石松生物堿類化合物，其藥物組合物及其制備方法和用途與流程

本發明屬于藥物技術領域，具體地涉及一類新穎骨架石松生物堿類化合物phleghenrines A-D及其類似物，其藥學上可接受的鹽，其制備方法，含有該類化合物的藥物組合物及植物提取物，以及該類化合物及其藥物組合物和提取物在制備抗乙酰膽堿酯酶抑制劑藥物中、在制備治療早老性癡呆癥藥物中和制備抗中老年記憶和認知能力減退疾病藥物中的應用。

背景技術：
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老年性癡呆癥是一種神經退行性的疾病，隨著世界人口老年化的不斷加劇，老年性癡呆癥的發病率也在逐年增加。阿爾茨海默病又稱早老性癡呆病(Alzheimer’s Disease，AD)是老年性癡呆病的一種主要類型，在老年癡呆病患者中約有60～80％屬于該類型；在65～69歲的老年人口中AD的發病率約為11％，85歲以上的患病率為32％，而且仍在增長之中，且患病者有年輕化趨勢；其主要癥狀為患者的腦功能逐漸衰退，記憶力、抽象思維能力和語言表達能力減退、行動不便和其他功能性障礙，嚴重危害老年人的健康和生活質量，嚴重的可導致死亡；不僅給患者家庭且給社會帶來諸多問題。

AD的發病機理復雜，引起AD的真正病因至今仍然沒有信服的結論。然而大量的研究結果表明，AD與中樞神經系統或外周神經系統的乙酰膽堿(AChE)濃度過低有關，乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEI)可以通過抑制乙酰膽堿酯酶對乙酰膽堿的降解從而達到提高中樞神經或外周神經系統的乙酰膽堿的濃度，進而實現對上述疾病的改善和治療，因此開發具有增強膽堿系統功能的藥物仍然成為當今治療AD的研究重點之一，并被認為是至今治療AD最有效的藥物。

石松生物堿是指從蕨類植物石松及其近緣親屬植物中分離得到的結構相似，具有相同生源的一類結構獨特且變化多樣的天然生物堿。1982年中國科學院上海藥物研究所、軍事醫學科學院和浙江醫學科學院等單位，從蛇足石杉(Huperizia sererata(Thunb.)Trev.)中分離到高活性的乙酰膽堿酯酶抑制劑石杉堿甲，20世紀80年代石杉堿甲在我國批準上市，用于治療重癥肌無力，90年代又用于治療AD。石杉堿甲與現行的治療該類疾病的處方藥如多萘哌齊(donepezil)，加蘭他敏(galantamine)，利斯的明(rivastigmine)和他克林(tacrine)相比在藥效，生物利用度，半衰期，和乙酰膽堿酯酶選擇性等方面均有優勢。石杉堿甲的強效，高選擇性的抗乙酰膽堿酯酶活性引起了世界各國科學家的廣泛注意，是我國獨立自主發現的具有國際影響的天然先導化合物。其成功開發使我們看到從天然產物中，特別是從石松類植物中尋找新型乙酰膽堿酯酶抑制劑治療AD的希望。現有技術中未見有一類新穎骨架石松生物堿類化合物phleghenrines A-D及其類似物，其藥學上可接受的鹽的報道，也沒有其制備方法，含有該類化合物的藥物組合物及植物提取物，以及該類化合物及其藥物組合物和提取物在制備抗乙酰膽堿酯酶抑制劑藥物中、在制備治療早老性癡呆癥藥物中和制備抗中老年記憶和認知能力減退疾病藥物中的應用的報道。

技術實現要素：
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本發明的目的在于提供一類新穎骨架石松生物堿類化合物phleghenrines A-D及其類似物，其藥學上可接受的鹽，其制備方法，含有該類化合物的藥物組合物及植物提取物，以及該類化合物及其藥物組合物和提取物在制備抗乙酰膽堿酯酶抑制劑的藥物中、在制備治療早老性癡呆癥的藥物中和制備抗中老年記憶和認知能力減退疾病的藥物中的應用。

為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：

如下結構式(I)所示的石松生物堿類化合物或其藥用鹽，

式中，R₁＝氫、芳基、取代芳基、烷基或取代烷基；R₂＝氫、羥基或鹵原子；R₃＝氫、芳基、取代芳基、烷基或取代烷基；R₄＝氫、羥基或鹵原子，

n＝0～4的整數。

如下結構式所示的石松生物堿類化合物1-4或其藥用鹽，

如所述的石松生物堿類化合物或其藥用鹽，其中所述的藥用鹽是指與有機酸或無機酸形成的藥學上可接受的鹽，所述的有機酸為酒石酸、檸檬酸、甲酸、乙酸、乙二酸、丙酸、丁酸、草酸、馬來酸、己二酸、藻酸、檸檬酸、天冬氨酸、苯磺酸、樟腦酸、樟腦磺酸、二葡糖酸、環戊烷丙酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、半硫酸、庚酸、己酸、延胡索酸、2-羥基乙磺酸、乳酸、甲磺酸、煙酸、2-萘磺酸、撲酸，果膠酯酸、3-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、琥珀酸，所述的無機酸為鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸或磷酸。

本發明還提供了制備所述的石松生物堿類化合物的方法，取石松科馬尾杉屬植物全草，經干燥、粉碎后，用70％乙醇/水加熱回流充分提取；將提取浸膏加入1％鹽酸/水溶液混懸后，其水溶性部分用飽和碳酸鈉水溶液調節pH值到9，然后用氯仿充分萃取；氯仿部分反復用硅膠、Sephadex LH-20、RP-18及高效液相色譜法HPLC分離純化方法，再結合生物堿TLC檢測方法得石松生物堿類化合物1-4。

以及更具體的制備所述的石松生物堿類化合物的方法，取橢圓馬尾杉干燥全草，粉碎后用70％工業乙醇/水混合溶劑60L加熱回流提取，共提取三次，第一次4小時，后兩次每次3小時，合并提取液，減壓蒸餾濃縮除去有機溶劑后得浸膏，將該粗提物分配于1％鹽酸水溶液中，pH＝1，10L，用離心機分層，除去下層不溶物，再將上層水溶液用乙酸乙酯萃取三次，每次8L，以除去大部分非生物堿成分；萃取后的水溶性部分用飽和碳酸鈉溶液調節pH值到9，然后用氯仿充分萃取五次，每次8L，得到總的生物堿浸膏，將該浸膏用50目聚酰胺，拌樣，晾干后裝柱，層析柱則選用MCI反相柱，連接中壓液相色譜儀，選用甲醇∶水＝1∶9，3∶7，6∶4，8∶2，1∶0梯度洗脫，每個梯度洗脫2L，每250ml接收一個流份，各流份經減壓蒸餾濃縮后，經TLC氯仿∶甲醇＝9∶1和乙酸乙酯∶甲醇＝8∶2檢識，根據主斑點予以合并，得到五個組分Fr.01-05；Fr.02經硅膠柱200-300目層析，洗脫系統為氯仿∶甲醇＝9∶1，8.5∶1.5，8∶2，7∶3，6∶4，1∶1，經TLC氯仿∶甲醇＝8∶2檢識，根據主斑點予以合并，得到四個組分Fr.0201-Fr.0204；Fr.0203經硅膠柱200-300目層析，依次用氯仿∶甲醇＝9∶1和乙酸乙酯∶甲醇體系＝8∶2為洗脫劑得到3，Fr.0204，經Sephadex LH-20凝膠柱純甲醇體系層析得到兩個組分Fr.020401和Fr.020402；Fr.020402經乙酸乙酯∶甲醇∶二乙胺＝6∶1∶2硅膠柱層析，最后應用制備型高效液相色譜，洗脫條件為甲醇∶含0.5％的三氟乙酸水緩沖液＝22∶100，10ml/min，分離得到化合物2和1，Fr.03經硅膠柱層析，以氯仿∶甲醇＝8∶1，7∶1，6∶1，4∶1，2∶1，1∶1梯度洗脫，經TLC氯仿∶甲醇＝5∶1檢識，根據主斑點予以合并，得到五個組分Fr.0301-Fr.0305，Fr.030103經硅膠柱層析，依次用乙酸乙酯∶甲醇＝7∶3和氯仿∶甲醇＝9∶1為洗脫劑，得到化合物4。

本發明同時還提供了一種藥物組合物，含有所述的石松生物堿類化合物1-4及其類似物中的一種或其藥用鹽，以及藥學上可以接受的載體。

根據所述的藥物組合物，所述的藥物組合物為片劑、膠囊、丸劑、注射劑、緩釋制劑、控釋制劑。

根據所述的藥物組合物，所述的藥物組合物為微粒給藥系統。

本發明另外還提供了所述的石松生物堿類化合物及其類似物或其藥學上可接受的鹽在制備早老性癡呆癥的藥物中的應用。

以及，所述的石松生物堿類化合物及其類似物或其藥學上可接受的鹽在制備抗中老年記憶和認知能力減退疾病的藥物中的應用。

以及，所述的石松生物堿類化合物及其類似物或其藥學上可接受的鹽在制備乙酰膽堿酯酶抑制劑的藥物中的應用。

石松生物堿是從蕨類植物石松及其近緣親屬植物中分離得到的結構相似，具有相同生源的一類結構獨特且變化多樣的天然生物堿。優選結構式1-4為具有新穎(6/6/7/6)環系骨架的一類石松生物堿。本發明的石松生物堿，優選化合物phleghenrines A-D(1-4)。

本發明對石松科馬尾杉屬植物橢圓馬尾杉中的石松生物堿類成分進行系統的研究，利用多種分離純化手段，包括正相硅膠柱層析，反相中壓或者高壓液相色譜等方法，從中獲得了一系列具有新穎(6/6/7/6)環系骨架的石松類生物堿化合物。之后，對分離得到的該類化合物進行抗乙酰膽堿酯酶(AChE)和抗丁酰膽堿酯酶(BChE)抑制活性篩選。發現化合物phleghenrines A-D(1-4)均顯示出明顯的抑制乙酰膽堿酯酶活性，為新的植物來源的抑制乙酰膽堿酯酶抑制化合物，可用于制備乙酰膽堿酯酶抑制劑、早老性癡呆癥藥物及抗老年記憶和認知能力減退疾病藥物。

本發明的所述石松生物堿類化合物phleghenrines A-D(1-4)及其類似物或其藥學上容許的鹽，可以列舉例如與鹽酸、硝酸、硫酸、磷酸、氫溴酸等無機酸，或者馬來酸、富馬酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、甲磺酸、對-苯甲磺酸、己二酸、棕櫚酸、單寧酸等有機酸，鋰，鈉、鉀等堿金屬，鈣、鎂等堿土金屬，賴氨酸等堿性氨基酸成的鹽。

本發明所述的治療早老性癡呆癥及老年記憶和認知能力減退相關疾病的藥物組合物，由石松生物堿類化合物phleghenrines A-D(1-4)及其類似物與藥學上可接受的載體制備的藥物劑型包括片劑、膠囊、口服液、針劑、注射用凍干劑或粉針劑等。由于石松生物堿可從橢圓馬尾杉以及同屬植物中提取分離，而片劑、膠囊、口服液、針劑、注射用凍干劑或粉針劑等藥物劑型的制備也是本領域的常規知識。因此，由石松生物堿類型化合物與相應載體制備的各種藥物劑型也能夠由本領域技術人員實現。

上文中所述的藥學上可接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體，例如：稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等；黏合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂黏土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂、以及聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。

本發明化合物可以以組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其制成常規的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其他液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。本發明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學領域的常規生產方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。

本發明的藥物組合物優選含有重量比為0.1％～99.5％的活性成分，最優選含有重量比為0.5％～95％的活性成分。

本發明化合物的施用量可根據用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴重程度等變化，其日劑量可以是0.01～10mg/kg體重，優選0.1～5mg/kg體重。可以一次或多次施用。

附圖說明：

圖1為為本發明石松生物堿類化合物的結構示意圖；

圖2為本發明石松生物堿類化合物phleghenrines A-D(1-4)的結構示意圖；

圖3為本發明的石松生物堿類化合物phleghenrines A-D(1-4)的制備方法流程圖。

具體實施方式：

下面結合附圖，用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此來限定本發明。根據本發明的實質對本發明進行的改進都屬于本發明的范圍。

實施例1：

石松生物堿類化合物phleghenrines A-D(1-4)的制備方法及結構鑒定：

取橢圓馬尾杉(Phlegmariurus henryi(Baker)Ching)干燥全草4.8Kg，粉碎后用70％工業乙醇/水混合溶劑(60L)加熱回流提取，共提取三次，第一次4小時，后兩次每次3小時，合并提取液，減壓蒸餾濃縮除去有機溶劑后得浸膏共1.2Kg，將該粗提物分配于1％鹽酸水溶液中(pH＝1，10L)，用離心機分層，除去下層不溶物(650g)，再將上層水溶液用乙酸乙酯萃取三次，每次8L，以除去大部分非生物堿成分。萃取后的水溶性部分用飽和碳酸鈉溶液調節pH值到9，然后用氯仿充分萃取五次，每次8L，得到總的生物堿浸膏8.2g。將該浸膏用50目聚酰胺(20g)拌樣，晾干后裝柱，層析柱則選用MCI反相柱。連接中壓液相色譜儀，選用甲醇∶水＝1∶9，3∶7，6∶4，8∶2，1∶0梯度洗脫，每個梯度洗脫2L，每250ml接收一個流份，各流份經減壓蒸餾濃縮后，經TLC(氯仿∶甲醇＝9∶1和乙酸乙酯∶甲醇＝8∶2)檢識，根據主斑點予以合并，得到五個組分(Fr.01-05)。Fr.02(2.4g)經硅膠柱(200-300目)層析，洗脫系統為氯仿∶甲醇＝9∶1，8.5∶1.5，8∶2，7∶3，6∶4，1∶1，經TLC(氯仿∶甲醇＝8∶2)檢識，根據主斑點予以合并，得到四個組分(Fr.0201-Fr.0204)。Fr.0203(200mg)經硅膠柱(200-300目)層析，依次用氯仿∶甲醇＝9∶1和乙酸乙酯∶甲醇體系＝8∶2為洗脫劑得到3(2.5mg)。Fr.0204(430mg)經SephadexLH-20凝膠柱(純甲醇體系)層析得到兩個組分Fr.020401和Fr.020402；Fr.020402(200mg)經乙酸乙酯∶甲醇∶二乙胺＝6∶1∶2硅膠柱層析，最后應用制備型高效液相色譜Agilent 1200，洗脫條件為(甲醇∶含0.5％的三氟乙酸水緩沖液＝22∶100，10ml/min)分離得到化合物2(t_R5.8min，12mg)和1(t_R13.8min，10mg)。Fr.03(1.82g)經硅膠柱層析，以氯仿∶甲醇＝8∶1，7∶1，6∶1，4∶1，2∶1，1∶1)梯度洗脫，經TLC(氯仿∶甲醇＝5∶1)檢識，根據主斑點予以合并，得到五個組分(Fr.0301-Fr.0305)。Fr.030103(200mg)經硅膠柱層析，依次用乙酸乙酯∶甲醇＝7∶3和氯仿∶甲醇＝9∶1為洗脫劑得到化合物4(3.5mg)。

Phleghenrines A-D(1-4)的結構鑒定數據為：

Phleghenrine A(1)：colorless gum；UV(MeOH)λ_max(log ε)315(2.86)，236(2.98)，203(2.98)nm；¹H and¹³C NMR數據，見表1；positive ESIMS m/z 257[M+H]⁺；HREIMS m/z 256.1562[M]⁺(calcd for C₁₆H₂₀N₂O，256.1576).

Phleghenrine B(2)：colorless gum；UV(MeOH)λ_max(log ε)318(3.10)，238(3.22)，204(3.26)nm；¹H and¹³C NMR數據，見表1；positive ESIMS m/z 257[M+H]⁺；HREIMS m/z 256.1570[M]⁺(calcd for C₁₆H₂₀N₂O，256.1576).

Phleghenrine C(3)：colorless gum；UV(MeOH)λ_max(log ε)257(2.85)，203(2.80)nm；¹H and¹³C NMR數據，見表1；positive ESIMS m/z259[M+H]⁺；HREIMS m/z 258.1723[M]⁺(calcd for C₁₆H₂₂N₂O，258.1732).

Phleghenrine D(4)：colorless gum；UV(MeOH)λ_max(log ε)320(3.07)，270(2.96)，238(3.14)，204(3.31)nm；¹H and¹³C NMR數據，見表2；positive ESIMS m/z 251[M+H]⁺；HREIMS m/z 250.1113[M]⁺(calcd for C₁₆H₁₄N₂O，250.1106).

表1.化合物1-3在氘代甲醇中的¹H(600MHz)和¹³C(150MHz)NMR數據(δ in ppm，J in Hz).

表2.化合物4在氘代氯仿中的¹H(600MHz)和¹³C(150MHz)NMR數據(δ in ppm，J in Hz)

實施例2：

本發明石松科石松生物堿類化合物phleghenrines A-D(1-4)在抑制乙酰膽堿酯酶顯示明顯的抑制活性。實驗原理、方法和結果如下：

實驗原理：乙酰膽堿酯酶能夠催化其底物類似物碘化硫代乙酰膽堿降解，生成硫代膽堿和乙酸，反應生成物與顯色劑DTNB反應生成黃色物質，在405nm處有特異光吸收。化合物與乙酰膽堿酯酶的混合液在30℃反應，如果化合物對乙酰膽堿酯酶有抑制作用，那么乙酰膽堿酯酶催化底物類似物碘化硫代乙酰膽堿降解的量就會減少，相應的與DTNB反應生成的黃色化合物減少，即在405nm處的光吸收值變小，以此來篩選具有抑制活性的化合物。

實驗方法：

(1)用磷酸鹽緩沖液(每100mL磷酸鹽緩沖液中含0.1M Na₂HPO₄溶液)94.7mL；0.1M NaH₂PO₄溶液5.3mL，調pH至8.0)將AChE稀釋成0.1U/mL工作液；

(2)碘化硫代乙酰膽堿和DTNB用磷酸鹽緩沖液配成6.25mM的等體積混合溶液(工作液)；

(3)化合物用DMSO稀釋成1mM工作液，保證不同濃度的化合物溶液中DMSO濃度相同(均為2％)，DMSO在最終反應體系中的終濃度為0.1％，化合物終濃度為50μM。陽性對照為他克林，濃度為6.66μM終濃度為0.333μM；陰性對照組(NC組)為2％DMSO溶劑對照。

(4)反應在96孔板中進行，向96孔板中依次加入下列試劑(加入試劑的體積為一個反應的體積)，每個樣品做3個重復；

鋪板：200μL/體系，每孔化合物的終濃度為50μM，他克林的終濃度為0.333μM

(5)加入顯色劑和底物后1小時內，每30秒鐘檢測一次405nm吸光值。

(6)選擇NC組吸光值平均值約為1小時的樣品吸光值，計算化合物吸光值平均值(化合物測定值-背景值)，并按照(NC-化合物吸光值平均值)/NC*100％來計算化合物AChE抑制率。

實驗結果：四個新化合物phleghenrines A-D(1-4)都對乙酰膽堿酯酶有抑制活性，IC₅₀值分別為4.91，20.50，25.58，和4.32μM，其中陽性對照物他克林(tacrine)的IC₅₀值為0.30μM。值得一提的是化合物4的結構相對比較簡單，且含有可供后續結構修飾的吡啶環，因此化合物4是一個優秀的、具有成藥前景的抗早老年癡呆疾病(AD)的先導化合物。

實施例3：

實施例1所得化合物1-4，加入4％的硫酸乙醇溶液，pH＝4，過濾，干燥，制成硫酸鹽化合物1-4。

實施例4：

實施例1所得化合物1-4，加入4％的鹽酸溶液，pH＝4，過濾，干燥，制成鹽酸鹽化合物1-4。

實施例5：

實施例1所得化合物1-4，加入4％的酒石酸溶液，pH＝4，過濾，干燥，制成酒石酸鹽化合物1-4。

實施例6：

實施例1所得化合物1-4，加入4％的檸檬酸溶液，pH＝4，過濾，干燥，制成檸檬酸鹽化合物1-4。

實施例7：

片劑：實施例1所得化合物1-4或實施例3-6所得的鹽10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸鎂5mg。

制備方法：將化合物或其鹽、乳糖和淀粉混和，用水均勻濕潤、把濕潤后的混合物過篩并干燥，再過篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片，每片重250mg，化合物含量為10mg。

實施例8：

安瓿劑：實施例1所得化合物1-4或實施例3-6所得的鹽2mg，氯化鈉10mg。

制備方法：將化合物或其鹽和氯化鈉溶解于適量的注射用水中，過濾所得溶液，在無菌條件下裝入安瓿瓶中。

實施例9：

注射用凍干劑：實施例1所得化合物1-4或實施例3-6所得的鹽10mg，碳酸氫鈉2mg，甘露醇252mg。

制備方法：將碳酸氫鈉、甘露醇，加注射用水溶解，加活性碳吸附30min除熱原，過濾除去活性碳，在濾液中加入化合物或其鹽，超聲處理使溶解，用1N鹽酸調節pH為5.0-7.0，微孔濾膜濾過，加注射用水，分裝，冷凍干燥，上塞，軋蓋，即得。

實施例10：

膠囊劑：實施例1所得化合物1-4或實施例3-6所得的鹽10mg，乳糖187mg，硬脂酸鎂3mg。

制備方法：將化合物或其鹽與助溶劑混和，過篩，均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊，每個膠囊重200mg，活性成分含量為10mg。