一種抗衰老益生菌制劑及制備方法與流程

本發明涉及一種生物制劑，尤其涉及一種抗衰老益生菌制劑及制備方法。

背景技術：

我國老齡化問題日漸嚴重，老年人口所占人口比重越來越大，尋找抗衰老活性物質并對其機理的探索成為當今應對老齡化問題的研究熱點。目前，多種天然產物的抗衰老活性已被證實，但是由于其來源單一、分離純化困難、且成本昂貴，難以得到大范圍的應用。益生菌作為一種潛在的抗衰老物質，來源廣泛、安全性相對高、且價格便宜，逐漸受到大眾歡迎。

益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，大量報道證實益生菌具有多種生理功效，益生菌可以改善腸道環境、調節菌群平衡、增強機體免疫力、緩解過敏癥狀等，目前有關益生菌的抗衰老功能的研究相對較少，主要集中在腸道菌群的調節、抗氧化、免疫調節等方面。

研究發現，人體從出生到衰老的過程中，腸道菌群發生動態變化，從幼兒到成年，乳桿菌、擬桿菌數量上升，雙歧桿菌數量略有下降，機體逐漸衰老進入老年后，雙歧桿菌、擬桿菌等菌群種類及數量明顯下降，而一些產腐敗的梭狀芽孢桿菌等兼性厭氧菌數量顯著上升，益生菌作為腸道菌群中對宿主有益的菌群可以調節腸道菌群平衡。有學者研究表明，腸道中的腐敗菌分解蛋白質及含硫化合物會產生硫化氫、生物胺等腐敗產物，這些腐敗產物被人體吸收后進入血液對大腦、肝臟等重要器官產生毒害作用，加速機體的衰老，但是腸道中的雙歧桿菌、乳酸菌等可以分解糖類，生成乙酸、乳酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸，顯著降低腸道中pH值，抑制腐敗菌的生長，延緩機體衰老。

一般認為隨著年齡的增長，自由基在機體中不斷積累，自由基使機體受到氧化損傷，人體的抗氧化防御系統的能力也逐漸下降，例如羥自由基與不飽和脂肪酸反應改變細胞膜的完整性，也會使DNA脫氧核糖遭到破壞，導致DNA損傷及細胞死亡，加速機體的衰老，為彌補抗氧化能力的損失，可以強化體內的抗氧化系統，同時也可以補充抗氧化物質，有研究發現一些乳酸菌中存在抗氧 化酶類，例如超氧化物歧化酶(SOD)、NADH氧化酶、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)等從而使其具有抗氧化活性，同時一些非酶類菌體成分以及代謝產物也可能具有抗氧化功能。

技術實現要素：

為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種通過對腸道菌群的調節、維持腸道菌群平衡、抑制有害菌的生長、從而延緩機體衰老的抗衰老益生菌制劑及制備方法。

本發明第一方面提供一種抗衰老益生菌制劑，包括有效量的長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90以及輔料，其中：

所述長雙歧桿菌BL21，已于2015年1月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.10452，分類命名為長雙岐桿菌（Bifidobacterium longum），保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；

所述植物乳桿菌Lp90，已于2015年1月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.10453，分類命名為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。

本發明使用的術語“有效量”是指這樣的活性劑的量：其足夠高以遞送希望的益處，但是足夠低以避免在醫學判斷范圍內的嚴重副作用。

具體的，所述輔料包括但不限于賦形劑、食品添加劑或益生元。

本發明第二方面提供一種如本發明第一方面提供的抗衰老益生菌制劑，在食品、保健品、以及藥品中的應用。

具體的，所述藥品包括有效量的組合物以及適當量的藥學上可接受的賦形劑，所述組合物包括長雙歧桿菌BL21和植物乳桿菌Lp90。

應當說明的是，所述藥品可以制備成任意合適的形式，所述形式不會不利地影響形成本發明的組合物的菌株的生物利用度。因而，本發明的組合物可以配制成以下述形式口服施用：例如，冷凍干燥的粉末、膠囊、片劑、液體制品等。考慮到組合物的具體目的，賦形劑和最適當的配制方法的選擇是在藥物技術領域的普通技術人員的知識范圍內。

本發明中所述的藥品，優選為粉劑、片劑或膠囊。

本文使用的術語“藥學上可接受的”是指這樣的化合物、物質、組合物和/ 或劑型：其在合理的醫學判斷范圍內，適用于接觸受試者(例如人)的組織，沒有過度的毒性、刺激、變應性應答或其它問題或并發癥，與合理的收益/風險比相稱。每種載體、賦形劑等還必須是“可接受的”，其含義是，與制劑的其它成分相容。合適的載體、賦形劑等可以參見標準的藥學教材。

本發明組合物中的菌株也可以被包含在多種食品中，諸如乳制品、酸乳、凝乳、干酪(例如quark、奶油、加工過的、軟的和硬的)、發酵乳、奶粉、基于奶的發酵的產品、冰淇淋、基于發酵的谷物的產品、基于奶的粉末、飲料、調味品和寵物食品。術語“食品”在本文中以它的最廣泛的含義使用，包括處于任意呈現形式的、可以被動物攝入的任意類型的產品，但是不包括藥用的和獸藥用的產品。其它可食用的產品的實例是肉制品(例如肝糊、香腸和意大利臘腸或肉糊)、巧克力糊、填充物(例如松露、乳油)和霜白狀糖覆、巧克力、糖果(例如焦糖糖果、軟糖或太妃糖)、烘焙食品(蛋糕、餡餅)、調味料和湯、果汁和咖啡白化劑。特別令人感興趣的食品是飲食添加物和嬰兒配方。從本發明的意義上而言，飲食添加物也包括營養制品，所述營養制品已知是對人健康具有醫療效果的食品提取物。用于動物食物的飼料也被包括在本發明的范圍內。本發明的組合物也可用作在其它食物產品中的成分。

具體的，所述食品或保健品包括組合物以及食品添加劑，所述組合物包括長雙歧桿菌BL21和植物乳桿菌Lp90，所述食品添加劑包括填充劑、矯味劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、抗酸劑、以及營養強化劑中的一種或多種。

具體的，所述填充劑包括淀粉、蔗糖、乳糖、微晶纖維素、三硅酸鎂、以及氫氧化鋁中的一種或多種；所述矯味劑為乳糖和/或蔗糖；所述崩解劑為淀粉；所述粘合劑為蔗糖；所述抗酸劑為三硅酸鎂和/或氫氧化鋁；所述潤滑劑為滑石粉；所述營養強化劑包括維生素、礦物質、益生元和/或膳食纖維。

本發明第三方面提供一種抗衰老益生菌制劑的制備方法，包括以下步驟：

S1、將長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90分別于試管中活化，得到一級種子液，再將一級種子液分別轉接至種子培養基中得到二級種子液，將二級種子液分別接入發酵培養基中進行高密度發酵，待發酵液中菌體密度達到10⁹cfu/mL，分別收集所述發酵液；

S2、將所述發酵液分別離心，收集菌體后加入保護劑乳化，真空冷凍干燥制得菌粉；

S3、將菌粉與輔料復配，混合均勻得到所述抗衰老益生菌制劑。

具體的，所述輔料為低聚糖。

具體的，所述種子培養基為MRS液體培養基，所述MRS液體培養基的pH值為6.5～6.8，所述MRS液體培養基以質量分數計包括：2％的乳糖、1％的蛋白胨、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸鈉、0.2％的檸檬酸氫二銨、0.2％的磷酸氫二鉀、0.06％的七水硫酸鎂、0.02％的一水硫酸錳、0.1％的L-半胱氨酸鹽、0.1％的吐溫-80、余量為水。

具體的，所述長雙歧桿菌BL21的發酵培養基的pH值為6.0～7.0，以質量分數計包括：1％的乳糖、1％的葡萄糖、1％的蛋白胨、0.5％的牛肉膏、1％的酵母膏、0.5％的乙酸鈉、0.2％的檸檬酸氫二銨、0.2％的磷酸氫二鉀、0.06％的七水硫酸鎂、0.02％的一水硫酸錳、0.1％的L-半胱氨酸鹽、余量為水。

具體的，所述植物乳桿菌Lp90發酵培養基的pH值為6.0～7.0，以質量分數計包括：2％的葡萄糖、1％的蛋白胨、1％的牛肉膏、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸鈉、0.2％的檸檬酸氫二銨、0.2％的磷酸氫二鉀、0.06％的七水硫酸鎂、0.02％的一水硫酸錳、0.1％的L-半胱氨酸鹽、余量為水。

具體的，所述二級種子液接至發酵培養基中的接種量為1％-5％。

具體的，所述種子的培養條件為28～40℃，厭氧培養8～24h，所述發酵培養條件為30～40℃，厭氧培養8～18h。

具體的，所述長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90二者比例為：2-5:2、或者2:1-4，所述抗衰老益生菌制劑中二者總活菌數不少于5×10⁹cfu/g。

借由上述方案，本發明至少具有以下優點：本發明的抗衰老益生菌制劑，其有效成分為長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90，研究結果表明該益生菌制劑耐受力強，抗氧化作用明顯，具有廣闊的市場前景，且本發明的益生菌制劑制備簡單，易于工業化生產。

上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術 手段，并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。

附圖說明

圖1是本發明中兩種菌株經酸化及膽鹽處理后的存活率結果圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

實施例一 抗衰老益生菌菌粉的制備

S1、將長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90分別于試管中活化，得到一級種子液，再將一級種子液分別轉接至種子培養基中得到二級種子液，培養條件為28～40℃，厭氧培養8～24h；將二級種子液分別接入發酵培養基中進行高密度發酵，二級種子液接至發酵培養基中的接種量為1％-5％，培養條件為30～40℃，厭氧培養8～18h，待發酵液中菌體密度達到10⁹，分別收集發酵液；

其中，種子培養基為MRS液體培養基，MRS液體培養基的pH值為6.5～6.8，MRS液體培養基以質量分數計包括：2％的乳糖、1％的蛋白胨、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸鈉、0.2％的檸檬酸氫二銨、0.2％的磷酸氫二鉀、0.06％的七水硫酸鎂、0.02％的一水硫酸錳、0.1％的L-半胱氨酸鹽、0.1％的吐溫-80、余量為水。

長雙歧桿菌BL21的發酵培養基的pH值為6.0～7.0，以質量分數計包括：1％的乳糖、1％的葡萄糖、1％的蛋白胨、0.5％的牛肉膏、1％的酵母膏、0.5％的乙酸鈉、0.2％的檸檬酸氫二銨、0.2％的磷酸氫二鉀、0.06％的七水硫酸鎂、0.02％的一水硫酸錳、0.1％的L-半胱氨酸鹽、余量為水。

植物乳桿菌Lp90發酵培養基的pH值為6.0～7.0，以質量分數計包括：2％的葡萄糖、1％的蛋白胨、1％的牛肉膏、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸鈉、0.2％的檸檬酸氫二銨、0.2％的磷酸氫二鉀、0.06％的七水硫酸鎂、0.02％的一水硫酸錳、0.1％的L-半胱氨酸鹽、余量為水。118℃滅菌20min。

S2、將所述發酵液分別離心，收集菌體后加入保護劑乳化，真空冷凍干燥制得菌粉。

實施例二 益生菌體外耐酸耐膽鹽能力測試

A、菌株耐酸能力測定

方法：將菌粉按照1％(w/v)的接種量接入模擬人工胃液中(pH＝2.5)處理3h，取樣進行平板菌落計數，以0時活菌數作為對照，計算菌株的存活率。

B、菌株耐膽鹽能力測定

方法：菌粉按照1％(w/v)的接種量接入模擬人工腸液中(膽鹽濃度0.3％)培養3h，取樣進行平板菌落計數，以0時活菌數作為對照，計算菌株的存活率。

結果如圖1所示，長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90經過酸化及膽鹽處理后，存活率均在60％以上，耐受能力較強。

實施例三 清除自由基能力與超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定

A、材料

SOD試劑盒，H₂O₂，FeSO₄，鄰苯三酚，O-菲羅啉及其他試劑均為分析純試劑。

B、方法

1)無細胞提取物的制備

2株菌株(長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90)在MRS培養基中37℃連續培養3代，8000r/min離心20min收集菌體，PBS緩沖液洗滌3次后重懸于PBS緩沖液中，活菌數調整在10¹⁰cfu/mL，冰浴并于超聲細胞破碎儀中破碎細胞，4℃條件下離心30min后收集上清液。

2)2株菌對超氧自由基(O₂^-)的清除能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化比色分析法，將濃度為150mmol/L、pH＝8.0的Tris-HCl緩沖液，以及3mmol/L二乙三胺五乙酸，1.2mmol/L的鄰苯三酚加入到1mL收集的上清液中，25℃恒溫反應10min，325nm下測定吸光值。

O₂^-清除率％＝(1-(A3-A1)/(A2-A0))×100％

其中，A3為含上清液及鄰苯三酚；A2為不含上清、含鄰苯三酚；A1為含上清、不含鄰苯三酚；A0為不含上清及鄰苯三酚

3)2株菌對羥自由基(HO·)清除能力的測定

2mL、pH為7.0的PBS緩沖液中加入2mLO-菲啰啉，以及2mL的濃度為2.5mmol/L的FeSO₄，20mmol/L的H₂O₂以及1mL的上清液，37℃恒溫反應1.5h，536nm處測吸光值。

HO·清除率(％)＝〔(A2-A1)/(A0-A1)〕×100％

其中，A0為不含上清和H₂O₂；A1為不含上清、含H₂O₂；A2為含上清和H₂O₂。

4)2株菌的超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定

用SOD試劑盒，按產品說明操作，定義每毫克蛋白在1mL反應液中SOD抑制率達50％時所對應的SOD量為一個SOD活力單位。

C、結果與分析

清除自由基能力及SOD活性測定結果如表1所示：

表1自由基清除率及SOD活性測定結果統計表

由表1可知，長雙歧桿菌BL21對超氧自由基清除率及羥自由基清除率都較好，植物乳桿菌Lp90對羥自由基清除能力較好，其中植物乳桿菌Lp90超氧化物歧化酶具有較好的活力，總體來說兩株菌的抗氧化活性較強。

實施例四 抗衰老益生菌制劑的制備

實驗步驟如下：

S1、長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90分別于種子培養基中37℃培養24h制備一代種子液。所得的一級種子液轉接入種子培養基中37℃培養16h制備二代種子液。

S2、二級種子液按照5％的接種量接入發酵培養基中進行高密度培養，37℃ 培養12h，發酵起始PH6.0-7.0，待發酵液活菌數達到10⁹cfu/mL，收集發酵液，離心獲得菌體。

S3、收集的菌體加入保護劑后凍干得到凍干菌粉，將長雙歧桿菌BL21：植物乳桿菌Lp90成比例進行復配，加入低聚糖混合均勻，制得抗衰老益生菌制劑。所得抗衰老益生菌制劑成品中兩株菌菌落總數不少于5×10⁹cfu/g。

按照長雙歧桿菌BL21：植物乳桿菌Lp90＝2:3比例進行復配，所得抗衰老益生菌制劑可以獲得較為均衡的清除超氧自由基能力、對羥自由基清除能力、以及超氧化物歧化酶活力。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，并不用于限制本發明，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發明的保護范圍。