調控毛發生長的方法和組合物與流程

本申請要求2014年7月9日提交的題為“DERIVATIONOFHAIRGROWTHINDUCINGCELLSFROMHUMANEMBRYONICSTEMCELLSANDUSESTHEREOF”的美國臨時申請No.62/022,639的權益，通過援引將其完整收錄。對序列表的援引本申請是連同電子格式的序列表一起提交的。序列表是作為題為BURNHAM036WO_SEQLIST，2015年6月30日創建，大小近似1.9Kb的文件提供的。通過援引將電子格式的序列表中的信息完整收入本文。發明領域本文中提供的方法和組合物的實施方案涉及在受試者中誘導毛發生長。一些實施方案包括篩選調控毛發生長的藥劑。發明背景已經提出在胚胎發生中通過表皮和下面的中胚層之間的相互作用形成毛囊[1,2,3,4]。首先響應表皮基板形成在真皮中作為細胞縮合物(cellcondensate)產生真皮乳頭(DP)。隨著毛囊發育前進，基板中的表皮細胞積極增殖并包圍現在稱作真皮乳頭的真皮縮合物，將它們與周圍的真皮分開[5]。暴露于這些新的小生境條件，DP細胞獲得BMP-4，它的抑制劑成頭蛋白，和表面標志物N-CAM和p-75的表達。另外，它們分泌特定的胞外基質蛋白(例如versican(VCAN))且顯示高水平的堿性磷酸酶(AP)活性[6]。使用雙重報告Lef1-RFP/K14-H2BGFP小鼠進行的研究已經鑒定前瞻性分離的小鼠DP細胞的詳細遺傳簽名[7]并鑒定Wnt，BMP和FGF信號傳導途徑是鼠DP維持和功能所需要的[8,9,10]。DP細胞在毛發生長和循環中發揮作用[6]且決定毛發尺寸和毛發類型[11,12]。早就認識到DP細胞不僅在胚胎發生中而且在出生后能夠誘導毛囊形成。髭DP細胞在移植入成年大鼠的足墊(正常情況下不長毛發的皮膚區域)時誘導重新毛發形成[13]。自頭皮分離的人DP細胞在移植入嚙齒動物時有助于毛發形成[14,15]且在培養物中誘導角質形成細胞形態發生[16]。已經提議DP細胞作為毛發減少疾病的基于細胞的治療。然而，人DP細胞不適合于這一目的，因為它們無法以必需量獲得且在培養時迅速失去它們誘導毛囊形成的能力[7,8,17,18]。因此，開發能夠誘導強健毛發生長的功能性DP細胞存在未滿足的需求。發明概述本文中提供的方法和組合物的一些實施方案包括一種用于在受試者中誘導毛發生長的方法，其包括對該受試者施用一群誘導的真皮乳頭細胞。一些實施方案還包括獲得該群誘導的真皮乳頭細胞。在一些實施方案中，該群誘導的真皮乳頭細胞包含選自由P-75，巢蛋白，veriscan，平滑肌肌動蛋白，堿性磷酸酶，和波形蛋白組成的組的標志物。在一些實施方案中，該群誘導的真皮乳頭細胞是自一群誘導的神經嵴細胞生成的。一些實施方案還包括選擇粘附細胞。在一些實施方案中，該群誘導的神經嵴細胞包含選自由Sox10，Foxd3，整聯蛋白α4，纖連蛋白的關聯受體，CD47，CD184，CD44，P-75，和巢蛋白組成的組的標志物。在一些實施方案中，該群誘導的神經嵴細胞缺乏選自由OCT4，SSEA4，veriscan，平滑肌肌動蛋白，和堿性磷酸酶組成的組的標志物。在一些實施方案中，該群誘導的神經嵴細胞是自一群干細胞生成的。一些實施方案還包括在條件下培養該群干細胞以形成該干細胞的簇。一些實施方案還包括懸浮培養該簇以形成球體。一些實施方案還包括在基質的表面上涂布該球體，其中該表面是用纖連蛋白或聚鳥氨酸包被的。在一些實施方案中，該群干細胞包含選自由胚胎干細胞和誘導的多能干細胞組成的組的細胞。在一些實施方案中，該誘導的多能干細胞是自選自由成纖維細胞，腎上皮細胞，和血細胞組成的組的來源生成的。在一些實施方案中，該群干細胞包含選自由H9細胞和自人BJ成纖維細胞生成的人誘導的多能干細胞組成的組的細胞。在一些實施方案中，該群誘導的真皮乳頭細胞是自供體受試者獲得的。在一些實施方案中，該供體受試者和該受試者是相同的。在一些實施方案中，該供體受試者和該受試者是不同的。在一些實施方案中，該施用包含皮下移植。在一些實施方案中，該施用是對該受試者皮膚的如下部位，在一群受試者中的該部位處包含毛發。在一些實施方案中，該施用是對該受試者的皮膚選自由頭皮，面部，上唇，頦部，眉部，瞼部，臂部，腿部，背部，軀干，和腹部組成的組的部位。在一些實施方案中，該施用是對該受試者的皮膚包括瘢痕組織的部位。在一些實施方案中，該受試者具有脫發。在一些實施方案中，該受試者是哺乳動物。在一些實施方案中，該受試者是人。本文中提供的方法和組合物的一些實施方案包括一種用于篩選調控毛發生長的藥劑的方法，其包括使一群誘導的真皮乳頭細胞接觸測試藥劑；并測量對該群誘導的真皮乳頭細胞中毛發生長的影響。在一些實施方案中，該影響包括該群誘導的真皮乳頭細胞中毛發生長的速率與不接觸該測試藥劑的一群誘導的真皮乳頭細胞相比升高。在一些實施方案中，該影響包括該群誘導的真皮乳頭細胞中毛發生長的速率與不接觸該測試藥劑的一群誘導的真皮乳頭細胞相比降低。在一些實施方案中，該影響包括受試者的皮膚選自由頭皮，面部，上唇，頦部，眉部，瞼部，臂部，腿部，背部，軀干，和腹部組成的組的特定部位特征性的毛發的生長。在一些實施方案中，該受試者是哺乳動物。在一些實施方案中，該受試者是人。在一些實施方案中，該群誘導的真皮乳頭細胞在體內接觸該測試藥劑。在一些實施方案中，該群誘導的真皮乳頭細胞在體外接觸該測試藥劑。在一些實施方案中，該群誘導的真皮乳頭細胞包含選自由P-75，巢蛋白，veriscan，平滑肌肌動蛋白，堿性磷酸酶，和波形蛋白組成的組的標志物。在一些實施方案中，該群誘導的真皮乳頭細胞是自一群誘導的神經嵴細胞生成的。一些實施方案還包括選擇粘附細胞。在一些實施方案中，該群誘導的神經嵴細胞包含選自由Sox10，Foxd3，整聯蛋白α4，纖連蛋白的關聯受體，CD47，CD184，CD44，P-75，和巢蛋白組成的組的標志物。在一些實施方案中，該群誘導的神經嵴細胞缺乏選自由OCT4，SSEA4，veriscan，平滑肌肌動蛋白，和堿性磷酸酶組成的組的標志物。在一些實施方案中，該群誘導的神經嵴細胞是自一群干細胞生成的。一些實施方案還包括在條件下培養該群干細胞以形成該干細胞的簇。一些實施方案還包括懸浮培養該簇以形成球體。一些實施方案還包括在基質的表面上涂布該球體，其中該表面是用纖連蛋白或聚鳥氨酸包被的。在一些實施方案中，該群干細胞包含選自由胚胎干細胞和誘導的多能干細胞組成的組的細胞。在一些實施方案中，該誘導的多能干細胞是自選自由成纖維細胞，腎上皮細胞，和血細胞組成的組的來源生成的。在一些實施方案中，該群干細胞包含選自由H9細胞和自人BJ成纖維細胞生成的人誘導的多能干細胞組成的組的細胞。本文中提供的方法和組合物的一些實施方案包括一種用于制備一群誘導的真皮乳頭細胞的方法，其包括：自一群誘導的神經嵴細胞生成該群。一些實施方案還包括選擇粘附細胞。在一些實施方案中，該群誘導的真皮乳頭細胞包含選自由P-75，巢蛋白，veriscan，平滑肌肌動蛋白，堿性磷酸酶，和波形蛋白組成的組的標志物。在一些實施方案中，該群誘導的神經嵴細胞包含選自由Sox10，Foxd3，整聯蛋白α4，纖連蛋白的關聯受體，CD47，CD184，CD44，P-75，和巢蛋白組成的組的標志物。在一些實施方案中，該群誘導的神經嵴細胞缺乏選自由OCT4，SSEA4，veriscan，平滑肌肌動蛋白，和堿性磷酸酶組成的組的標志物。在一些實施方案中，該群誘導的神經嵴細胞是自一群干細胞生成的。一些實施方案還包括在條件下培養該群干細胞以形成該干細胞的簇。一些實施方案還包括懸浮培養該簇以形成球體。一些實施方案還包括在基質的表面上涂布該球體，其中該表面是用纖連蛋白或聚鳥氨酸包被的。在一些實施方案中，該群干細胞包含選自由胚胎干細胞和誘導的多能干細胞組成的組的細胞。在一些實施方案中，該誘導的多能干細胞是自選自由成纖維細胞，腎上皮細胞，和血細胞組成的組的來源生成的。在一些實施方案中，該群干細胞包含選自由H9細胞和自人BJ成纖維細胞生成的人誘導的多能干細胞組成的組的細胞。本文中提供的方法和組合物的一些實施方案包括通過任一前述方法制備的一群誘導的真皮乳頭細胞。附圖簡述圖1A-1E描繪hESC經NC中間物分化成DP樣細胞。圖1A是分化策略的示意圖。圖1B是兩張顯微照片，描繪hESC-NC培養物中遷移NC標志物Sox10和Foxd3的表達。免疫熒光染色，DAPI為藍色。圖1C是一系列三張圖，描繪hESC-NC培養物中NC標志物整聯蛋白α-4(ITGA4)和hESC標志物OCT4和SSEA4的流式細胞術分析。圖1D是一系列顯微照片，描繪hESC-NC，hDP(來自正常皮膚)和hESC-DP培養物中p-75，巢蛋白，Versican，SMA和堿性磷酸酶(AP)的表達。免疫熒光染色，DAPI為藍色。圖1E是一系列圖，描繪DP樣式形成期間hESC-DP培養物中hDP標志物p-75，微管連接蛋白-1，Versican，SMA和波形蛋白的Q-PCR分析。第0天＝hESC-NC細胞。基因表達的水平(作為相對于hESC-NC水平的倍數變化的對數顯示)相對于18S標準化。對于每一種基因，虛線代表hDP細胞培養物中的基因表達水平。比例尺100μm。圖2A-2C描繪裸小鼠中皮下細胞移植的影響。圖2A是一系列顯微照片，顯示單獨或與小鼠新生真皮細胞(mDC)，hDP，hESC-DP，在血清中分化14天的hESC(hESC-血清)，人hESC衍生的神經嵴細胞(hESC-NC)和7天分化成DP的hESC-NC(hESC-DP7天)組合移植的角質形成細胞的全封固物的立體圖像。圖2B是一張圖，描繪由單獨或與mDC，hDP或hESC-DP組合移植的角質形成細胞誘導的毛發的量化。圖2C是一張圖，描繪ESC-DP細胞的毛發誘導能力隨自hESC-NC(第0天)分化的時間的動力學，作為每個移植(趨勢以紅色線顯現)或在血清存在下分化的hESC(藍色菱形)形成的毛發的數目顯示，與單獨的角質形成細胞(以虛線顯現)比較。所有數據以均值±SEM呈現并用單因素ANOVA(Kruskal-Wallis檢驗，Dunn氏多重比較事后檢驗)分析。*，P≤0.05；**，P≤0,001。比例尺1mm。圖3A-3F以一系列顯微照片描繪GFP標記的hESC-DP和hIPSC-DP的皮下移植。圖3A顯示全封固移植物的立體鏡觀察在新形成的毛發中的DP(箭頭)和真皮囊(箭)的位置中鑒定出GFP陽性hESC-DP細胞；插圖顯示DP區的2倍放大圖。圖3B描繪在毛發的DP和真皮囊中能找到GFP標記的hIPSC-DP：全封固移植物(GFP/明視野)和8μm切片(明視野)。插圖，毛囊的DP區域中的GFP陽性細胞的熒光圖像(明視野圖像中DP區域的白色正方形的2倍放大圖)。圖3C和3D分別描繪新形成的毛發的GFP陽性DP(GFP/明視野，共焦顯微術)對Versican(Versican，共焦顯微術)和堿性磷酸酶(AP，明視野)呈陽性。圖3E顯示在外根鞘區域(箭)以及GFP陽性DP(輪廓)中檢測到很少(～1％的新形成的毛發)NC衍生的GFP陽性細胞，共焦圖像在GFP小圖中。圖3F描繪在移植物中的毛發基質中找到NC衍生的GFP陽性細胞(共焦顯微術)。插圖顯示GFP陽性細胞的2倍放大圖；GFP為白色。注意遍及GFP陽性細胞存在的多個黑色素顆粒(黑色)。圖3A的比例尺250μm；圖3B-3F的比例尺50μm。圖4A-4B描繪BMP信號傳導在DP細胞命運獲取中的作用。圖4A顯示多張顯微照片，描繪在選擇性BMP抑制劑dorsomorphin缺失或存在下衍生的hESC-DP細胞的形態和移植結局。細胞培養物的比例尺50μm，細胞移植的比例尺0.5mm。圖4B是一張圖，描繪在選擇性BMP抑制劑dorsomorphin缺失或存在下hESC-DP細胞中Versican，Corin，微管連接蛋白-1，p-75，波形蛋白和SMA表達的Q-PCR分析。所有數據以均值±SEM呈現并用Student氏t檢驗分析。*，P≤0.05；**，P≤0,001。圖5是一系列圖，以hESC-NC培養物中間充質標志物(CD47，CD184，CD44)表達的流式細胞術分析描繪hESC-NC中間充質標志物的表達。圖6是一系列顯微照片，描繪原位人毛囊DP細胞中DP標志物的表達。SMA，堿性磷酸酶(AP)，巢蛋白和Versican冷凍切片的免疫熒光染色；DAPI為藍色。比例尺100μm。圖7是一系列顯微照片，描繪人DP細胞在裸小鼠皮膚下的移植，其中GFP陽性hDP細胞能在真皮中找到但沒有將新形成的毛發摻入DP區域；全封固移植物(插圖顯示DP區域的2倍放大圖)。比例尺250μm。圖8A-8C描繪hIPSC經NC中間物分化成DP樣細胞。圖8A是一系列顯微照片，描繪hIPSC-NC培養物中神經上皮標志物Sox2，Sox9和巢蛋白的表達。免疫熒光染色，DAPI為藍色。圖8B是一系列顯微照片，描繪人IPSC-DP細胞培養物中DP標志物平滑肌肌動蛋白(SMA)，P-75和巢蛋白的表達。免疫熒光染色，DAPI為藍色。圖8C是一幅圖，描繪Versican，微管連接蛋白-1，p-75，波形蛋白和SMA的表達的Q-PCR分析。基因表達的水平相對于18S標準化并作為相對于hESC-NC表達水平的對數倍數變化顯示。比例尺100μm。發明詳述本文中提供的方法和組合物的實施方案涉及在受試者中誘導毛發生長。在一些實施方案中，一群誘導的真皮乳頭細胞可以自一群誘導的神經嵴細胞生成，后者繼而可以自一群干細胞生成。該群誘導的真皮乳頭細胞可以皮下移植入受試者，并生成毛發。有利的是，可以擴增每群細胞以提供一大群誘導的真皮乳頭細胞可供使用，諸如用于移植。該誘導的真皮乳頭細胞可用于治療具有皮膚病癥，諸如燒傷，瘢痕，和毛發減少的受試者。其它實施方案包括篩選調控毛發生長的藥劑。可以使測試藥劑接觸一群誘導的真皮乳頭細胞并測量影響。可以測試藥劑是否產生涉及毛發生長速率，終毛或毫毛形成，毛干顏色，毛干粗度，和毛干中的二硫鍵水平的影響。真皮乳頭(DP)是獨特的一群間充質細胞，它們調節毛囊形成和生長周期。在發育期間，大多數DP細胞衍生自中胚層，然而，頭發的功能等同DP細胞源自神經嵴(NC)。NC是細胞群體，它瞬時源自發育中背神經管且產生多種組織，包括周圍神經系統，腎上腺髓質，黑色素細胞和多種顱面間充質組織[19]。使用Lox-STOP-Rosa26或Z/EG報告小鼠進行的NC特異性(Wnt1-Cre)譜系示蹤提供了NC對一大群頭部DP細胞的貢獻的遺傳證據[20,21,22]。申請人已經開發了方法和組合物，包括自人胚胎干細胞(hESC)衍生功能性DP樣細胞。參見GnedevaK.,etal.,“DerivationofHair-InducingCellfromHumanPluripotentStemCells”(2015)DerivationofHair-InducingCellfromHumanPluripotentStemCells.PLoSONE10(1):e0116892.doi:10.1371/journal.pone.0116892，通過援引將其完整收入本文。在一些實施方案中，hESC可用于生成NC細胞，然后是培養中毛發誘導性DP樣細胞。hESC衍生的DP樣細胞(hESC-DP)表達通常在成人DP細胞中找到的標志物(例如p-75，巢蛋白，versican，SMA，堿性磷酸酶)且在免疫缺陷性NUDE小鼠的皮膚下移植時能夠誘導毛囊形成。改造成表達GFP的hESC衍生的DP樣細胞將新形成的毛囊摻入DP且表達適宜的標志物。BMP信號傳導是hESC-DP衍生中的一個因素，因為BMP抑制劑dorsomorphin自hESC-DP培養物消除毛發誘導活性。用于誘導毛發生長的方法本文中提供的方法和組合物的一些實施方案包括用于在受試者中誘導毛發生長的方法。在一些此類實施方案中，對該受試者施用一群誘導的真皮乳頭細胞。施用方法可包括將誘導的真皮乳頭細胞移植入該受試者的皮膚，例如施用可包括皮下移植誘導的真皮乳頭細胞。該誘導的真皮乳頭細胞可施用于受試者的皮膚的任何部位，例如，該受試者的皮膚的部位諸如頭皮，面部，上唇，頦部，眉部，瞼部，臂部，腿部，背部，軀干，手部，足部，和腹部。在一些實施方案中，該受試者的皮膚的部位包含瘢痕組織。在一些實施方案中，該受試者具有脫發。在一些實施方案中，該受試者是哺乳動物，諸如人。在一些實施方案中，一群誘導的真皮乳頭細胞可以包括自其它細胞類型(諸如分離的誘導的神經嵴細胞)生成的具有真皮乳頭細胞的特征的分離的一群細胞。在一些實施方案中，誘導的真皮乳頭細胞的特征可以包括與真皮乳頭細胞有關的標志物，諸如蛋白質，表達的核酸，誘導毛囊形成的活性，誘導角質形成細胞形態發生的活性，和誘導毛干生長的活性。標志物的例子包括BMP-4，成頭蛋白，N-CAM，和p-75，胞外基質蛋白諸如versican(VCAN)，堿性磷酸酶(AP)，巢蛋白，平滑肌肌動蛋白，和波形蛋白。在一些實施方案中，可以自誘導的神經嵴細胞生成誘導的真皮乳頭細胞。在一些實施方案中，自一群誘導的神經嵴細胞選擇粘附細胞以生成分離的一群誘導的真皮乳頭細胞。例如，可以將該群誘導的神經嵴細胞涂布在基質上，可以容許粘附細胞附著至該基質，并且可以自該基質洗去非粘附細胞。在一些實施方案中，該基質是塑膠的(plastic)。在一些實施方案中，誘導的神經嵴細胞的特征可以包括與神經嵴細胞有關的標志物，諸如蛋白質，表達的核酸，能夠生成諸如黑色素細胞，顱面軟骨和骨，平滑肌，周圍和腸神經元和神經膠質等細胞的活性。標志物的例子包括Sox10，Foxd3，整聯蛋白α4，纖連蛋白的關聯受體，CD47，CD184，CD44，P-75，和巢蛋白。在一些實施方案中，該群誘導的神經嵴細胞缺乏選自由OCT4，SSEA4，veriscan，平滑肌肌動蛋白，和堿性磷酸酶組成的組的標志物。在一些實施方案中，可以自一群干細胞生成誘導的神經嵴細胞。自干細胞生成誘導的神經嵴細胞的方法的例子記載于BajpaiR.,etal.CellDeathandDifferentiation(2009)16,807-825；和CurchoeCL,etal.(2010)EarlyacquisitionofneuralcrestcompetenceduringhESCsneuralization.PLoSOne5:e13890，通過援引完整收錄其每一篇。在一些實施方案中，在條件下培養一群干細胞以形成該干細胞的簇。在一些實施方案中，懸浮培養該簇以形成球體。在一些實施方案中，在基質的表面上涂布該球體。在一些實施方案中，該表面是用纖連蛋白或聚鳥氨酸包被的。在一些實施方案中，該干細胞包括胚胎干細胞或誘導的多能干細胞。可以自多種來源生成誘導的多能干細胞，諸如成纖維細胞，腎上皮細胞，和血細胞。生成誘導的多能干細胞方法的例子包括Takahashi,K.andYamanaka,S(2006)Cell126(4):663-76；ZhouH,etal.(2009)CellStemCell4(5):381-4；Zhou,etal.,(2012)NatureProtocols7(12):2080-2089；和Moad,M.,etal.(2013)EuropeanUrology64(5):753-761中記載的那些，通過援引完整收錄其每一篇。在一些實施方案中，該群干細胞包含諸如H9細胞或自人BJ成纖維細胞生成的人誘導的多能干細胞等細胞。在一些實施方案中，該群誘導的真皮乳頭細胞是自供體受試者獲得的。例如，可以自供體受試者取得細胞樣品并自該細胞樣品生成一群誘導的多能干細胞。在一些實施方案中，該供體受試者和該受試者是相同的。在一些實施方案中，該供體受試者和該受試者是不同的。用于篩選調控毛發生長的藥劑的方法本文中提供的方法和組合物的一些實施方案包括用于篩選調控毛發生長的藥劑的方法。一些此類實施方案包括使一群誘導的真皮乳頭細胞接觸測試藥劑；并測量對該群誘導的真皮乳頭細胞中毛發生長的影響。在一些實施方案中，藥劑可以包括化合物，包含數種化合物的組合物，和物理條件，諸如溫度和pH。在一些實施方案中，該影響可以包括該群誘導的真皮乳頭細胞中毛發生長的速率與不接觸該測試藥劑的一群誘導的真皮乳頭細胞相比的變化，諸如該群誘導的真皮乳頭細胞中毛發生長速率升高或降低。毛發生長速率可以通過毛干的形成速率或具有活性形成毛干的毛囊的形成速率來測量。在一些實施方案中，該影響可以包括受試者的皮膚選自由頭皮，面部，上唇，頦部，眉部，瞼部，臂部，腿部，背部，軀干，和腹部組成的組的特定部位特征性的毛發的生長。受試者的皮膚的特定部位的毛發的特征的例子可以包括毛干的粗度(thickness)，長度，強度，和毛發周期的長度。在一些實施方案中，該影響可以包括毛發諸如終毛或毫毛的生長。在一些實施方案中，該影響可以包括毛干的顏色，諸如棕色，黑色，紅色，白色，灰色，和金色。在一些實施方案中，該影響可以包括毛干的卷曲程度。在一些實施方案中，該影響可以包括毛干的粗度。在一些實施方案中，該影響可以包括毛干中二硫鍵的水平。在一些實施方案中，該群誘導的真皮乳頭細胞在體內接觸該測試藥劑。例如，可以將該誘導的真皮乳頭細胞移植入受試者的皮膚。在一些實施方案中，該群誘導的真皮乳頭細胞在體外接觸該測試藥劑。實施例使用NC細胞中間體衍生hESC-DP自hESC經NC中間體獲得人DP樣細胞(圖1A)。如先前所述誘導hESC分化成hESC衍生的神經嵴細胞(hESC-NC)[24,25]。hESC-NC培養物顯示強健的神經嵴標志物Sox10和Foxd3表達(圖1B)。流式細胞術分析確認了接近80％培養的hESC-NC細胞表達NC標志物整聯蛋白α4(ITGA4)，纖連蛋白的關聯受體[26]，且缺乏OCT4和SSEA4表達，提示未分化hESC的缺失(圖1C)。神經嵴是多效的一群細胞，它們產生多種間充質組織的前體[19]。FACS分析顯示hESC-NC細胞在分化14天時表達間充質干細胞標志物CD47(99.95％)，CD184(20％)，和CD44(52.58％)(圖5)。為了生成DP樣細胞，在含有10％FBS的DMEM-F12培養基中進一步誘導hESC-NC分化另外兩周(圖1A)。DP細胞是體真皮干細胞[27]且表達間充質干細胞(MSC)標志物[28]。因此，利用對組織培養塑膠的優先粘附自分化中的hESC-NC培養物富集間充質細胞[29]。例行地，約20％hESC-NC培養物粘附至塑膠并在含有血清的培養基中傳代，產生hESC衍生的DP樣細胞(hESC-DP)。這些結果提示hESC衍生的NC細胞含有間充質祖細胞群，可以利用分離方案和培養條件富集MSC和DP細胞。hESC-DP細胞的表征已經匯編小鼠背部皮膚DP細胞的簽名基因[7]，然而，關于人頭部真皮乳頭細胞中的基因表達知道的很少。利用小鼠和人DP細胞二者的標志物來表征間充質hESC-DP。在hESC-NC細胞，培養的人DP細胞(hDP)(自正常人皮膚分離)和hESC-DP細胞中檢測到DP和神經嵴共同的標志物，P-75和巢蛋白(圖1D)[21]。在hESC-NC細胞中沒有檢測到其它人DP標志物：Versican，平滑肌肌動蛋白(SMA)和堿性磷酸酶(AP)，但是它們存在于hDP和hESC-DP培養物中(圖1D)。使用人頭皮皮膚切片確認了hDP中巢蛋白，Versican，SMA和AP染色的特異性(圖6)。hESC-NC中NC標志物P-75(～30％)和巢蛋白(～90％)的表達與hESC-DP培養物中的表達(p-75為～40％，巢蛋白為～90％)相似且顯示與hDP細胞中的表達(P-75為～20％，巢蛋白為～90％)接近的樣式。構成對比，hESC-NC細胞呈Versican(<1％)，SMA(<3％)陰性且完全缺乏AP活性，而大多數hESC-DP表達Versican(～70％)，SMA(～70％)且顯示高水平的AP活性，與在人DP細胞中找到的相似，人DP細胞對Versican，SMA和AP呈接近100％陽性。總體細胞形態和標志物的亞細胞定位在hESC-DP和人DP細胞培養物之間是相似的。為了定量評估DP標志物在hESC-NC分化成hESC-DP期間的表達動力學，使用Q-PCR分析。所有測試的人DP標志物(p-75，微管連接蛋白-1，Versican，SMA，和波形蛋白)的表達水平在hESC-NC分化期間逐漸升高，而且在兩周后與在人DP細胞培養物中找到的相當或更高(圖1E)。總之，這些結果提示hESC-DP培養物內人DP樣細胞的存在。移植后hESC-DP的毛發誘導特性調查hESC-DP細胞是否勝任在無胸腺nu/nu(裸)小鼠中在移植后誘導毛囊形成。使用先前用于證明小鼠皮膚衍生真皮前體的毛發誘導潛力的細胞移植補片(patch)法[27]。簡言之，組合感興趣細胞與自新生動物分離的小鼠表皮細胞(角質形成細胞)并作為濃稠細胞懸浮液皮下移植入裸小鼠。因為裸小鼠具有BALB/c(白化)遺傳背景，所以新形成的和預先存在的毛發是通過使用來自深色毛發的C57BL/6小鼠的表皮細胞進行移植可區分的。作為每個移植物形成的毛發數目測量毛發誘導能力。補片法不容許新形成的毛發進入皮膚表面，這在形態發生的晚期階段擾亂毛囊形態。因此，在移植后14天(此時毛囊形成，但是尚未發育完全)進行分析。單獨移植表皮細胞導致最小限度的毛發誘導，有可能是由于內源DP細胞的存在(圖2A，2B)。用作陽性對照的小鼠真皮細胞(mDC)誘導強健的毛發生長(P＝0.0282)，效率與先前對相同移植模型報告的相似[27](圖2A，2B)。如預期的，與陰性對照(單獨的角質形成細胞)相比，自成年頭皮分離的培養的人DP細胞不誘導顯著數目的毛發(圖2A，2B)。確實，已經顯示人DP細胞有助于單一毛發的轉物種再形成[14]，但是尚未報告人DP細胞在小鼠模型中強健的毛發誘導能力[18]。構成對比，觀察到hESC-DP的顯著的(P＝0.0002)毛發誘導，與mDC的相似(圖2A，2B)。為了監測hESC朝向DP樣細胞分化期間毛發誘導特性的動力學，移植hESC-DP和數種相關細胞群，即，使hESC在DP培養基中分化兩周，跳過NC誘導(hESC)，hESC-NC和部分分化的hESC-DP的中間步驟(分化7天)(圖2C)。令人驚訝的是，移植在血清條件中分化的hESC以及hESC-NC導致與陰性對照相比對毛發生長的顯著抑制(圖2C)。因此，hESC-NC分化成hESC-DP細胞導致毛發誘導能力升高接近100倍(圖2C)。部分分化的hESC-NC移植物中形成的毛發的數目與陰性對照相比沒有顯著差異(圖2C)。這些結果提示本文中描述的hESC-DP細胞具有強健的毛發誘導能力，與新生小鼠真皮細胞的相似的，而且hESC-NC順著分化規程獲得這種能力。hESC-DP將重新形成的毛囊摻入DP移植的hESC-DP可能募集/活化內源小鼠DP細胞，或直接介導觀察到的毛囊形成的誘導。為了解決這個問題，改造hESC-DP以表達GFP并分析原位新形成的毛囊(圖3)。使用補片法在裸鼠的皮膚下移植后14天觀察到重新毛發形成，其可以通過毛干的黑色色素沉著來確定。hESC-DP移植物的立體鏡觀察提示新形成的毛發的大多數DP和真皮囊是由GFP陽性細胞構成的(圖3A)。自hESC-DP移植物分離的全封固毛發的共焦顯微鏡檢查顯示新誘導的毛發內GFP陽性DP細胞的存在(圖3C，3D，3E)。這些毛發的GFP陽性DP對特定標志物(即Versican(圖3C)和AP(圖3D))的染色呈陽性。在GFP陽性DP以外，還觀察到外和內根鞘區域中GFP陽性細胞的存在(圖3E)。還觀察到毛發基質中的GFP陽性細胞的胞質中黑色素顆粒的存在(圖3F)。這些數據提示所移植的hESC-DP能獲得DP細胞的毛發誘導功能。hIPSC-DP的衍生和表征在人ESC的H9系以外，還使用三種先前表征的自正常人BJ成纖維細胞生成的人誘導的多能干細胞(hIPSC)系[30]。遵循先前描述的方案生成hIPSC-NC細胞并分析神經上皮標志物Sox2，Sox9和巢蛋白的存在。自所有三種系獲得的hIPSC-NC顯示相似的表達樣式。只有約50％的hIPSC-NC細胞表達Sox2和Sox9，另外，巢蛋白染色揭示與hESC-NC細胞相比時的形態學差異(圖8A，圖1D)。使用上文所述方案使hIPSC-NC細胞分化以獲得hIPSC-DP。DP標志物SMA，p-75和巢蛋白的免疫染色以及Versican，微管連接蛋白-1，p-75，波形蛋白和SMA的Q-PCR分析顯示只有一種hIPSC系(BJ16)在與hESC-DP細胞相比時產生具有一些DP標志物表達的細胞(圖8B)。圖8C顯示hIPSC-DP中相對于hESC-NC細胞的基因表達水平。通過補片移植進一步表征BJ16IPSC-DP細胞。這種細胞群與陰性對照相比時不誘導顯著數目的毛發。然而，移植GFP陽性BJ16IPSC-DP細胞導致形成毛發及GFP陽性真皮乳頭和真皮囊，雖然頻率比hESC-DP細胞的情況低得多(50個中1根毛發)。在切片中確認了這些毛發的DP內GFP陽性細胞的存在(圖3B)。值得注意的是，只在hESC-DP和hIPSC-DP細胞情況中觀察到所移植的細胞整合入新形成的毛發的乳頭和囊區域。雖然所移植的改造成表達GFP的人DP細胞存在于真皮中，但是這些細胞在鄰近毛囊的DP中沒有找到(圖7)。這些結果提示雖然人多能細胞衍生的DP樣細胞與自成人皮膚分離的DP細胞分享一些特定標志物的表達，但是它們的毛發誘導能力更高且能應用于毛發減少疾病的基于細胞的治療。BMP信號傳導在hESC-DP衍生中的作用不知道發育期間自遷移NC生成DP所涉及的機制。然而，知道用于自NC細胞誘導DP分化的胎牛血清含有骨形態發生蛋白(BMP)[31]，它們是胚胎發育期間的中胚層規范[32,33]和在體外自hESC誘導中胚層[34]所必需的。發現BMP信號傳導是小鼠背部皮膚DP中維持毛囊誘導潛力的一種機制[9]。使用充分研究的選擇性BMP抑制劑dorsomorphin調查BMP信號傳導是否在自hESC-NC細胞衍生hESC-DP細胞中發揮作用[35]。與陽性對照相比，NC至DP轉變期間添加dorsomorphin導致細胞形態的明顯變化，特別是，hESC-DP細胞具有特征性的成纖維細胞樣伸長的形態，而用dorsomorphin處理的細胞是六邊形的且展現它們胞質中多個顆粒的存在(圖4A)。而且，在裸小鼠皮膚下移植的用dorsomorphin處理的細胞不能誘導毛發形成，提示DP特性的喪失(圖4A)。用dorsomorphin處理的細胞的Q-PCR分析揭示抑制BMP信號傳導導致編碼DP特異性標志物Versican(P＝0.0002)，Corin(P＝0.0022)，微管連接蛋白-1(P＝0.0008)和波形蛋白(P＝0.0001)的mRNA的水平顯著降低，但是泛NC標志物p-75(無變化)或平滑肌標志物SMA(顯著升高)不然(圖4B)。然而，使用BMP作為唯一分化劑不能自hESC-NC培養物衍生DP細胞，提示頭部DP細胞命運獲取涉及其它信號傳導途徑。這些結果指示BMP信號傳導對于自hESC-NC細胞生成和/或維持毛發誘導性hESC-DP是必要但非充分的。結果提示在含有血清的培養基中培養的hESC衍生的NC細胞逐漸獲得人DP細胞的標志物且產生具有毛發誘導潛力的粘附細胞群。hESC-DP與人DP細胞相比強健的毛發誘導能力可能反映前者與胚胎或新生真皮乳頭前體細胞群(已知它們經由不同機制誘導毛囊形成)一個主要類似之處[36]。hESC-DP培養物很可能是異質的。這些培養物顯示的平均毛發誘導能力與新生小鼠真皮細胞的相似。前瞻性純化的原代小鼠DP細胞顯示出在毛發誘導方面比小鼠真皮制備物效率高約5倍[27]。因此，有可能的是hESC-DP培養物包含毛發誘導性DP樣細胞的一個子群，其具有甚至比上文報告的平均值更高的毛發誘導能力。另外，在移植GFP陽性hESC-DP時，觀察到毛囊的其它隔室(即外根鞘，內根鞘和毛發基質)中GFP陽性細胞的存在。因為已知在發育期間黑色素細胞源自遷移NC，所以很可能的是在hESC-DP培養物內一些hESC-NC細胞產生黑色素細胞前體。類似地，有可能的是一些hESC-NC能夠產生新形成的毛發的角質形成細胞，因為在須的凸起中嚙齒動物NC細胞能產生表皮干細胞[37]。這些數據提示hESC-DP是NC衍生細胞的混合群，其含有具有毛發誘導特性的DP樣細胞，而且還可能含有形成黑色素細胞和角質形成細胞的細胞。結果提示hESC分化成NC譜系的中間步驟看來是至關重要的，跳過NC誘導導致完全喪失毛發誘導活性。將hESC引導至NC細胞可能將間充質細胞類型的種類限制至皮膚中在發育上規定在NC細胞下游的子集(例如發育期間的頭部DP，黑色素細胞，頭部凸起)。因此，使用相對常見的間充質富集條件諸如含有血清的培養基中的分化和選擇粘附細胞類型，hESC-DP樣細胞變成突出富集毛發誘導性DP樣細胞。不同iPSC系可具有可變的傾向朝向DP樣細胞分化。hiPSC-DP細胞在使用補片法移植時不能誘導毛囊形成且具有低頻率的新形成的毛囊摻入DP。這可能是已知影響IPSC分化的表觀遺傳記憶現象的結果[38,39,40]。用于這項實驗的IPSC系衍生自BJ成纖維細胞[30]。它們的中胚層起源可引起分化第一步(即誘導外胚層神經嵴細胞)困難。確實，只有一些hIPSC-NC細胞表達神經上皮標志物Sox2和Sox9(圖8A，8B)。然而，多種hiPCS和hESC系的全局比較提示，在比較充分大數目的hiPSC系與hESC系時，觀察到它們的分化潛力的主要交疊[41]。因此，雖然絕對效率可以在不同hESC和hiPSC系之間變化，但是應當有可能自多種hiPSC衍生具有毛發誘導特性的細胞[42]。最近，顯示SKP在毛發誘導方面是高度有力的[27]，但是衰老過程中SKP的逐漸喪失可能妨礙分離自體SKP用于老年人的毛發再生療法[43]。自hESC衍生毛發誘導性DP樣細胞代表通向用于毛發減少的人的基于細胞的治療的開發的第一步。材料和方法hESC培養：如先前所述在經過輻射的小鼠胚胎成纖維細胞飼養層上維持H9hESC系[24]。自hESC生成NC細胞：先前描述了分化方案[24,25]。ESC-DP的生成：將第一次傳代的NC細胞用下述組成的DP培養基培養3天：DMEM/F-12Glutamax(Gibco10829-018)，10％FBS(Gibco#10437)，1mML-谷氨酰胺(Gibco25030-081)，1X抗生素/抗真菌劑(OmegaScientificAA-40)。之后，將它們用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco25200)解離成單細胞懸浮液并以密度100x103個細胞/mm2涂布到未包被的培養皿上。次日通過更換培養基去除24小時后未能附著的漂浮細胞。讓附著的細胞在未包被的培養皿上生長，隔天更換培養基；每4-5天對培養物傳代。免疫組織化學和FACS分析：將細胞培養物用含4％PFA的PBS于室溫固定10分鐘；將組織樣品于4℃固定過夜。固定后，將細胞在PBS中清洗3次5分鐘，并在OCT中包埋組織樣品用于冷凍切片或用于毛發解剖和全封固制備物。染色前將細胞和切片在含4％BSA或10％山羊血清及0.05％-0.3％TritonX100(SigmaT8787)的PBS中封閉1小時。于4℃應用一抗過夜。然后將細胞或切片在PBS中清洗3次，每次15分鐘。在黑暗中于室溫應用二抗(在PBS中1:500稀釋)1小時。將細胞在PBS中清洗3次，每次10分鐘。用Hoechst或Dapi標記核。對于FACS分析，用Accutase解離感興趣細胞并在3％BSA/PBS中重懸浮20分鐘以封閉非特異性結合。然后將細胞與一抗一起在冰上溫育30分鐘。然后在3mlPBS中清洗細胞，在含適宜二抗(1:1000)的3％BSA/PBS中重懸浮30分鐘并用3mlPBS清洗，之后在1％BSA/PBS中重懸浮并與碘化丙啶(PI)一起溫育。依照熒光分選細胞(FACSVantageSEDiVa，BDBiosciences，SanJose)并用FlowJo軟件分析數據。使用下述抗體：小鼠單克隆CD47(R&D)，小鼠單克隆CD184(eBioscience)，小鼠單克隆CD44(Novus)，山羊多克隆Foxd3(SantaCruz)，家兔多克隆GFP(Invitrogen)，小鼠單克隆ITGA4(R&D)，小鼠單克隆巢蛋白(Chemicon)，小鼠單克隆OCT3/4(SantaCruz)，家兔多克隆P-75(Chemicon)，小鼠單克隆SMA(Chemicon)，家兔多克隆Sox2(Abcam)，家兔多克隆Sox9(Millipore)，家兔多克隆Sox10(Abcam)，小鼠單克隆SSEA4(R&D)，小鼠單克隆Versican(SeikagakuCorporation)。Q-PCR：使用RNeasy試劑盒提取總RNA并依照制造商的建議使用Quantitect試劑盒(Qiagen)逆轉錄1μg總RNA以生成cDNA。依照制造商的推薦用SyberGreenmaster混合物(Invitrogen)實施Q-PCR。對于Q-PCR，使用18S表達水平進行標準化并使用標準曲線方法分析數據。如下實施Q-PCR：初始變性：95℃10分鐘；40個循環的變性：95℃30秒，退火：56℃1分鐘，延伸：72℃30秒；和一個最終循環的變性：95℃1分鐘，退火：65℃30秒和最終變性：95℃30秒。表1中匯總實時Q-PCR引物。表1引物序列SEQIDNO:18S正向AGTCCCTGCCCTTTGTACACASEQIDNO:0118S反向CGATCCGAGGGCCTCACTASEQIDNO:02Corin正向AACCCAGTGGACATATCTGTGGCTSEQIDNO:03Corin反向TGTTGATGCCAAGCACCACTTTCCSEQIDNO:04微管連接蛋白正向TGTGAAGTCGAGGCCTCATGACAASEQIDNO:05微管連接蛋白反向TCTTGGAGACGATGGCCTTGTTGASEQIDNO:06P-75正向TTCAAGGGCTTACACGTGGAGGAASEQIDNO:07P-75反向AATTCCTTCTTGCCGCATTCCCACSEQIDNO:08Versican正向TGAGCATGACTTCCGTTGGACTGASEQIDNO:09Versican反向CCACTGGCCATTCTCATGCCAAATSEQIDNO:10波形蛋白正向AGAACCTGCAGGAGGCAGAAGAATSEQIDNO:11波形蛋白反向TTCCATTTCACGCATCTGGCGTTCSEQIDNO:12細胞：獲得不同傳代次數時的ESC-DP細胞。用0.1％胰蛋白酶-EDTA(Gibco25200)將細胞解離成單細胞懸浮液并通過系列離心用PBS清洗3次(1200RPM，5分鐘)。最后，以濃度5x106每100μl在DP培養基中重懸浮細胞并保持在冰上直至移植。自p0-p2BL6小鼠皮膚獲得小鼠表皮和真皮細胞。分離背部皮膚并放置在冰上，在含抗生素/抗真菌劑(最終1X；OmegaScientificAA-40)的PBS中搖動清洗5次5分鐘并在含0.01％分散酶(Sigma)的PBS中于40℃溫育過夜。用鑷子分離皮膚的表皮層，在PBS中清洗5分鐘并在0.1％胰蛋白酶-EDTA溶液中于37℃溫育8分鐘。用剪子將皮膚的真皮層均質化并用0.1％胰蛋白酶-EDTA溶液于37℃消化45分鐘。通過添加DP培養基來封閉酶活性并用移液器將表皮或真皮劇烈吹打10分鐘。用細胞濾網(BDFalcon9261365)分離細胞懸浮液并通過離心在PBS中清洗3次(1200RPM，5分鐘)。以5x106個細胞每100μl在DP培養基中重懸浮細胞并保持在冰上直至移植。人真皮乳頭細胞：這項研究中人組織衍生樣品的使用限于使用來自2項整容醫學規程的皮膚廢組織。在含抗生素/抗真菌劑(最終1X；OmegaScientificAA-40)的PBS中搖動清洗皮膚15次5分鐘。然后用解剖刀分離含有毛囊的脂肪并在含0.2％分散酶(Sigma)的DMEM/F12中于40℃溫育過夜。用鑷子自脂肪分離毛囊并在含0.1％I型膠原酶(Sigma)的DMEM/F12中溫育5-7小時。然后通過用移液器劇烈吹打10分鐘自剩余囊解離DP。在毛囊落到底部后DP停留在上清液中并通過以1000RPM離心5分鐘來分離。細胞移植：先前詳細描述了細胞移植的方法[27]。簡言之，組合感興趣細胞(ESC-NC，早期ESC-DP，ESC-DP，rDPp2)的100μl懸浮液(5x105個細胞)與表皮細胞的100μl懸浮液(5x105個細胞)并通過皮下注射移植給免疫缺陷小鼠(品系AthymicNu/Nu)。14-21天后對小鼠處以安樂死并分析移植物。對于陰性對照，移植單獨的表皮細胞。參考文獻通過援引明確將每一篇下述參考文獻完整收入本文。1.HardyMH(1992)Thesecretlifeofthehairfollicle.TrendsGenet8:55-61.2.JahodaCA,ReynoldsAJ(1996)Dermal-epidermalinteractions.Adultfollicle-derivedcellpopulationsandhairgrowth.DermatolClin14:573-583.3.MillarSE(2002)Molecularmechanismsregulatinghairfollicledevelopment.JInvestDermatol118:216-225.4.DriskellRR,ClavelC,RendlM,WattFM(2011)Hairfollicledermalpapillacellsataglance.JCellSci124:1179-1182.5.Schmidt-UllrichR,PausR(2005)Molecularprinciplesofhairfollicleinductionandmorphogenesis.Bioessays27:247-261.6.BotchkarevVA,PausR(2003)Molecularbiologyofhairmorphogenesis:developmentandcycling.JExpZoolBMolDevEvol298:164-180.7.RendlM,LewisL,FuchsE(2005)Moleculardissectionofmesenchymal-epithelialinteractionsinthehairfollicle.PLoSBiol3:e331.8.KishimotoJ,BurgesonRE,MorganBA(2000)Wntsignalingmaintainsthehair-inducingactivityofthedermalpapilla.GenesDev14:1181-1185.9.RendlM,PolakL,FuchsE(2008)BMPsignalingindermalpapillacellsisrequiredfortheirhairfollicle-inductiveproperties.GenesDev22:543-557.10.GrecoV,ChenT,RendlM,SchoberM,PasolliHA,etal.(2009)Atwo-stepmechanismforstemcellactivationduringhairregeneration.CellStemCell4:155-169.11.WeinbergWC,etal.(1993)Reconstitutionofhairfollicledevelopmentinvivo:determinationoffollicleformation,hairgrowth,andhairqualitybydermalcells.JInvestDermatol100:229-236.12.DriskellRR,GiangrecoA,JensenKB,MulderKW,WattFM(2009)Sox2-positivedermalpapillacellsspecifyhairfollicletypeinmammalianepidermis.Development136:2815-2823.13.JahodaCA,HorneKA,OliverRF(1984)Inductionofhairgrowthbyimplantationofcultureddermalpapillacells.Nature311:560-562.14.JahodaCA,etal.(2001)Trans-specieshairgrowthinductionbyhumanhairfollicledermalpapillae.ExpDermatol10:229-237.15.WuJJ,etal.(2006)Hairfolliclereformationinducedbydermalpapillacellsfromhumanscalpskin.ArchDermatolRes298:183-190.16.ChermnykhES,etal.(2010)Dermalpapillacellsinducekeratinocytetubulogenesisinculture.HistochemCellBiol133:567-576.17.LichtiU,etal.(1993)Invivoregulationofmurinehairgrowth:insightsfromgraftingdefinedcellpopulationsontonudemice.JInvestDermatol101:124S-129S.18.YangCC,CotsarelisG(2010)Reviewofhairfollicledermalcells.JDermatolSci57:2-11.19.Bronner-FraserM(1994)Neuralcrestcellformationandmigrationinthedevelopingembryo.FASEBJ8:699-706.20.DanielianPS,MuccinoD,RowitchDH,MichaelSK,McMahonAP(1998)Modificationofgeneactivityinmouseembryosinuterobyatamoxifen-inducibleformofCrerecombinase.CurrBiol8:1323-1326.21.FernandesKJ,etal.(2004)Adermalnicheformultipotentadultskin-derivedprecursorcells.NatCellBiol6:1082-1093.22.NagoshiN,etal.(2008)Ontogenyandmultipotencyofneuralcrest-derivedstemcellsinmousebonemarrow,dorsalrootganglia,andwhiskerpad.CellStemCell2:392-403.23.MetalloCM,JiL,dePabloJJ,PalecekSP(2008)Retinoicacidandbonemorphogeneticproteinsignalingsynergizetoefficientlydirectepithelialdifferentiationofhumanembryonicstemcells.StemCells26:372-380.24.CurchoeCL,etal.(2010)EarlyacquisitionofneuralcrestcompetenceduringhESCsneuralization.PLoSOne5:e13890.25.CimadamoreF,etal.(2011)HumanESC-DerivedNeuralCrestModelRevealsaKeyRoleforSOX2inSensoryNeurogenesis.CellStemCell8:538-551.26.MouldAP,etal.(1994)Integrinalpha4beta1-mediatedmelanomacelladhesionandmigrationonvascularcelladhesionmolecule-1(VCAM-1)andthealternativelysplicedIIICSregionoffibronectin.JBiolChem269:27224-27230.27.BiernaskieJ,ParisM,MorozovaO,FaganBM,MarraM,etal.(2009)SKPsderivefromhairfollicleprecursorsandexhibitpropertiesofadultdermalstemcells.CellStemCell5:610-623.28.HoogduijnMJ,GorjupE,GeneverPG(2006)Comparativecharacterizationofhairfollicledermalstemcellsandbonemarrowmesenchymalstemcells.StemCellsDev15:49-60.29.PittengerMF,etal.(1999)Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.Science284:143-147.30.LiuGH,etal.(2011)RecapitulationofprematureageingwithiPSCsfromHutchinson-Gilfordprogeriasyndrome.Nature.31.KodairaK,etal.(2006)PurificationandidentificationofaBMP-likefactorfrombovineserum.BiochemBiophysResCommun345:1224-1231.32.WinnierG,BlessingM,LaboskyPA,HoganBL(1995)Bonemorphogeneticprotein-4isrequiredformesodermformationandpatterninginthemouse.GenesDev9:2105-2116.33.MishinaY,SuzukiA,UenoN,BehringerRR(1995)BmprencodesatypeIbonemorphogeneticproteinreceptorthatisessentialforgastrulationduringmouseembryogenesis.GenesDev9:3027-3037.34.ZhangP,LiJ,TanZ,WangC,LiuT,etal.(2008)Short-termBMP-4treatmentinitiatesmesoderminductioninhumanembryonicstemcells.Blood111:1933-1941.35.YuPB,etal.(2008)DorsomorphininhibitsBMPsignalsrequiredforembryogenesisandironmetabolism.NatChemBiol4:33-41.36.InamatsuM,etal.(2006)Embryonicdermalcondensationandadultdermalpapillainducehairfolliclesinadultglabrousepidermisthroughdifferentmechanisms.DevGrowthDiffer48:73-86.37.Sieber-BlumM,GrimM(2004)Theadulthairfollicle:cradleforpluripotentneuralcreststemcells.BirthDefectsResCEmbryoToday72:162-172.38.KimK,etal.(2010)Epigeneticmemoryininducedpluripotentstemcells.Nature467:285-290.39.JandialR,LevyML(2011)Cellularalchemy:inducedpluripotentstemcellsretainepigeneticmemory.WorldNeurosurg75:5-6.40.Bar-NurO,RussHA,EfratS,BenvenistyN(2011)Epigeneticmemoryandpreferentiallineage-specificdifferentiationininducedpluripotentstemcellsderivedfromhumanpancreaticisletBetacells.CellStemCell9:17-23.41.BoultingGL,etal.(2011)Afunctionallycharacterizedtestsetofhumaninducedpluripotentstemcells.NatBiotechnol29:279-286.42.BockC,etal.(2011)ReferenceMapsofhumanESandiPScellvariationenablehigh-throughputcharacterizationofpluripotentcelllines.Cell144:439-452.43.ZouboulisCC,AdjayeJ,AkamatsuH,Moe-BehrensG,NiemannC(2008)Humanskinstemcellsandtheageingprocess.ExpGerontol43:986-997.本文中使用的，術語“包含”與“包括”，“含有”，或“特征在于”同義，而且是內含式的或開放式的且不排除另外的，未述及的要素或方法步驟。上文描述公開本發明的數種方法和材料。本發明容易進行方法和材料的更改以及制作方法和設備的改變。考慮本公開文本或本文中公開的發明的實踐后，此類更改對本領域技術人員會變得顯而易見。因此，本發明意圖并不限于本文中公開的具體實施方案，而是意圖涵蓋落在本發明的真正范圍和精神內的所有更改和備選。通過援引將本文中引用的所有參考文獻(包括但不限于已出版的和未出版的申請，專利，和文獻參考文獻)完整收入本文且由此構成此說明書的一部分。在通過援引收錄的出版物和專利或專利申請與本說明書中含有的公開內容矛盾的情況下，本說明書意圖取代和/或優先于任何此類矛盾材料。序列表<110>A·V·特爾斯基克<120>調控毛發生長的方法和組合物<130>BURNHAM.036WO<150>62022639<151>2014-07-09<160>12<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>21<212>DNA<213>人（Homosapiens）<400>1agtccctgccctttgtacaca21<210>2<211>19<212>DNA<213>人（Homosapiens）<400>2cgatccgagggcctcacta19<210>3<211>24<212>DNA<213>人（Homosapiens）<400>3aacccagtggacatatctgtggct24<210>4<211>24<212>DNA<213>人（Homosapiens）<400>4tgttgatgccaagcaccactttcc24<210>5<211>24<212>DNA<213>人（Homosapiens）<400>5tgtgaagtcgaggcctcatgacaa24<210>6<211>24<212>DNA<213>人（Homosapiens）<400>6tcttggagacgatggccttgttga24<210>7<211>24<212>DNA<213>人（Homosapiens）<400>7ttcaagggcttacacgtggaggaa24<210>8<211>24<212>DNA<213>人（Homosapiens）<400>8aattccttcttgccgcattcccac24<210>9<211>24<212>DNA<213>人（Homosapiens）<400>9tgagcatgacttccgttggactga24<210>10<211>24<212>DNA<213>人（Homosapiens）<400>10ccactggccattctcatgccaaat24<210>11<211>24<212>DNA<213>人（Homosapiens）<400>11agaacctgcaggaggcagaagaat24<210>12<211>24<212>DNA<213>人（Homosapiens）<400>12ttccatttcacgcatctggcgttc24當前第1頁1 2 3