本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及端錨聚合酶抑制劑、或其藥學上可接受的鹽、酯、溶劑化物及其立體異構體，這些化合物的制備方法，含有這些化合物的藥物制劑及藥物組合物，以及這些化合物在制備治療和/或預防癌癥、阿爾茲海默癥、骨質疏松癥、皮膚病、心血管疾病、ii型糖尿病的藥物中的應用。
背景技術：
眾所周知，癌癥已經成為威脅人類生命和健康最嚴重的疾病之一，全世界每年約有九百余萬人罹患惡性腫瘤。因此，找到預防和治療癌癥的有效藥物和方法，成為當今社會刻不容緩的任務。癌癥是一種以喪失對細胞生長適當控制為特征的疾病。據報道，經典的wnt信號通路即β-catenin介導的wnt信號通路，與很多生物過程相關，例如細胞命運、細胞增殖、干細胞的維持等。wnt信號通路的異常激活可以導致多種癌癥，因此該信號通路成為抗腫瘤治療的熱門通路。
β-catenin和axin蛋白是經典wnt信號通路的重要組成部分。β-catenin過多會導致wnt信號傳導增加及相關核轉錄因子的活化，而axin過量會導致細胞內β-catenin降解并減少信號傳導。因此，wnt信號的傳導受到此兩種蛋白的相對穩定性來控制。當細胞沒有接受wnt信號刺激時，細胞質內大部分β-catenin都是以降解復合體的形式被蛋白酶體降解。而當wnt信號通路被異常激活后，β-catenin隨之被降解復合體大量解放，細胞質中增加的自由β-catenin，最終進入細胞核與淋巴增強子結合因子1相互作用，調節下游基因的表達。這些下游基因與許多癌癥有牽連。
β-catenin降解過程中形成的降解復合物主要由β-catenin、apc、axin、ck1、gsk3β組成。其中axin是一種支架蛋白，具有與其他蛋白作用的位點，能將β-catenin、apc、ck1、gsk3β結合在一起。ck1是一種酪氨酸激酶，能將β-catenin的ser45磷酸化，隨后gsk3β將β-catenin的thr41、ser37、ser33磷酸化，磷酸化的β-catenin再結合到β-trcp蛋白上，受泛素的共價修飾，從而被蛋白酶體降解。apc蛋白的作用是增強降解復合體與β-catenin的親和力。當wnt信號通路被激活后，活化的dvl蛋白會破壞降解復合體，使β-catenin大量釋放，引起游離β-catenin積累。有文獻報道，通過穩定細胞中axin蛋白，可以有效提高降解復合物的濃度，從促進β-catenin的降解。
端錨聚合酶tankyrases屬于adp-核糖聚合酶(parp)蛋白家族，人類的tankyrase1(tnks1)和2(tnks2)也分別被稱為parp-5a和parp-5b。端錨聚合酶能使axin蛋白發生聚adp核糖基化，為其后續進行泛素化及蛋白酶體降解進行標記，因此通過抑制端錨聚合酶的活性，可以使axin蛋白的濃度上升，從而導致β-catenin降解復合體的濃度升高，促進β-catenin的降解及wnt信號傳導減少。有文獻報道xav939和iwr-1-endo都屬于小分子端錨聚合酶抑制劑，可以穩定axin蛋白水平并抑制wnt信號通路。因此，通過抑制端錨聚合酶的作用，對癌癥治療的研究具有重大的意義。此外，wnt信號通路除于癌癥相關外，針對糾正wnt信號傳導異常還可以應用到其他的疾病領域，例如阿爾茲海默癥、骨質疏松癥、皮膚病、心血管疾病、ii型糖尿病。盡管本文重點介紹的是wnt通路與癌癥的關系，但此通路在其他疾病中同樣具有潛在的應用價值。同時，對端錨聚合酶的抑制也可以對其他生物功能產生影響，例如染色體末端保護(端粒)、有絲分裂期間的紡錘體組裝及脂肪細胞的葡萄糖轉運。因此，可以預見端錨聚合酶抑制劑還可以用于治療由此類抑制所介導的疾病。
目前還未有針對端錨聚合酶的小分子抑制劑進入臨床研究，因此針對此靶點在癌癥治療領域的應用存在巨大的需求。為此，我們希望可以開發出新結構的高效低毒的針對端錨聚合酶靶點的抗腫瘤藥物。本發明將提供一種新型結構的端錨聚合酶抑制劑，此結構的化合物對tnks1和tnks2具有較高的抑制作用，同時針對parp蛋白家族中的parp1和parp2具較好的選擇性，表現出較好的抗腫瘤作用。
技術實現要素：
本發明以開發針對端錨聚合酶的小分子抑制劑為目標，發明了對治療和/或預防端錨聚合酶介導的癌癥及相關疾病具有良好效果的端錨聚合酶抑制劑。具體的技術方案為如下：
方案1.通式(ⅰ)所示的化合物、其藥學上可接受的鹽、酯、溶劑化物或其立體異構體：
其中,x、y各自獨立地選自ch、n原子；
z選自crbrc、nh或n原子；
l選自o、s、crbrc、nrd、c(o)；
rb、rc分別獨立地選自不存在、氫原子、羥基、氨基、羧基、硝基、氰基、鹵素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧基c1-6烷基、鹵代c1-6烷基、鹵代c1-6烷氧基、c1-6烷基羰基、c1-6烷基硫基、c1-6烷氧基羰基、c1-6烷基羰基氧基、c1-6烷基氨基磺酰基、二(c1-6烷基)氨基磺酰基、c1-6烷基氨基、二(c1-6烷基)氨基、c1-6烷基磺酰基、c1-6烷基酰氨基或c1-6烷基磺酰氨基；
rd選自氫原子、c1-6烷基、鹵代c1-6烷基、c1-6烷基羰基或c1-6烷基磺酰基；
r1、r2、r3、r4、r5分別獨立地選自氫原子、鹵素原子、氰基、羥基、氨基、羧基、硝基、c1-6烷基、鹵代c1-6烷基、c1-6烷氧基、鹵代c1-6烷氧基、羥基c1-6烷基、氨基c1-6烷基、羧基c1-6烷基、c1-6烷基硫基、c1-6烷基氨基、二(c1-6烷基)氨基、c1-6烷基羰基、c1-6烷基磺酰基、c1-6烷基磺酰氨基、c1-6烷基酰氨基、c1-6烷氧基c1-6烷基、氨基磺酰基c1-6烷基、氨基磺酰氨基c1-6烷基；
m選自0、1、2或3；
n選自0、1、2、3或4；
p選自0、1、2或3。
方案2.如方案1所述的化合物、其藥學上可接受的鹽、酯、溶劑化物或其立體異構體，
其中,x、y各自獨立地選自ch、n原子；
z選自crbrc、nh或n原子；
l選自o、s、crbrc、nrd；
rb、rc分別獨立地選自不存在、氫原子、羥基、氨基、羧基、硝基、氰基、鹵素原子、c1-4烷基、c1-4烷氧基、鹵代c1-4烷基、鹵代c1-4烷氧基、c1-4烷基羰基、c1-4烷基氨基或二(c1-4烷基)氨基；
rd選自氫原子、c1-4烷基、鹵代c1-4烷基、c1-4烷基羰基或c1-4烷基磺酰基；
r1、r2、r3、r4、r5分別獨立地選自氫原子、鹵素原子、氰基、羥基、氨基、羧基、硝基、c1‐4烷基、鹵代c1‐4烷基、c1‐4烷氧基、鹵代c1‐4烷氧基、羥基c1‐4烷基、氨基c1‐4烷基或羧基c1‐4烷基；
m選自0、1或2；
n選自0、1、2或3；
p選自0、1、2或3。
方案3.如方案2所述的化合物、其藥學上可接受的鹽、酯、溶劑化物或其立體異構體，具有式(ⅱ)所述的結構，
方案4.如方案3所述的化合物、其藥學上可接受的鹽、酯、溶劑化物或其立體異構體，
其中，z選自crbrc、nh或n原子；
l獨立的選自o、s、crbrc、nrd；
rb、rc分別獨立地選自不存在、氫原子、羥基、氨基、羧基、硝基、氰基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、甲基、乙基、丙基、丁基、甲氧基、乙氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、甲酰基、乙酰基、甲基氨基或二甲氨基；
rd選自氫原子、甲基、乙基、丙基、三氟甲基、甲酰基、乙酰基或甲磺酰基；
m選自0或1；
p選自0、1或2。
方案5.如方案4所述的化合物、其藥學上可接受的鹽、酯、溶劑化物或其立體異構體，
其中,
方案6.如方案5所述的化合物、其藥學上可接受的鹽、酯、溶劑化物或其立體異構體，
其中,
r2、r3、r4分別獨立地選自氫原子、鹵素原子、氰基、羥基、氨基、羧基、硝基、甲基、乙基、丙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、羥基甲基、氨基甲基或羧基甲基。
上述方案中的技術特征可以任意組合，所得到的技術方案均記載于本發明中。
本發明的部分化合物
發明詳述
在本申請的說明書和權利要求書中，化合物都是依據化學結構式而命名的，如果表示同一化合物時化合物的命名與化學結構式不符，以化學結構式或化學反應式為準。
本發明所述的“鹵素原子”包括氟原子、氯原子、溴原子和碘原子等。
本發明所述的“c1-6烷基”表示直鏈或支鏈的含有1-6個碳原子的烷基，包括例如“c1-4烷基”、“c1-3烷基”等，具體實例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、2-甲基丙基、1-甲基丙基、1,1-二甲基乙基、正戊基、3-甲基丁基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、正己基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1,2-二甲基丙基等。
本發明所述的“c2-8烯基”是指含有至少一個雙鍵的碳原子數為2-8的直鏈或支鏈或環狀的烯基，包括例如“c2-6烯基”、“c2-4烯基”、“c2-3烯基”等，具體實例包括但不限于：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、2-甲基-1-丁烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、1,1-二甲基-2-丙烯基、1-乙基-2-丙烯基、2-己烯基、3-己烯基、2-甲基-1-戊烯基、3-甲基-1-戊烯基、1-甲基-2-戊烯基、3-甲基-2-戊烯基、2-甲基-3-戊烯基、1-甲基-4-戊烯基、3-甲基-4-戊烯基、1,1-二甲基-3-丁烯基、1,2-二甲基-3-丁烯基、1,3-二甲基-2-丁烯基、2,2-二甲基-3-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-1-丁烯基、2-乙基-1-丁烯基、2-乙基-3-丁烯基等。
本發明所述的“c2-8炔基”是指含有三鍵的碳原子數為2-8的直鏈或支鏈的炔基，其中包括例如“c2-6炔基”、“c2-4炔基”、“c2-3炔基”等，具體實例包括但不限于：乙炔基、1-丙炔基、2-丁炔基、1-甲基-2-丙炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、1-甲基-2-丁炔基、2-甲基-3-丁炔基、1,1-二甲基-2-丙炔基、1-乙基-2-丙炔基、2-己炔基、3-己炔基、1-甲基-2-戊炔基、1-甲基-3-戊炔基、2-甲基-3-戊炔基、1,1-二甲基-3-丁炔基、2-乙基-3-丁炔基、2-庚炔基、3-庚炔基等。
本發明所述的“c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、二(c1-6烷基)氨基、c1-6烷基硫基、c1-6烷基羰基、c1-6烷氧基羰基、c1-6烷基羰基氧基、c1-6烷基酰氨基、c1-6烷基磺酰基、c1-6烷基磺酰氨基、c1-6烷基氨基磺酰基、二(c1-6烷基)氨基磺酰基”是指以c1-6烷基-o-、c1-6烷基-nh-、(c1-6烷基)2-n-、c1-6烷基-s-、c1-6烷基-c(o)-、c1-6烷基-o-c(o)-、c1-6烷基-c(o)-o-、c1-6烷基-c(o)-nh-、c1-6烷基-so2-、c1-6烷基-so2-nh-、c1-6烷基-nh-so2-、(c1-6烷基)2-nh-so2-方式形成的基團，其中“c1-6烷基”的定義如前文所述。
本發明所述的“c1-4烷氧基、c1-4烷基氨基、二(c1-4烷基)氨基、c1-4烷基硫基、c1-4烷基羰基、c1-4烷氧基羰基、c1-4烷基羰基氧基、c1-4烷基酰氨基、c1-4烷基磺酰基、c1-4烷基磺酰氨基、c1-4烷基氨基磺酰基、二(c1-4烷基)氨基磺酰基”是指以c1-4烷基-o-、c1-4烷基-nh-、(c1-4烷基)2-n-、c1-4烷基-s-、c1-4烷基-c(o)-、c1-4烷基-o-c(o)-、c1-4烷基-c(o)-o-、c1-4烷基-c(o)-nh-、c1-4烷基-so2-、c1-4烷基-so2-nh-、c1-4烷基-nh-so2-、(c1-4烷基)2-nh-so2-方式形成的基團，其中“c1-4烷基”的定義如前文所述。
本發明所述的“鹵代c1-6烷基、羥基c1-6烷基、氨基c1-6烷基、羧基c1-6烷基、氨基磺酰基c1-6烷基、氨基磺酰氨基c1-6烷基、c1-6烷氧基c1-6烷基、鹵代c1-6烷氧基”是指一至多個，例如1～4個、1～3個、1～2個鹵素原子、羥基、氨基、羧基、氨基磺酰基、氨基磺酰氨基、c1-6烷氧基分別取代c1-6烷基、c1-6烷氧基中的氫原子所形成的基團。
本發明所述的“鹵代c1-4烷基、羥基c1-4烷基、氨基c1-4烷基、羧基c1-4烷基、氨基磺酰基c1-4烷基、氨基磺酰氨基c1-4烷基、c1-4烷氧基c1-4烷基、鹵代c1-4烷氧基、羥基c1-4烷氧基”是指一至多個，例如1～4個、1～3個、1～2個鹵素原子、羥基、氨基、羧基、氨基磺酰基、氨基磺酰氨基、c1-4烷氧基分別取代c1-4烷基、c1-4烷氧基中的氫原子所形成的基團。
本發明所述的“
本發明還提供了上述化合物的制備方法，但不僅限于以下方法，反應方程式如下：
反應步驟：
步驟1中間體1的制備
將原料1、原料2和n,n-二異丙基乙胺加入到有機溶劑(例如二甲基亞砜)中，90-110℃反應10-20h，加入有機溶劑(例如乙酸乙酯)和水，分液，有機相干燥，濃縮得中間體1。
步驟2中間體2的制備
通過購買或自己制備得到中間體2。
步驟3中間體3的制備
將中間體2和聯硼酸頻那醇酯溶于適當溶劑(例如1,4-二氧六環)中，氮氣保護下加入醋酸鉀和四(三苯基膦)鈀，升溫(例如100-120℃)反應6h，反應完全，濃縮，經純化(例如硅膠柱層析)得到中間體3。
步驟4通式(ⅰ)化合物的制備
將中間體1、中間體3和碳酸鈉溶于適當溶劑(例如1,4-二氧六環和水)中，氮氣保護下加入[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡合物，90-110℃反應(例如4-8h)，反應液濃縮，經純化(例如硅膠柱層析)得通式(ⅰ)化合物。
反應方程式中，r1、r2、r3、r4、r5、m、n、p、z、l、x和y如前文所定義，q代表氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。
本發明式(i)化合物的“立體異構體”是指當式(i)化合物存在不對稱碳原子時，會產生對映異構體，當化合物存在碳碳雙鍵或環狀結構時，會產生順反異構體，當化合物存在酮或肟時，會產生互變異構體，所有式(i)化合物的對映異構體、非對映異構體、消旋異構體、順反異構體、互變異構體、幾何異構體、差向異構體及其混合物，均包括在本發明范圍中。
本發明的通式(i)所示的任一化合物合成得到的若是消旋體，所需要的對映體純的化合物可以通過常規的手性拆分方法獲得，所述手性拆分的方法包括但不限于：手性固定相的色譜法(像高壓制備液相色譜、超臨界流體色譜)、化學拆分、膜拆分、毛細管電泳拆分等。
本發明的通式(i)所示的任一化合物藥學上可接受的鹽是指由藥學上可接受的、非毒性堿或酸制備的鹽，包括有機酸鹽、無機酸鹽、有機堿鹽、無機堿鹽。
有機酸鹽包括甲酸、乙酸、三氟乙酸鹽、苯磺酸、苯甲酸、對甲苯磺酸、樟腦磺酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、丙磺酸、富馬酸、葡糖酸、谷氨酸、羥乙磺酸、乳酸、馬來酸、蘋果酸、扁桃酸、粘酸、雙羥萘酸、泛酸、琥珀酸、酒石酸等的鹽。
無機酸鹽包括氫溴酸、氫氯酸、硝酸、硫酸、磷酸等的鹽。
有機堿鹽包括伯、仲和叔胺，被取代胺包括天然存在的取代胺、環胺和堿離子交換樹脂，選自甜菜堿、咖啡因、膽堿、n,n’-二芐基乙二胺、二乙胺、2-二乙胺基乙醇、2-二甲胺基乙醇、乙醇胺、乙二胺、n-乙基-嗎啉、n-乙基哌啶、葡甲胺、氨基葡萄糖、海巴明、異丙基胺、甲基葡糖胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、普魯卡因、嘌呤、可可堿、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等的鹽。天然氨基酸鹽如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、酪氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、組氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸等的鹽。
無機堿鹽包括銨以及鋰、鈉、鉀、鈣、鎂、鋅、鋇、鋁、鐵、酮、亞鐵、錳、二價錳等的鹽。
本發明式(i)化合物的“酯”是指，當式(i)化合物存在羧基時，可以與醇發生酯化反應而形成的酯，當式(i)化合物存在羥基時，可以與有機酸、無機酸、有機酸鹽等發生酯化反應而形成的酯。酯在酸或者堿存在的條件下，可以發生水解反應生成相應的酸或醇。
通式(i)所示的化合物、其藥學上可接受的鹽、酯或其立體異構體可以是溶劑化物形式。若溶劑化物是水合物的情況下，水合作用可以在制備過程中完成或者可以利用原始無水產物的吸濕性逐漸進行。
本發明進一步要求保護包括上述的式(i)所示的任一化合物、其藥學上可接受的鹽、酯、溶劑化物或其立體異構體與一種或多種藥用載體和/或稀釋劑的藥物組合物，可以制成藥學上可接受的任一劑型。如片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、口服溶液劑、口服混懸劑、糖漿劑、注射液、注射用無菌粉末、注射用濃溶液、栓劑、吸入劑或噴霧劑等。
本發明所述的“載體”包括但不限于填充劑、稀釋劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、表面活性劑、防腐劑、著色劑、矯味劑、芳香劑、泡騰劑、乳化劑、絮凝劑、反絮凝劑、抑菌劑、增溶劑。
本發明進一步要求保護包括上面所述的式(i)任一化合物、其藥學上可接受的鹽、酯、溶劑化物或其立體異構體與其它一種或多種抗腫瘤劑和/或免疫抑制劑的藥物組合物。所述的抗腫瘤劑和/或免疫抑制劑為抗代謝物，包括但不限于卡培他濱、吉西他濱、培美曲塞二鈉；為生長因子抑制劑，包括但不限于帕唑帕尼、伊馬替尼、埃羅替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼；為抗體，包括但不限于赫賽汀、貝伐單抗；為有絲分裂抑制劑，選自紫杉醇、長春瑞濱、多西他賽、多柔比星；為抗腫瘤激素類，包括但不限于來曲唑、他莫西芬、氟維司群、氟他胺、曲普瑞林；為烷化劑類，包括但不限于環磷酰胺、氮芥、馬法蘭、瘤可寧、卡莫司汀；為金屬鉑類，包括但不限于卡鉑、順鉑、奧沙利鉑；為拓撲異構酶抑制劑，包括但不限于拓撲特肯喜樹堿、拓撲替康、依立替康；為免疫抑制類，包括但不限于依維莫司、西羅莫司、特癌適；為嘌呤類似物，包括但不限于6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、硫唑嘌呤；為抗生素類，包括但不限于菌素d、柔紅霉素、阿霉素、米托蒽醌、博來霉素、普卡霉素；為腎上腺皮質抑制劑類，包括但不限于氨魯米特、地塞米松；為組蛋白去乙酰化酶抑制劑，包括但不限于伏立諾他。
本發明還提供了本發明式(i)所示的化合物、其藥學上可接受的鹽、酯、溶劑化物或其立體異構體在制備治療和/或預防端錨聚合酶介導的癌癥或相關疾病的藥物中的應用，所述癌癥相關的疾病包括但不限于腦癌，肺癌，非小細胞性肺癌，鱗狀上皮細胞癌，膀胱癌，胃癌，卵巢癌，腹膜癌，胰腺癌，乳腺癌，頭頸癌，子宮頸癌，子宮內膜癌，直腸癌，肝癌，腎癌，食管腺癌，食管鱗狀細胞癌，實體瘤，前列腺癌，甲狀腺癌，雌性生殖道癌，原位癌，淋巴瘤，神經纖維瘤，骨癌，皮膚癌，腦癌、結腸癌，睪丸癌，小細胞肺癌，胃腸道間質瘤，前列腺腫瘤，肥大細胞腫瘤，多發性骨髓瘤，黑色素瘤，膠質瘤，肉瘤，膠質母細胞瘤，星形細胞瘤，神經母細胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，腦瘤，中樞神經系統腫瘤，神經膠質瘤，多形性膠質母細胞瘤，膠質肉瘤，組織細胞淋巴瘤；所述的相關疾病，包括但不限于阿爾茲海默癥、骨質疏松癥、皮膚病、心血管疾病、ii型糖尿病。
本發明化合物具有以下優點：
(1)本發明式(i)化合物、其藥學上可接受的鹽、酯、溶劑化物或其立體異構體具有優異的端錨聚合酶抑制活性；
(2)本發明式(i)化合物、其藥學上可接受的鹽、酯、溶劑化物或其立體異構體顯示出良好的生物穩定性，作用更持久，生物利用度高；
(3)本發明化合物制備工藝簡單，藥品純度高，質量穩定，易于進行大規模工業生產。
以下通過生物學實驗進一步闡述本發明化合物有益效果，但不應將此理解為本發明化合物僅具有下列有益效果。
下述中實驗的縮寫所代表的含義如下：
adp：腺苷二磷酸；parp：多聚adp-核糖聚合酶
tnks：端錨聚合酶；dmso：二甲基亞砜
tween-20：吐溫-20；fbs：胎牛血清
p/s：青-鏈霉素；cck-8：細胞增殖-毒性檢測試劑盒
1×、5×其中的“×”：倍
實驗例1本發明化合物的體外酶學活性實驗
供試品：本發明化合物1，化合物2的三氟乙酸鹽，其化學名稱和制備方法見化合物的制備實施例。
(一)供試品配制
化合物10mm儲備液的配制：分別稱取供試品適量(具體稱樣量請見下表)，加入適量dmso溶解，混勻，備用。
分別取10mm的儲備液，用dmso稀釋成濃度為1mm的溶液，作為母液。用dmso將上述母液10倍逐級稀釋制成一系列濃度的溶液，然后分別用水稀釋10倍，制成含
10％dmso的溶液，濃度分別為：100μm、10μm、1μm、0.1μm。
(二)實驗方法
1.配制ph7.4的1×pbs
2.配制pbst(1×pbs，含0.05％tween-20)
向燒杯中加入約200ml的1×pbs(ph7.4)，然后加入100μltween-20，混勻，即得pbst。
3.激酶反應
3.1包被組氨酸至96孔板
3.1.1用1×pbs稀釋5×組氨酸混合液1:5，每孔加入50μl1×組氨酸，4℃過夜；
3.1.2每孔用200μlpbst洗3次，每次用干凈的紙巾吸凈；
3.1.3每孔加入150μl封閉液，室溫孵育60-90min；
3.1.4每孔用200μlpbst洗3次，每次用干凈的紙巾吸凈。
3.2核糖基化反應
3.2.1.激酶在冰上融化，用前將激酶用1×parp分析緩沖液稀釋至說明書建議濃度，一直置于冰上，稀釋后不能重復利用；
3.2.2按說明書依次加入各反應液及化合物后室溫孵育1h；
3.2.3移棄反應液，200μlpbst洗三次，每次用干凈的紙巾吸凈。
3.3檢測
3.3.1streptavidin-hrp用封閉液稀釋50倍；
3.3.2每孔加入50μl稀釋的streptavidin-hrp，室溫孵育30min；
3.3.3每孔用200μlpbst洗三次，每次用干凈的紙巾吸凈；
3.3.4用前將hrp化學發光底物a和b各50μl冰上混勻，每孔加入100μl；
3.3.5酶標儀讀數。
4.計算公式
抑制率％＝[1-(t-p)/(p-b)]*100％
其中p是指陽性對照孔的化學發光讀數，b是指空白孔的化學發光讀數。t是指待測化合物孔的化學發光讀數。
(三)結果與結論：
表1.各個激酶酶學評價結果
由表1可見：本發明化合物對tnks1/2有較高的抑制活性，化合物1的ic50小于10nm，化合物2的ic50小于100nm，同時檢測本發明化合物對parp1/2的抑制作用，顯示ic50均大于1000nm。說明本發明化合物針對tnks1/2具有較高的選擇性。
具體實施方式
以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下實施例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
實施例12-(4-(6-(3,5-二甲基哌嗪-1-基)-4-甲基吡啶-3-基)苯基)-3,5,7,8-四氫-4h-吡喃并[4,3-d]嘧啶-4-酮(化合物1)的制備
(1)4-氧代四氫-2h-吡喃-3-羧酸甲酯的制備
25℃下將氫化鈉(質量分數60％,10.0g,250mmol)緩慢加入到四氫呋喃(300ml)中，加料完畢后加入四氫-4h-吡喃-4-酮(10.0g,100mmol)和碳酸二甲酯(21ml,250mmol)。升溫至45℃攪拌反應16小時。lc-ms檢測反應完全，抽濾，濾液用1mol/l鹽酸調節ph＝7后乙醚(500ml)萃取，分液，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮，粗品經硅膠柱層析(石油醚:乙酸乙酯＝50:1)純化得標題化合物(3.0g,產率19.0％)。
(2)2-(4-溴苯基)-3,5,7,8-四氫-4h-吡喃并[4,3-d]嘧啶-4-酮的制備
將4-氧代四氫-2h-吡喃-3-羧酸甲酯(564mg,3.57mmol)、4-溴苯甲脒鹽酸鹽(1.01g,4.28mmol)和碳酸鉀(985.3mg,7.14mmol)加入到甲醇(40ml)中，氮氣保護下升溫至85℃反應4小時，tlc檢測反應完全，降溫至0℃，有白色固體析出，抽濾，濾餅真空干燥得標題化合物(700mg,產率63.6％)。
(3)2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼雜環戊烷-2-基)苯基)-3,5,7,8-四氫-4h-吡喃并[4,3-d]嘧啶-4-酮的制備
將2-(4-溴苯基)-3,5,7,8-四氫-4h-吡喃并[4,3-d]嘧啶-4-酮(307.2mg,1.0mmol)和聯硼酸頻那醇酯(254mg,1.0mmol)加入到1,4-二氧六環(30ml)中，氮氣保護下加入醋酸鉀(196mg,2.0mmol)和四(三苯基膦)鈀(115.5mg,0.1mmol)，加料完畢后升溫至110℃反應6小時。lc-ms檢測反應完全，反應液真空直接濃縮，粗品經硅膠柱層析(二氯甲烷:甲醇＝20:1)純化得標題化合物(181mg,產率51.1％)。
(4)1-(5-溴-4-甲基吡啶-2-基)-3,5-二甲基哌嗪的制備
將5-溴-2-氯-4-甲基吡啶(10.0g,48.4mmol)、2,6-二甲基哌嗪(16.6g,145.6mmol)和n,n-二異丙基乙胺(6.24g,48.4mmol)加入到二甲基亞砜(100ml)中，100℃反應16小時。體系加入乙酸乙酯(200ml)和水(100ml)，分液，有機相用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮得到標題化合物(12.0g,產率87.3％)。
(5)2-(4-(6-(3,5-二甲基哌嗪-1-基)-4-甲基吡啶-3-基)苯基)-3,5,7,8-四氫-4h-吡喃并[4,3-d]嘧啶-4-酮的制備
將2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼雜環戊烷-2-基)苯基)-3,5,7,8-四氫-4h-吡喃并[4,3-d]嘧啶-4-酮(181mg,0.51mmol)、1-(5-溴-4-甲基吡啶-2-基)-3,5-二甲基哌嗪(145mg,0.51mmol)和碳酸鈉(108mg,1.02mmol)加入到1,4-二氧六環(10ml)和水(2ml)的混合溶劑中，氮氣保護下加入[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡合物(42mg,0.05mmol)，升溫至100℃反應6小時。反應液直接濃縮，粗品經硅膠柱層析(二氯甲烷:甲醇＝15:1)得標題化合物(25mg,產率11.4％)。
分子式：c25h29n5o2分子量：431.54lc-ms(m/z)：432.3(m+h+)
1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.15(s,2h),8.00(s,1h),7.49(s,2h),6.94(s,1h),4.51-4.00(m,4h),3.95-3.85(m,2h),2.83-2.72(m,2h),2.69-2.62(m,2h),2.25(s,3h),2.03-1.94(m,1h),1.32-1.18(m,9h).
實施例25-(4-(6-(3,5-二甲基哌嗪-1-基)-4-甲基吡啶-3-基)苯基)-1,6-二氫-7h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮(化合物2)三氟乙酸鹽的制備
(1)1-(5-溴-4-甲基吡啶-2-基)-3,5-二甲基哌嗪的制備
將5-溴-2-氯-4-甲基吡啶(10.0g,48.4mmol)、2,6-二甲基哌嗪(16.6g,145.6mmol)和n,n-二異丙基乙胺(6.24g,48.4mmol)加入到二甲基亞砜(100ml)中，100℃反應16小時。體系加入乙酸乙酯(200ml)和水(100ml)，分液，有機相用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮得到標題化合物(12.0g,產率87.3％)。
(2)甲基4-硝基-1h-吡唑-3-羧酸酯的制備
將4-硝基-1h-吡唑-3-羧酸(20.0g,0.127mmol)溶于甲醇(100ml)中，加入二氯亞砜(18.1g,0.152mmol)，25℃下反應2小時，加熱至60℃，反應2小時。反應液真空濃縮，加入甲基叔丁基醚(80ml)，過濾得白色固體，真空干燥得產物(20.0g,產率92.1％)。
(3)甲基1-(4-甲氧基芐基)-4-硝基-1h-吡唑-5-羧酸酯的制備
將甲基4-硝基-1h-吡唑-3-羧酸酯(20.0g,0.117mmol)和碳酸鉀(32.3g,0.234mmol)加入到乙腈(200ml)中，0℃滴加4-甲氧基芐氯(21.9g,0.14mmol)，滴加完畢25℃反應16小時。反應液真空濃縮，粗品經硅膠柱層析(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)純化得標題化合物(20.5g,產率60.2％)。
(4)甲基4-氨基-1-(4-甲氧基芐基)-1h-吡唑-5-羧酸酯的制備
將甲基1-(4-甲氧基芐基)-4硝基-1h-吡唑-5-羧酸酯(20.5g,70.4mmol)、氯化銨(5.65g,105.6mmol)和鐵粉(19.7g,352mmol)加入到乙醇(300ml)和水(100ml)組成的混合溶液中，加熱至85℃反應3小時。冷卻，過濾，濾液濃縮至約200ml，加入水(200ml)，乙酸乙酯(500ml×2)萃取，合并有機相，飽和食鹽水(300ml)洗，無水硫酸鈉干燥，真空濃縮得標題化合物(17.5g,產率95.2％)。
(5)5-(4-溴苯基)-1-(4-甲氧基芐基)-1,6-二氫-7h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮的制備
將甲基4-氨基-1-(4-甲氧基芐基)-1h-吡唑-5-羧酸酯(6.0g,23.0mmol)和4-溴苯腈(12.8g,69.0mmol)溶于氯化氫的1,4-二氧六環溶液(4mol/l,100ml)中，110℃下反應24小時。真空濃縮，粗品經硅膠柱層析(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)純化得到產物(1.5g,產率15.9％)。
(6)1-(4-甲氧基芐基)-5-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼雜環戊烷-2-基)苯基)-1,6-二氫-7h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮的制備
將5-(4-溴苯基)-1-(4-甲氧基芐基)-1,6-二氫-7h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮(1.0g,2.4mmol)、聯硼酸頻那醇酯(742mg,2.9mmol)、乙酸鉀(470mg,4.8mmol)和四(三苯基膦)鈀(139mg,0.12mmol)加入到1,4-二氧六環(50ml)中，氮氣保護下100℃下反應14小時。體系真空濃縮，粗品經硅膠柱層析(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)純化得到標題化合物(600mg,產率54.6％)。
(7)5-(4-(6-(3,5-二甲基哌嗪-1-基)-4-甲基吡啶-3-基)苯基)-1-(4-甲氧基芐基)-1,6-二氫-7h-吡唑[4,3-d]嘧啶-7-酮的制備
將1-(4-甲氧基芐基)-5-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼雜環戊烷-2-基)苯基)-1,6-二氫-7h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮(400mg,0.87mmol)、1-(5-溴-4-甲基吡啶-2-基)-3,5-二甲基哌嗪(258mg,0.91mmol)、碳酸鈉(184mg,1.74mmol)和[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡合物(73mg,0.09mmol)加入到1,4-二氧六環(40ml)和水(4ml)中，氮氣保護下90℃下反應12小時。體系真空濃縮，粗品經硅膠柱層析(二氯甲烷:甲醇＝30:1)純化得產物(300mg,產率64.3％)。
(8)5-(4-(6-(3,5-二甲基哌嗪-1-基)-4-甲基吡啶-3-基)苯基)-1,6-二氫-7h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮三氟乙酸鹽的制備
將5-(4-(6-(3,5-二甲基哌嗪-1-基)-4-甲基吡啶-3-基)苯基)-1-(4-甲氧基芐基)-1,6-二氫-7h-吡唑[4,3-d]嘧啶-7-酮(300mg,0.56mmol)溶于三氟乙酸(20ml)中，加入催化量的苯甲醚，90℃下反應12小時。體系真空濃縮，粗品經硅膠柱層析(二氯甲烷:甲醇＝20:1)得終產物(200mg,產率55.5％)。
分子式：c23h25n7o分子量：415.5lc-ms(m/z)：416.2(m+h+)
1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.06-9.02(m,1h),8.51-8.42(m,1h),8.21-8.12(m,3h),8.02(s,1h),7.48-7.46(m,2h),6.97(s,2h),4.53-4.45(m,2h),3.37-3.28(m,2h),2.80-2.72(m,2h),2.26(s,3h),1.28-1.21(m,6h)。