圖簡述：圖1：J22.9-xi的體外表征。圖2：CD269(BCMA)的結構和J22.9-xiFab：CD269復合體。圖3：J22.9-xi的體外細胞毒性。圖4：在異種移植NSG小鼠中J22.9-xi的效果。圖5：建立的腫瘤的治療。圖6：疾病早期的腫瘤治療.圖7：雜交瘤J22.9的不穩定性。圖8：與J22.9-xi比較的HC的人源化序列的序列。圖9：與J22.9-xi比較的LC的人源化序列的序列。圖10：J22.9-xi的序列優化變體在ELISA中顯示相似的結合。圖11：J22.9-xi的序列優化變體在流式細胞術中顯示相似的結合。圖12：SPR原始數據。圖13：抗體變體的凝膠電泳.附圖的詳細描述：圖1：J22.9-xi的體外表征。以ELISA(a)或通過使用CD269陽性的MM.1S細胞的流式細胞術(b)，J22.9-xi與BCMA濃度依賴性結合。(c)采用指示濃度的BCMA，通過表面等離子體共振測量確定J22.9-xi與BCMA的結合親和性。(d)J22.9-xi阻斷BAFF和吸附于微量滴定板上的BCMA之間的相互作用。圖2：(a)CD269(BCMA)識別表面。顯示BAFF/APRIL與J22.9-xi的結合表位殘基的CD269(BCMA)胞外域的三個視圖。上部圖中，CD269(BCMA)的結合表面的直接視圖：淺灰色暗影表明如從它們的晶體結構辨別的包括BAFF和APRIL的結合表位的所有殘基，黑色殘基(顯示為球體)不接觸任一個BAFF、APRIL或J22.9-xi；涉及J22.9-xi結合的表位殘基的亞群以表面表示法顯示；以球體顯示的剩余的淺灰色殘基是BAFF和APRIL兩個表位的部分但不與J22.9-xi直接接觸。中間和下面的圖以與上面的圖相同的表示法顯示，但是分別朝向并遠離觀察者旋轉90°。(b)J22.9-xiFab：CD269復合體的兩個視圖。J22.9-xi以表面表示法，重鏈為淺灰色和輕鏈為暗灰色顯示。CD269(BCMA)以結合于J22.9-xi抗原穴區的帶狀表示法顯示。在左側為Fab：CD269復合體的全視圖；在右側為斜向觀察者以顯示結合穴的復合體。圖3：J22.9-xi的體外細胞毒性。(a)以效應物與靶標的比為20∶1的比使CD269陽性的MM.1S-Luc細胞與人PBMC混合，與指示濃度的J22.9-xi溫育4小時。打開符號表明無-N-聚糖的J22.9-xi與來自供體1和供體2的PBMC孵育時的細胞毒性活性。誤差線表明SEM.(b)去糖基化不影響J22.9-xi與MM.1S細胞的結合。(c)J22.9-xi在4℃或-80℃下儲存3周不影響細胞毒性。圖4：在異種移植NSG小鼠中J22.9-xi的效果。(a)每周兩次施用200μgJ22.9-xi或對照抗體小鼠以及未處理的對照小鼠隨時間的腫瘤發展。(b)在第6至41天之間總的腫瘤負荷((a)的曲線下面積(AUC))。繪制的為平均值與SEM(**P＜0.01，***P＜0.001，t-檢驗)。(c)J22.9-xi和同種型對照小鼠的總存活率。使用對數秩(Mantel-Cox)檢驗計算P值。(d-1)在指示的沒有施用治療性抗體的組中MM.1S-Luc細胞的檢測。在最右側圖像下方，數字(41、41、44、40)表明特定的小鼠死亡時注射腫瘤細胞后的天數。(d-2)在第21和28天在指示的組中MM.1S-Luc細胞的檢測。背面觀。(e)J22.9-xi濃度和腫瘤發展之間的關系。(f)在第6至42天之間的總腫瘤負荷((e)的AUC)。平均值與SEM(**P＜0.01，***P＜0.001，t-檢驗)。(g)實驗時間線的概覽。圖5：建立的腫瘤的治療。(a)每周兩次施用200μgJ22.9-xi或對照抗體的小鼠以及未處理的對照小鼠隨時間的腫瘤發展。(b)在第8至48天之間總的腫瘤負荷((a)的AUC).繪制的為平均值與SEM(**P＜0.01，***P＜0.001，t-檢驗)。(c)J22.9-xi和同種型對照小鼠的總存活率。使用對數秩(Mantel-Cox)檢驗計算P值。在圖5d中提供實驗時間線的概覽。圖6：疾病早期的腫瘤治療。(a)當用2μg、20μg或200μgJ22.9-xi，或200μg同種型對照抗體或無N-聚糖的J22.9-xi處理時的腫瘤生長過程，以及無腫瘤的腫瘤生長過程。(b)在第9至44天內總的腫瘤負荷((a)的AUC)。顯示的是平均值與SEM(**P＜0.01，***P＜0.001，t-檢驗)。(c)抗體處理的小鼠和對照異種移植SCID-Beige小鼠的存活率。使用對數秩(Mantel-Cox)檢驗計算P值。在圖6d中提供實驗時間線的概覽。圖7：雜交瘤J22.9的不穩定性。在第1天在BCMA涂覆的微量滴定板上的ELISA中測試的雜交瘤J22.9的上清為與BCMA結合呈陽性。在指示的時間點的后續分析揭示上清的結合能力的減少。在第7、14和21天更換培養基。圖8：與J22.9-xi比較的人源化抗體序列的總結。使用標準比對軟件進行序列的比較。圖9：與J22.9-xi比較的人源化抗體序列的總結。使用標準比對軟件進行序列的比較。圖10：通過使用人BCMA(hBCMA)或獼猴BCMA(cyBCMA)涂覆的微量滴定板測試嵌合J22.9-xi和人源化變體的結合(J22.9-H對應于人源化序列SEQIDNo.27；J22.9-FSY對應于人源化和PTM修飾的SEQIDNo.28；J22.9-ISY對應于人源化和PTM修飾的SEQIDNo.29)。圖11：通過使用人MM細胞系RPMI-8226的流式細胞術測試嵌合J22.9-xi和人源化變體的結合(J22.9-FSY對應于人源化和PTM修飾的SEQIDNo.28；J22.9-ISY對應于人源化和PTM修飾的SEQIDNo.29)。圖12：SPR原始數據：通過表面等離子體共振(SPR)譜法測量嵌合J22.9-xi和人源化變體與人BCMA(圖12A)和獼猴BCMA(圖12B)的結合親和性。通過胺化學法將IgG固定于ProteonGLH傳感器芯片，并在流動相用BCMA測量結合.在圖中原始數據的順序跟對應于圖的說明中列出的樣品的順序。圖13：抗體變體的凝膠電泳。抗體變體在非還原性SDS-PAGE中電泳跑樣(run)，并且將抗體變體著色以顯示蛋白遷移。實施例通過本文公開的實施例的方式證明本發明.本文提供的實施例僅代表本發明的具體實施方式，并且不意圖限制本發明的范圍。實施例被認為提供增強一個或多個非限制性實施方式的技術支撐的可能和潛在的優選實施方式的進一步描述。雖然關于抗體-表位復合體的結晶及體內和體外抗腫瘤作用的實施例使用原始的嵌合抗體J22.9-xi進行，但是發明人聲稱在本發明的人源化變體中保持了這些技術效果，由于與測試的原始嵌合抗體相比在人源化變體中保持了結合特征。因此提供的來自嵌合抗體的數據作為要求保護的人變體的工業適用性和有用性的參考材料和指示提供。初始的生物數據表明J22.9-xi和人源化變體之間的相當的作用。J22.9-xi和BCMA相互作用的結合和阻斷特征新的嵌合抗體(J22.9-xi)結合于人CD269(BCMA、TNFRSF17)的胞外域。這最初通過基于人多發性骨髓瘤細胞系MM.1S的ELISA和流式細胞術確定(圖1a，b)。使用表面等離子體共振(SPR)確定J22.9-xi與BCMA的親和性。如圖1c顯示的平均Kd為54pM。已知BCMA在體內通過與其配體BAFF和/或APRIL的相互作用觸發對多發性骨髓瘤和漿細胞的存活重要的信號(MackayF等人(2003)AnnuRevImmunol21：231-264)。因此用人BCMA的胞外域和重組BAFF進行體外阻斷測定。J22.9-xi與BCMA的結合明顯地阻斷受體和其配體BAFF之間的相互作用。使用同種型對照抗體代替J22.9-xi，重組BAFF與BCMA的結合不受影響(圖1d)。J22.9-xi-Fab-BCMA復合體的晶體結構揭示與BCMA的廣泛結合界面由J22.9-xi制備的Fab片段在與純化的46個氨基酸殘基的BCMA胞外域的復合體中結晶，并且復合體結構以1.9埃的解析度解出。對BCMA的第6至41個殘基可觀察到高質量的電子密度，顯示與J22.9-xi，主要是與抗體的輕鏈的廣泛相互作用(圖2B)。該隱藏740.4平方埃并涉及三分之一BCMA殘基的界面覆蓋了在與APRIL和sTALL1(也稱為BAFF)的BMCA復合體的晶體結構中觀察到的相同表位的16個殘基中的12個殘基，包括保守的DxL基序(GordonNC等人(2003)，BAFF/BlysS受體3包括編碼高度集中的配體結合位點的最小TNF受體樣組件(BAFF/BlysSreceptor3comprisesaminimalTNFreceptor-likemodulethatencodesahighlyfocusedligand-bindingsite).Biochemistry42(20)：5977-83以及PatelDR等人(2004)，工程化APRIL特異的B細胞成熟抗原(EngineeringanAPRIL-specificBCellMaturationAntigen).JBC279(16)：16727-35)，提供在與BAFF的體外測定中所見的阻斷作用的清晰合理化(圖2A)。與J22.9-xi的相互作用另外包括與BCMA中的Ala20和Pro23接觸的直接側鏈，不是被BAFF和APRIL覆蓋的結合表位部分的殘基，以及數個水介導的氫鍵。在所有三種結構中BCMA的總體構象是非常相似的，在J22.9-xi和APRIL復合體之間的1.4埃以及J22.9-xi和sTALL1復合體之間的1.5埃的C-αrmsd；J22.9-xiBCMA結合表位(第13至30個殘基)的各自的C-αrmsd為0.98和0.88埃。雖然認識到相同的BCMA表位在其核心具有DxL基序，但是J22.9-xi的結合位點非常不同于sTALL1和APRIL的結合位點，如同包括界面的相互作用的結合一樣。如可以從圖2B和表1和表2中所見，來自J22.9-xi的19個氨基酸(6個來自重鏈(表1)，13個來自輕鏈(表2))形成了與來自CD269的胞外域的12個殘基的直接連接。______________________________________________________表1：J22.9-xi的重鏈和BCMA之間的氨基酸相互作用的列表。使用軟件PDBsum生成這些相互作用列表(LaskowskiRA(2009))。_____________________________________________________表2：J22.9-xi的輕鏈和BCMA之間的氨基酸相互作用的列表。使用軟件PDBsum生成這些相互作用列表(LaskowskiRA(2009))。______________________________________________________表3：涉及CD269：APRIL和CD269：BAFF結合的殘基的相互作用列表(通過J22.9不直接接觸的殘基是下劃線的)。使用軟件PDBsum生成這些相互作用列表(LaskowskiRA(2009)).______________________________________________________表4：通過J22.9、APRIL和/或BAFF的直接接觸結合的CD269靶標的殘基。僅通過J22.9直接接觸的CD269靶標的殘基是下劃線的(20、23)。通過J22.9不直接接觸的CD269靶標的殘基是粗體的(對于APRIL為30、31、33、34、35；對于BAFF為25、29、30、31、34、35)。______________________________________________________表5：J22.9水相互作用(J22.9-xi：H2O：CD269)。使用軟件LigPlot(Wallace和Laskowski，歐洲生物信息學研究所)生成表5中的數據(sc＝側鏈H鍵；mc＝主鏈H鍵)在去糖基化后J22.9-xi的強烈細胞毒性功效強烈降低使用轉導熒光素酶的MM.1S-Luc細胞系建立基于熒光素酶的細胞毒性測定。在該測定中，因為由培養基中缺乏ATP而使死細胞釋放的熒光素酶不能發揮作用，因此僅從活細胞中檢測到生物發光。分離來自健康供體的PBMC并與MM.1S-Luc細胞以20∶1的比混合。4小時后測量生物發光。在選擇4個未刺激的供體的PBMC制劑下，確定J22.9-xi的體外細胞毒性。細胞毒性潛能在來自不同供體的PBMC之間輕微地變化。在溫育的4小時內，細胞裂解在J22.9-xi濃度為125ng/ml下達到18至35％。將J22.9-xi濃度增加至1μg/ml增加細胞裂解高達56％(圖3a)。在J22.9-xi用PNGaseF去糖基化后(J22.9-xi-N-聚糖)，細胞毒性活性下跌到低于8％，而J22.9-xi-N-聚糖與BCMA陽性MM.1S細胞的結合保持不變(圖3a，b)。J22.9-xi減少在異種移植小鼠中的腫瘤負荷并延長存活期我們使用NODscid常見γ鏈敲除(NSG)缺少功能性B、T和NK細胞群的小鼠。這些用1×107個MM.1S-Luc細胞靜脈內注射的小鼠在6周內發展出后肢癱瘓(圖4d-1)。第一個癥狀出現的日期定義處死日期。在尾動脈中注射1×107個MM.1S-Luc后，將小鼠隨機分至3個組中。第一組(n＝2)不接受處理直到實驗結束，而第二組(n＝5)和第三組(n＝6)分別接受每周兩次注射200μg同種型對照或J22.9-xi抗體。從腫瘤細胞注射的日期開始腹腔內(i.p.)施用抗體6周的時間。每周一次使用IVIS譜監測腫瘤生長。在腹腔內注射熒光素后3分鐘測量生物發光。從未處理組和接受對照抗體的組中都能發現腫瘤發展的相似過程，而從第6天的第一次測量點已經開始的，用J22.9-xi處理的組顯示了顯著更低的腫瘤負荷(圖4a)。另外，該組顯示了在整個監測期期間更小的總體腫瘤荷載(圖4b)。同種型對照處理的動物在注射細胞后具有46天的中位存活期。接受J22.9-xi的小鼠平均多存活了26天。這對應于與接受了對照抗體的小鼠比較，55％的擴大的存活率(圖4c)。在細胞注射后第28天，在未處理的小鼠和接受同種型對照抗體的小鼠中看到腫瘤細胞大量浸潤至脊柱和腹股溝淋巴結內(圖4d-2)。將200μg抗體施用于小鼠對應于大約10mg/kg體重。為檢測J22.9-xi在更低劑量下的功效，我們將MM.1S-Luc異種移植的小鼠分為4組。第一組(n＝7)每周兩次接受200μg對照抗體，第二組、第三組(每組n＝3)和第四組(n＝9)分別每周兩次注射2μg、20μg或200μg。如上文描述進行注射和監測。雖然在對照組小鼠中腫瘤如預計發展，但在接受20μg或200μgJ22.9-xi的組中觀察到腫瘤生長被顯著地限制(圖4e，f)。在圖4g中提供了實驗時間線的概覽。在J22.9-xi治療期間建立的腫瘤的生長停止5周通過將抗體處理的開始推遲至注射腫瘤細胞后5天模仿治療性施用。將異種移植小鼠分成兩組(n＝6).動物接受每周兩次每次注射200μg同種型對照或J22.9-xi抗體。在細胞注射后第8天完成第一次處理。雖然至第35天在接受J22.9-xi的組(n＝5)中不存在可測量的源自腫瘤的生物發光，但在接受同種型對照抗體的動物(n＝6)中觀察到腫瘤荷載的穩定增長(圖5a，b)。來自同種型對照組的小鼠在細胞注射后平均存活56天，而接受J22.9-xi的所有小鼠在第77天時仍然活著(圖5c)。在圖5d中提供了實驗時間線的概覽。用J22.9-xi加強早期治療防止腫瘤生長7周為進一步評估治療時機對腫瘤生長的作用，從腫瘤細胞注射日開始在連續5天內施用了不同的抗體。在靜脈內注射細胞之后，將動物隨機分為5組。第一組(n＝5)用200μg同種型對照抗體/注射(腹腔注射)處理，而第二組(n＝6)接受200μg/注射J22.9-xi-N＝聚糖抗體。第三組(n＝4)、第四組(n＝5)和第五組(n＝5)的小鼠分別獲得200μg、20μg和2μg/注射J22.9-xi抗體。生物發光測量在細胞注射后第9天開始。至第44天，在任何接受了完整J22.9-xi抗體的組中沒有看到源自腫瘤的生物發光。雖然在用J22.9-xi-N-聚糖處理的動物中腫瘤生長是減速的，但是總體腫瘤荷載與接受同種型對照抗體的那些動物沒有顯著區別(圖6a，b)。雖然用J22.9-xi-N-聚糖(去糖基化的)處理的動物的總體腫瘤荷載沒有顯著不同(圖6b)，但是與isoAb處理組相比這些小鼠的壽命大幅增加(圖6c).因為J22.9-xi-N-聚糖顯示不能誘導ADCC或CDC，該結果表明單獨的J22.9-xi與BCMA的結合阻礙腫瘤生長。可以合理地認為，這是因為阻斷了受體和它的天然配體(APRIL和BAFF)之間的相互作用。在圖6d中提供了實驗時間線的概覽。J22.9-xi的人源化J22.9-xi抗體是基于序列比對和從晶體結構獲得的數據人源化的。使用IgBLAST(NCBI)或Clustal(EBI)將可變區序列與它們各自的人同源物比對。在變更前通過目測結構評價每個提出的突變。人源化變體與BCMA靶標的結合使用流式細胞術、ELISA和SPR測試突變體與BCMA的結合。使用表面等離子體共振(ProteOnTMXPR36；Bio-Rad)測量人源化抗體的親和性。結合數據顯示關于人源化抗體變體與如測試的J22.9-xi結合的相同表位的特異性和親和性的驚人的結果。如在下表中顯示，完全驚人的是，如本文描述的人源化抗體展示與原始嵌合抗體的相當的結合特征。SPR數據揭示人源化變體的親和性與嵌合體的親和性相似，并且足以根據本文提供的原始嵌合抗體的數據假設它們的臨床相關性。技術人員不會預料到通過在嵌合體的人源化期間修飾CDR，維持結合特征至這樣的程度。如本文描述的使用BCMA涂覆的微量滴定板(1μg/ml)進行ELISA。如圖10中觀察到的，所有人源化變體與J22.9-xi相比，使用人和獼猴BCMA的結合是相當的。也使用本文描述的人源化變體進行了流式細胞術，并顯示了所有人源化變體與人和獼猴BCMA兩者的等價結合(參考圖11)還進行了SPR分析，并且測量人源化抗體變體的親和性。如在下表(表6)中可以觀察到的，人源化變體的親和性(J22.9-H對應于人源化序列SEQIDNo.27；J22.9-FSY對應于人源化和PTM修飾的SEQIDNo.28；J22.9-ISY對應于人源化和PTM修飾的SEQIDNo.29).表6.SPR數據J22.9重鏈的CDR2中的第54位氨基酸：為了移除人源化J22.9中潛在的翻譯后修飾位點，將重鏈CDR2的殘基D54突變為天冬酰胺(N)，無意間產生了用于N-連接糖基化的新的潛在修飾位點。含有N54的突變的重鏈在SDS凝膠上遷移更慢(圖13)，指示更大的尺寸，并且CDR被糖基化。然而相應的IgG、J22.9-FNY在FACS和ELISA中結合BCMA，并且在與BCMA的復合體中結晶。雖然不完全精確，但是2.7埃解析度的結構顯示從N54側鏈延伸的清晰的電子密度-與殘基的糖修飾一致。驚人的是，側鏈這樣大的延伸不會破壞與BCMA的結合，并且從這些觀察結果中可以預期在這個位置可以容忍多個和不同的氨基酸替換，潛在地還有除了糖之外的衍生化。方法細胞系和培養人多發性骨髓瘤細胞系MM.1S(Greenstein等人(2003)ExpHematol31：271-282)獲得自Prof.B.(MDC，柏林，德國)。為了在體內監測腫瘤細胞生長，將熒光素酶和GFP克隆至慢病毒載體系統ViraPower(Invitrogen)的pFU載體內。通過轉導細胞的GFP表達，使用熒光激活的單個細胞分選分離單克隆細胞系。在不含酚紅，含有10％胎牛血清、100單位/ml的青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640中培養細胞系(均來自PAA)。購自加拿大國立研究委員會的HEK293-6E細胞保持于補充7.5mML-谷氨酰胺(PAA)、0.1％普朗尼克F-68(Invitrogen)和25μg/mlG418(Invitrogen)的FreestyleF17培養基(Invitrogen)中。細胞在5％CO2氣氛中在110rpm和37℃下生長于錐形燒瓶(Corning)中。抗體產生和純化為了獲得結合BCMA的抗體，使用標準雜交瘤技術。用不完全弗氏佐劑和30μgC末端融合至谷胱甘肽S-轉移酶(GST)的人BCMA的胞外域免疫4只BL/6野生型小鼠6次。在細胞融合后，接下來的篩選時段，J22.9雜交瘤顯示分泌抗BCMA抗體。由于雜交瘤的不穩定性，分別擴增雜交瘤J22.9的輕鏈和重鏈的可變區并克隆在人κ或IgG1恒定域基因上游。通過用1∶2分別編碼輕鏈和重鏈的DNA質粒混合物瞬時共轉染293-6E細胞產生嵌合J22.9-xi抗體。簡言之：將293-6E細胞在無血清的FreestyleF17培養基中重懸為1.7×106個細胞/ml，并使用聚乙烯亞胺以終濃度1μg/ml培養基轉染。在轉染后第2天，向細胞供給含有1％胰蛋白胨N1(OrganoTechnie)的100％轉染體積的FreestyleF17。在第7天，通過離心收獲細胞，使過濾(0.45μm)的培養基穿過3.5ml蛋白質A瓊脂糖柱(Bio-Rad)。用10ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌柱，并通過添加pH3.5的20mM乙酸鈉，150mMNaCl洗脫抗體。直接收集2ml的級分于含有pH7.5的100μl1MHEPES的管中以中和。全長IgG的最終產量接近40mg/l培養基因為雜交瘤J22.9喪失了產生/分泌抗BCMA抗體的能力(圖8)，因此使用PCR擴增重鏈和輕鏈的可變區，然后分別克隆在人恒定IgG1和K輕鏈基因的5’末端。通過用這兩種質粒共轉染293-6E細胞，產生嵌合J22.9-xi抗體。本發明的抗體的產生因此是內在地困難的，并且不能通過直接的常規方法實現。與J22.9-xi平行地產生由J22.9-xi重鏈和隨機的嵌合κ輕鏈組成的同種型對照抗體。通過ELISA和流式細胞術顯示這種抗體不能結合于BCMA。使用N-糖苷酶F(PNGaseF)(NEB)酶促地移除在J22.9-xi重鏈的Asn297處的N-連接的寡糖鏈。將10mgJ22.9-xi與在500μlPBS(pH7.4)中的15,000單位PNGaseF在37℃下溫育36小時，然后將緩沖液更換為無菌PBS。通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)確定J22.9-xi的結合和阻斷能力用10μg/ml人BCMA的胞外域涂覆微量滴定板。用連續稀釋的1至1000ng范圍的J22.9-xi和同種型對照檢測涂覆的BCMA。用辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗人二抗(JacksonImmunoResearch，109-035-098，1∶5,000稀釋)檢測J22.9-xi或同種型對照抗體與涂覆的BCMA的結合。用1μg/ml人或獼猴BCMA(分別為hBCMA或cyBCMA)的胞外域涂覆微量滴定板。用連續稀釋的0.26pM至500nM范圍的J22.9-xi、J22.9-H、J22.9-ISY和J22.9-FSY檢測涂覆的BCMA。用辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗人二抗(JacksonImmunoResearch，109-035-098，1∶5,000稀釋)檢測抗體與涂覆的BCMA的結合對于阻斷實驗，在抗體和洗滌之后應用1mg/ml融合于His標簽(Biomol)的人重組BAFF，并使用小鼠抗His標簽(AbDSerotec，AD1.1.10，1∶5,000稀釋，HRP綴合的)抗體檢測。使用BDOptEIA試劑A和B(BDBioscience)對所有ELISA進行顯色，并用微孔板分光光度計(BioTek)在450nm和570nm處測量。流式細胞術分析對于細胞表面抗原檢測實驗，使用自制的抗體(J22.9-xi、J22.9-H、J22.9-ISY、J22.9-FSY和同種型對照)以及商業可獲得的小鼠抗His標簽(AbDSerotec，AD1.1.10，1∶100稀釋，AlexaFluor488綴合的)和山羊抗人IgG1(JacksonImmunoResearch，109-116-098，1∶400，PE綴合的)抗體以及融合于His標簽(Biomol)的人重組BAFF。在FACSCalibur或FACSCantoII流式細胞儀(BDBioscience)上進行實驗。使用Flowjo軟件第7.6版(TreeStarInc.)分析數據。Fab和Fab：BCMA復合體的產生通過與胃蛋白酶溫育從全長J22.9-xiIgG產生(Fab)2片段。將J22.9-xi通過PD-10緩沖交換柱進入pH3.5的50mM乙酸鈉，并且胃蛋白酶以30μg每毫克J22.9-xi添加。在37℃下溫育2.5小時足夠完全消化可結晶片段(Fc)區，并且通過使胃蛋白酶在PD-10柱上交換至PBS(pH7.2)失活。在5mM乙二胺四乙酸(EDTA)的存在下通過添加2-巰基乙胺(50mM)實現(Fab)2片段還原為單獨的Fab。在37℃下溫育90分鐘，通過用500μM碘乙酰胺烷基化30分鐘，然后緩沖液交換為新鮮PBS來阻斷還原的半胱氨酸。使Fab片段與1.5摩爾當量的純化的BCMA組合，并且通過在Superdex7516/60柱上的體積排阻色譜分離復合體。在4至12％SDS聚丙烯酰胺凝膠上分析級分，將含有Fab和BCMA兩者的級分合并并濃縮用于結晶試驗。Fab：BCMA復合體的結晶向濃縮的復合體補加0.5摩爾當量的純BCMA以確保飽和，并使濃縮的復合體經受結晶篩選。由商業篩選(Qiagen)使用Gryphon移液機器人(200nl滴)在96孔坐滴式板中辨別初始的Fab：BCMA結晶條件，并在24孔板中以懸滴(2-3μl)優化。將復合體濃縮至8mg/ml，并在21％PEG3350，0.1MBisTrispH6.5下和5mMCuCl2，在20℃下結晶.3天后晶體以薄盤的集群顯現，并且在接近7天內獲得其最終大小(0.2-0.3mm)。分離集群并且在具有20％甘油作為保護劑的母液中用液氮急速冷凍單獨的盤。在柏林亥姆霍茲中心(HelmoltzZentrumBerlin)的BESSY同步加速器從單個晶體收集完整的衍射數據。使用來自依法利珠單抗(3EO9)作為搜索模型的結構的實驗階段通過分子替換以1.9埃的解析度解出結構。使用程序的ccp4套件進行數據處理，使用Phenix(AdamsPD，等人(2010)，ActaCryst.D66：213-221)進行結構提純，使用Coot.(Emsley等人，Acta結晶學D部分-生物結晶學(ActaCrystallographicaSectionD-BiologicalCcystallography)，2010，66：486-501)進行建模和評估。使用PyMOL(PyMOL分子圖像系統、版本1.5.0.4LLC)成像。體外細胞毒性測定在本測定中，通過在生物發光讀出器中測量剩余的活細胞的發光確定J22.9-xi的細胞毒性作用。簡言之：通過重力用160ml洗脫緩沖液(含有5mMNa2-EDTA和2.5[w/v]蔗糖的PBS(pH7.4))反沖洗新鮮獲得的人濾器血沉棕黃層(FBC)。通過Ficoll梯度離心從洗脫的細胞中分離單核細胞。從中間相取單核細胞并用洗脫緩沖液洗滌兩次。紅細胞裂解后，將PBMC再次洗滌，計數并通過用RPMI/10％FCSw/o酚紅稀釋調整至1×107個細胞/ml。將50μlRPMI中的5×104MM.1S-Luc細胞鋪于微量滴定板中。在添加100μlPBMC之前10分鐘，將MM.1S-Luc細胞與200μl樣品體積的J22.9-xi或同種型對照抗體連續稀釋液溫育。添加靶細胞、抗體和效應細胞后，將微量滴定板在室溫(RT)下離心(300×g)2分鐘，并在37℃，5％CO2下儲存。對照孔用1％TritonX代替抗體處理以完全裂解。在溫育4小時后，將含熒光素(250ng/ml)的25μlPBS施用于每個孔中，并且在生物發光讀出器(Tecan)中測量活細胞的生物發光。根據下式計算特定的細胞毒性：100-[值(J22.9-xi)-值(總裂解)]/[值(同種型對照)-值(總裂解)]×100。體內研究使用來自Jackson實驗室的NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlTg(CSF2)2YgyTg(IL3)1YgyTg(KITLG)3YgyJGckRolyJ小鼠(NSG)和來自德國查爾斯河(蘇爾茨費爾德，德國)的CB17.Cg-PrkdcscidLystbg/Crl小鼠。用8-14周齡的小鼠進行實驗。所有動物研究根據機構和國家的指導方針，在無特定病原體的條件下進行。在涉及治療已建立的腫瘤和疾病早期的腫瘤治療的實驗例中，使用CB17.Cg-PrkdcscidLystbg/Crl小鼠。本文提到的兩種小鼠品系的表型是非常相似的。這些動物不具有功能性B細胞、T細胞和NK細胞。在CB17.Cg小鼠中觀察到稍微更慢的腫瘤生長，表明本發明的治療性抗體的甚至更有希望的作用。通過在第0天在尾動脈靜脈內注射1×107MM.1S-Luc細胞誘導多發性骨髓瘤的異種移植模型。在該模型中，未處理的動物在6周內發展出后肢癱瘓。這樣的癥狀的發生指示實驗的結束點。對于有效性研究，每周兩次或從第0天開始連續5天腹腔內(i.p.)施用抗體。以每次注射2μg、20μg或200μg的劑量提供J22.9-xi抗體；對于同種型對照抗體，使用200μg/注射.在腹腔內注射150μg熒光素后，使用IVIS譜(CaliperLifeSciences)測量MM.1S-Luc細胞的生物發光。每周一次進行測量。在每個時間點，3只未處理的小鼠也施用熒光素。這些動物的總流量值從每個測量結果中減去或在圖中顯示.為了處理已建立的腫瘤，在注射MM.1S-Luc細胞之后5天開始抗體治療。在6周的時間內每周兩次施用200μgJ22.9-xi或同種型對照抗體。J22.9-xi的人源化將重鏈和輕鏈的可變區序列(小鼠)與來自相應的重鏈和輕鏈亞型人序列比對以確定產生完全人源化序列變體需要的殘基改變。使用J22.9-xi：hBCMA復合體的晶體結構，首先在電腦中評價每個修飾以辨別能夠潛在破壞抗體與BCMA的結合的突變。合成每條鏈的兩種完整的J22.9可變區基因，一條鏈具有原始小鼠序列，一條鏈具有完全人源化序列(即含有所有必須的人源化突變)，各自具有兩個添加的限制性酶切位點將基因分為三個盒。在標記潛在的問題突變之后，產生原始小鼠和完全人源化的基因盒的不同的組合，并且表達它們的相應的IgG，并純化，用BCMA陽性細胞進行FACS分析以評估結合。使用PCR將標記的問題殘基單獨地突變以證明它們對與BCMA的親和性的作用，并且通過SPR后續定量評估最終優化的構建體與人和獼猴BCMA兩者的結合。SPR使用補加了0.005％吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBST)在ProteonXPR36上進行SPR。根據制造商的說明使用標準胺化學法將15μg/ml濃度的整個IgG固定于ProteonGLH傳感器芯片。對于結合實驗，PBST中的人或獼猴BCMA用作移動相。從BCMA的多個濃度(hBCMA為0.4至800nM，以及cynoBCMA為2.7至1μM)平行確定的締合常數(kon)和解離常數(koff)計算結合親和度(Kd)，假定為單位點結合模型。此外，進一步的實驗顯示本發明的優選實施方式提供了驚人和預料不到的效果，從而以非顯而易見的方式解決了本發明的問題。參考文獻Adams，P.D.，Afonine，P.V.，Bunkoczi，G.，Chen，V.B.，Davis，I.W.，Echols，N.，Headd，J.J.，Hung，L.W.，Kapral，G.J.，Grosse-Kunstleve，R.W.等人(2010).PHENIX：用于解析大分子結構的綜合性的基于Python的系統(PHENIX：acomprehensivePython-basedsystemformacromolecularstructuresolution).ActaCrystallogrDBiolCrystallogr66，213-221.Al-Lazikani，B.，Lesk，A.M.Chothia，C.(1997).免疫球蛋白典型結構的標準構象(Standardconformationsforthecanonicalstructuresofimmunoglobulins).JMolBiol273，927-948.Anthony，R.M.Ravetch，J.V.(2010).IgGFc聚糖的新作用：唾酸IgGFc的抗炎活性(AnovelrolefortheIgGFcglycan：theanti-inflammatoryactivityofsialylatedIgGFcs).JClinImmunol30Suppl1，S9-14.Chanetal.(2010)NatRevImmunol10：301-316Chavez-Galan，L.，Arenas-DelAngel，M.C.，Zenteno，E.，Chavez，R.Lascurain，R.(2009).細胞毒性淋巴細胞誘導的細胞死亡機制(Celldeathmechanismsinducedbycytotoxiclymphocytes).CellMolImmunol6，15-25.Chiu，A.，Xu，W.，He，B.，Dillon，S.R.，Gross，J.A.，Sievers，E.，Qiao，X.，Santini，P.，Hyjek，E.，Lee，J.W.等人(2007).霍奇金淋巴瘤細胞表達TACI和BCMA受體并響應于BAFF和APRIL產生存活和增殖信號(HodgkinlymphomacellsexpressTACIandBCMAreceptorsandgeneratesurvivalandproliferationsignalsinresponsetoBAFFandAPRIL).Blood109，729-739.Gordon，N.C.，Pan，B.，Hymowitz，S.G.，Yin，J.，Kelley，R.F.，Cochran，A.G.，Yan，M.，Dixit，V.M.，Fairbrother，W.J.Starovasnik，M.A.(2003).BAFF/BLyS受體3包括編碼高度集中的配體結合位點的最小TNF受體樣組件(BAFF/BLySreceptor3comprisesaminimalTNFreceptor-likemodulethatencodesahighlyfocusedligand-bindingsite).Biochemistry42，5977-5983.Greenstein，S.，Krett，N.L.，Kurosawa，Y.，Ma，C.，Chauhan，D.，Hideshima，T.和erson，K.C.Rosen，S.T.(2003).MM.1人多發性骨髓瘤(MM)細胞系的表征：一種闡明對類固醇敏感和耐受的MM細胞的特征、行為和信號的模型系統(CharacterizationoftheMM.1humanmultiplemyeloma(MM)celllines：amodelsystemtoelucidatethecharacteristics，behavior，andsignalingofsteroid-sensitiveand-resistantMMcells).ExpHematol31，271-282.Jacobi，A.M.，Huang，W.，Wang，T.，Freimuth，W.，Sanz，I.，Furie，R.，Mackay，M.，Aranow，C.，Diamond，B.Davidson，A.(2010).在系統性紅斑狼瘡中長期貝利單抗治療對B細胞的作用：二期，雙盲法，安慰劑對照法，劑量范圍的延伸研究(Effectoflong-termbelimumabtreatmentonBcellsinsystemiclupuserythematosus：extensionofaphaseII，double-blind，placebo-controlled，dose-rangingstudy).ArthritisRheum62，201-210.Kapoor，P.，Ramakrishnan，V.和Rajkumar，S.V.(2012).在多發性骨髓瘤中的硼替佐米聯合治療(Bortezomibcombinationtherapyinmultiplemyeloma).SeminHematol49，228-242.Keyser，F.D.(2011).對患有類風濕性關節炎的患者的生物治療的選擇：感染角度(ChoiceofBiologicTherapyforPatientswithRheumatoidArthritis：TheInfectionPerspective).CurrRheumatolRev7，77-87.Laskowski，R.A.(2009).PDBsum新事物(PDBsumnewthings).NucleicAcidsRes37，D355-359.Mackay，F.，Schneider，P.，Rennert，P.Browning，J.(2003).BAFF和APRIL：對B細胞存活的指導(BAFFANDAPRIL：atutorialonBcellsurvival).AnnuRevImmunol21，231-264.Nimmerjahn，F.Ravetch，J.V.(2008).Fcγ受體作為免疫應答的調節劑(Fcgammareceptorsasregulatorsofimmuneresponses).NatRevImmunol8，34-47.Novak，A.J.，Darce，J.R.，Arendt，B.K.，Harder，B.，Henderson，K.，Kindsvogel，W.，Gross，J.A.，Greipp，P.R.Jelinek，D.F.(2004).在多發性骨髓瘤中BCMA，TACI和BAFF-R的表達：生長和存活的機制(ExpressionofBCMA，TACI，andBAFF-Rinmultiplemyeloma：amechanismforgrowthandsurvival).Blood103，689-694.Queen等人，1989；WO90/07861Patel，D.R.，Wallweber，H.J.，Yin，J.，Shriver，S.K.，Marsters，S.A.，Gordon，N.C.，Starovasnik，M.A.Kelley，R.F.(2004).工程化APRIL特異性B細胞成熟抗原(EngineeringanAPRIL-specificBcellmaturationantigen).JBiolChem279，16727-16735.Presta，L.G.(2008).治療性抗體的分子工程化和設計(Molecularengineeringanddesignoftherapeuticantibodies).CurrOpinImmunol20，460-470.Raab，M.S.，Podar，K.，Breitkreutz，I.，Richardson，P.G.Anderson，K.C.(2009).多發性骨髓瘤(Multiplemyeloma).Lancet374，324-339.Richardson等人(2003)NewEnglJMed348：2609-2617.Ryan等人(MolecularCancerTherapeutics，20076(11)，3009)Roopenian，D.C.Akilesh，S.(2007).FcRn：新生Fc受體到達時代(FcRn：theneonatalFcreceptorcomesofage).NatRevImmunol7，715-725.Suzuki，K.(2013).多發性骨髓瘤的目前治療策略(Currenttherapeuticstrategyformultiplemyeloma).JpnJClinOncol43，116-124.Thorpe等人，1982，Immunol.Rev.62：119-58Wang，S.Y.和Weiner，G.(2008).抗體治療癌癥中的補體和細胞的細胞毒性(Complementandcellularcytotoxicityinantibodytherapyofcancer).ExpertOpinBiolTher8，759-768.Woyke等人(2001)Antimicrob.AgentsandChemother.45(12)：3580-3584.當前第1頁1 2 3