一株地衣芽孢桿菌及其應用的制作方法

專利名稱：一株地衣芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一株地衣芽孢桿菌及其應用。
背景技術：
隨著人們對健康和生態環境的高度重視，無毒、無殘留及無抗藥性的綠色飼料添加劑成為研究熱點。益生菌是有利于宿主腸道微生物平衡的活菌食品或飼料添加劑，要求抗消化道內環境，定植于消化道表面，產生有用的酶類和有機酸等代謝產物，在加工和貯存過程中保持活性等。作為綠色飼料添加劑的益生菌種類很多。美國FDA (1989)認為，安全的微生物菌株共42種，農業部658公告中公布了 16種，地衣芽孢桿菌(Bacillusclicheniformis)是其中一種。地衣芽孢桿菌主要通過以下幾方面發揮作用1)頡頏動物病原細菌并維持和調整·腸道微生態平衡。2)產生多種酶類并提高動物消化酶活性，促進動物對營養物質的消化吸收。3)增強動物體的免疫功能，抵御感染。研究證明，地衣芽孢桿菌確實是一種高效且安全的新型飼料添加劑。目前，國內的研究多集中于研制產品和應用效果，而按益生菌的特定要求來選育性能優良的菌種，研究菌株生物特性方面的報道很少。

發明內容
本發明的目的是提供一種地衣芽孢桿菌及其應用。本發明所提供的地衣芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)C30-2，該菌株已于2011年09月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，其保藏編號為CGMCCNo. 5350。本發明的另一個目的是提供一種地衣芽孢桿菌制劑。該地衣芽孢桿菌制劑除包含作為活性成分的地衣芽孢桿菌(BacillusLicheniformis) C30-2 CGMCC No. 5350外，還可包括輔料，如稻殼粉、麥芽糊精、石粉、豆柏
坐寸ο本發明的再一個目的是提供一種動物飼料添加劑。該動物飼料添加劑的活性成分為所述地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)C30-2CGMCC No. 5350。含有所述動物飼料添加劑的動物飼料也屬于本發明的保護范圍。本發明的又一個目的是提供一種抑菌產品。該抑菌產品的活性成分為所述地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)C30-2CGMCC No. 5350。本發明所提供的地衣芽孢桿菌(BacillusLicheniformis)C30_2 CGMCC No. 5350在如下至少一種中的應用也屬于本發明的保護范圍a)制備地衣芽孢桿菌制劑；
b)制備動物飼料添加劑；c )制備動物飼料；d)制備抑囷廣品；e)促進豬或者雞生長。在本發明的一個實施例中,所述動物具體為豬或雞。所述促進動物生長具體可體現在如下I)或2):I)提高動物豬平均日增重、提高豬平均日采食量、提高豬皮毛指數、降低豬料肉比和/或降低豬腹瀉率；2)提高雞平均日增重和/或提高平均日采食量。 制備所述地衣芽孢桿菌制劑的方法也屬于本發明的保護范圍。該方法包括如下步驟I)發酵地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis) C30-2 CGMCC No. 5350，濃縮發酵液，得到菌泥；2)將步驟I)得到的菌泥與麥芽糊精混勻，即得到地衣芽孢桿菌制劑。在上述方法步驟I)中，所述發酵地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)C30-2CGMCC No. 5350，濃縮發酵液，得到菌泥，具體為通過將所述地衣芽孢桿菌(BacillusLicheniformis) C30-2 CGMCC No. 5350的發酵液進行蒸發，至含水量50_60%，得到所述菌泥。在上述方法步驟I)中，所述發酵的溫度為15°C _45°C，所述發酵的時間為10_30小時，所述發酵所需的PH值為6. 4-6. 6，所述發酵的壓力為O. 08Mpa-0. 14Mpa，發酵過程中的通氣量為O. 8-1. OV / V ·π η，所述通氣量以每分鐘內通過單位體積培養液的空氣體積來表不。在本發明的一個實施例中，所述發酵的溫度具體為30°C、15°C或45°C，所述發酵的時間具體為28-30小時、10小時或18小時。在上述方法步驟2)中，所述菌泥與所述麥芽糊精的配比為(3-8) XlO11Cfu :lg。在上述方法步驟I)中，所述發酵采用的培養基按照如下方法制備將蔗糖、豆柏、NaCUK2HPO4^KH2PO4 · 3H20、MnSO4、MgSO4 · 7H20和水混勻，得到培養基，所述蔗糖在所述發酵培養基中的濃度為35g/L-45g/L，所述豆柏在所述發酵培養基中的濃度為35g/L-45g/L，所述NaCl在所述發酵培養基中的濃度為lg/L-5g/L，所述K2HPO4在所述發酵培養基中的濃度為O. lg/L-0. 5g/L，所述KH2PO4 · 3H20在所述發酵培養基中的濃度為O. 05g/L_0. 5g/L，所述MnSO4在所述發酵培養基中的濃度為O. lg/L-0. 5g/L，所述MgSO4 · 7H20在所述發酵培養基中的濃度為O. O lg/L-0. lg/L。在本發明的實施例中，上述蔗糖在所述發酵培養基中的濃度具體為35g/L、40g/L或45g/L，所述豆柏在所述發酵培養基中的濃度具體為35g/L、40g/L或45g/L，所述NaCl在所述發酵培養基中的濃度具體為lg/L、2g/L或5g/L，所述K2HPO4在所述發酵培養基中的濃度具體為O. Ig/L、0. 4g/L或O. 5g/L，所述KH2PO4 · 3H20在所述發酵培養基中的濃度具體為O. Ig/L、0. 4g/L或O. 5g/L，所述MnSO4在所述發酵培養基中的濃度具體為O. lg/L、或O. 5g/L，所述MgSO4 ·7Η20在所述發酵培養基中的濃度具體為O. O lg/L或O. 05g/L ;所述發酵培養基的 pH 為 6. 0-6. 8，或 6. 0-6. 4，或 6. 6-6. 8。
在上述方法中，在所述步驟2)后，還包括將乳化產物干燥得到地衣芽孢桿菌制劑的步驟，其中干燥采用低溫真空干燥箱在低溫溫度27-50°C，真空度-O. 096Mpa條件下進行。制備所述動物飼料添加劑的方法也屬于本發明的保護范圍。該方法與上述制備所述地衣芽孢桿菌制劑的方法相同，也包括如下步驟I)發酵地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis) C30-2 CGMCC No. 5350，濃縮發酵液，得到菌泥；2)將步驟I)得到的菌泥與麥芽糊精混勻，即得到動物飼料添加劑。在上述的動物飼料添加劑制備方法中，所述動物具體可為豬或雞。制備所述抑菌產品的方法也屬于本發明的保護范圍。該方法包括如下步驟發酵所述地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)C30-2CGMCC No. 5350，收集發酵產物，得到所述抑菌產品。在上述抑菌產品的制備方法中，所述發酵的溫度可為35V -37°C。在本發明的一個實施例中具體為37 °C。在上述抑菌產品的制備方法中，所述發酵時間可為15h_80h。在本發明的一個實施例中具體為30h或20h。在上述抑菌產品的制備方法中，所述發酵的培養基具體為MRS肉湯培養基；所述MRS肉湯培養基的pH值為6. 0-6. 4。所述地衣芽孢桿菌制劑在作為動物飼料添加劑或抑菌產品中的應用也屬于本發明的保護范圍。在本發明中，所有所述抑菌產品均具體可為藥物或菌劑；所述抑菌均具體可為抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、化膿桿菌(Bacillus pyogenes)、梅氏弧菌(Vibrio metschnikovi)、魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)、藤黃球菌(Micrococcus luteus)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)和幾腸球菌(Enterococcus faecalis)中的至少一種。在本發明中，所有所述動物均具體可為豬或雞。本發明通過分離、鑒定、篩選，得到地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)C30-2CGMCC No. 5350，其抗逆性強、抗雜菌能力強、具有益生特性，本發明將其進行乳化制備得到地衣芽孢桿菌制劑，可以作為添加劑用于制備動物飼料，其中的動物包括但不限于豬、雞、牛、羊等各種動物。該飼料具有與抗生素飼料類似的功能，但無抗生素飼料的副作用。本發明的地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis) C30-2 CGMCC No. 5350主要作為動物飼料的添加劑，可替代現有動物日糧中的抗生素，調節動物腸內微生態平衡，從而具有增強非特異性免疫功能來預防疾病的作用，同時還可以提供營養因子、促進營養物的消化吸收、降低腹瀉、促進動物生長和提高飼料轉化率、提高斷奶仔豬以及生長育肥豬的生產性能。本發明的地衣芽孢桿菌對防治動物消化系統疾病起到保健作用，同時對幼年動物可刺激其胃腸道發育，所以將之作為飼料添加劑應用在飼料中能起到抗病促生長的作用。同時，本發明的地衣芽孢桿菌無耐藥性和藥物在動物產品中殘留，不會對人類的健康產生潛在的危害，是一種有前途的綠色飼料添加劑。


圖I 為地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)C30_2 CGMCC No. 5350 的耐酸性
檢測結果。圖2 為地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)C30_2 CGMCC No. 5350 的耐膽鹽
檢測結果。圖3為測定蛋白酶活性的酪氨酸標準曲線。圖4 為地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)C30_2 CGMCC No. 5350 的生長曲 線。保藏說明菌種名稱地衣芽孢桿菌拉丁名(BacillusLicheniformis)菌株編號C30_2保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱CGMCC地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號保藏日期2011年09月30日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 5350
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中所用的培養基如無特殊說明配方如下( I) MRS肉湯培養基蛋白胨10g，牛肉粉5g，葡萄糖20g，吐溫801ml，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，檸檬酸三氨2g，七水硫酸鎂O. 2g,四水硫酸錳O. 05g，酵母粉4g，用蒸餾水定容至lL，pH 6. 0-6. 4。(2) MRS瓊脂培養基IL上述的MRS肉湯培養基中加入瓊脂15g，pH6. 3-6. 7。(3) Ml7瓊脂培養基大豆蛋白胨5. Og,酵母提取物5. Og,酪蛋白胨5g,抗壞血酸O. 5g,牛肉浸膏2. 5g,β -甘油磷酸二鈉19g，MgS04 · 7H20 O. 25g，瓊脂15g，用蒸餾水定容至1L，ρΗ6· 6-6. 9。實施例I、地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis) C30-2的分離及鑒定一、菌株C30-2的分離與篩選I、菌株的分離培養取Ig中國北京的農田土壤樣品于裝有9mL無菌生理鹽水的試管中，漩渦器震蕩混勻，即為I :10稀釋液，再取稀釋液進行十倍遞增稀釋，然后選擇3個適宜梯度的稀釋液各ImL涂布于含有IOppm放線菌酮的MRS瓊脂培養基及M17瓊脂培養基，37°C厭氧培養48 72h,觀察并記錄菌落形態，挑取長勢良好的特征單菌落于MRS肉湯培養基中，進行劃線分離純化。觀察肉湯是否變渾濁，有渾濁的菌懸液放置4°C冰箱貯藏，進一步進行下述紫外誘變篩選實驗。2、菌株的紫外誘變與篩選將經滅菌的固體LB培養基倒入底部平整的平皿中，待凝固后取適量步驟I制備的菌懸液涂布于平板上，培養12h后，在距離20cm的紫外燈下誘變30s。獲得誘變后的菌株。挑選誘變后的菌株接種于LB液體培養基中培養24h，然后取適量誘變后的菌懸液涂布于平板上，每平皿控制菌落在30-50個，在37°C下繼續培養至24h (各菌落產生的代謝產物最大量時)，將瓊脂塊取出置于涂布有金黃色葡萄球菌的檢測平皿上，37°C培養一段時間，以野生地衣芽孢桿菌為對照，測量并比較瓊脂塊周圍形成的抑菌圈大小。對抑菌能力明顯增大的菌株(抑菌圈大約IOmm)進一步通過瓊脂孔擴散法測定菌株的抑菌能力。選取抑菌圈在15_以上的菌株進一步進行革蘭氏染色實驗。
3、菌株的革蘭氏染色用無菌注射器吸取少量含有步驟2所得菌株的MRS肉湯培養物，滴在載玻片上，在酒精燈火焰上輕輕烘干固定。滴加結晶紫染色液，染lmin，水洗；滴加革蘭氏碘液媒染，作用lmin，水洗；滴加丙酮乙醇混合液(丙酮95%乙醇=3 :7，體積比)脫色30s，水洗；滴加沙黃染色液復染lmin，水洗，待干，在普通光學顯微鏡上觀察，若菌體呈紅色為陰性，呈紫色為陽性。選取呈革蘭氏陽性，且形態一致的桿菌，進一步進行下述接觸酶試驗。4、菌株的接觸酶試驗做MRS斜面培養基，取含有步驟3所得菌株的MRS肉湯培養物約O. 2 mL注入裝有MRS瓊脂培養基斜面，5%C02培養箱，37°C培養24h，長出菌落后，將3%過氧化氫溶液滴加到菌落上，若沒有氣泡產生說明是陰性，若有氣泡產生說明是陽性。通過步驟1-4的分離與篩選最終獲得I株對金黃色葡萄球菌抑制能力明顯增強，革蘭氏染色成陽性，接觸酶反應也為陽性的菌株。將該菌株編號為C30-2。二、菌株C30-2的鑒定從以下幾個方面鑒定步驟一分離并篩選得到的菌株C30-2具體屬于哪種菌。I、形態學鑒定一方面，將處于對數生長期，且菌落大小穩定，上述步驟一分離并篩選得到的菌株C30-2進行單菌落狀態描述，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、濕潤度、菌落表面狀態(是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(是否整齊、不規則、放射狀等)。另一方面，對處于對數生長期的所述菌株C30-2，經涂片染色后采用光學顯微鏡觀察菌體的形態。分離并篩選得到的菌株C30-2的細胞為桿狀，細胞直徑大于I μ m，有芽孢形成，芽孢不膨大，革蘭氏染色陽性。2、生理生化特征測定菌株C30-2的生理生化特征測定結果如表I所示表I菌株C30-2的生理生化特征
權利要求
1.地衣芽孢桿菌(BacillusLicheniformis) C30-2,它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 5350。
2.一種地衣芽孢桿菌制劑，其活性成分為權利要求I所述的地衣芽孢桿菌(BacillusLicheniformis) C30-2CGMCC No. 5350。
3.一種動物飼料添加劑，其活性成分為權利要求I所述地衣芽孢桿菌(BacillusLicheniformis) C30-2CGMCC No. 5350。
4.含有權利要求3所述動物飼料添加劑的動物飼料。
5.一種抑菌產品，其活性成分為權利要求I所述地衣芽孢桿菌(B a c i 11 u sLicheniformis) C30-2CGMCC No. 5350。
6.權利要求I 所述的地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis) C30-2CGMCC No. 5350在如下至少一種中的應用 a)制備地衣芽孢桿菌制劑； b)制備動物飼料添加劑； c)制備動物飼料； d)制備抑囷廣品； e)促進豬或者雞的生長。
7.一種制備地衣芽孢桿菌制劑的方法，包括如下步驟 1)發酵地衣芽孢桿菌(BacillusLicheniformis) C30-2CGMCC No. 5350，濃縮發酵液，得到菌泥； 2)將步驟I)得到的菌泥與麥芽糊精混勻，即得到地衣芽孢桿菌制劑。
8.一種制備動物飼料添加劑的方法，包括如下步驟 1)發酵地衣芽孢桿菌(BacillusLicheniformis) C30-2CGMCC No. 5350，濃縮發酵液，得到菌泥； 2)將步驟I)得到的菌泥與麥芽糊精混勻，即得到動物飼料添加劑。
9.一種制備抑菌產品的方法，包括如下步驟發酵權利要求I所述的地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis) C30-2CGMCC No. 5350，收集發酵產物，得到所述抑菌產品。
10.權利要求2所述地衣芽孢桿菌制劑在作為動物飼料添加劑或抑菌產品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一株地衣芽孢桿菌及其應用。本發明所提供的地衣芽孢桿菌具體為地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)C30-2，它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No.5350。實驗證明，本發明的地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)C30-2CGMCC No.5350抗逆性強、抗雜菌能力強，本發明將其進行乳化制備得到地衣芽孢桿菌制劑，可以作為添加劑用于制備動物飼料，可替代現有動物日糧中的抗生素，調節動物腸內微生態平衡，從而具有增強非特異性免疫功能來預防疾病的作用，同時還可以提供營養因子、促進營養物的消化吸收、降低腹瀉、促進動物生長和提高飼料轉化率。
文檔編號C12N1/20GK102876614SQ201210392858
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月16日 優先權日2012年10月16日
發明者譙仕彥, 丁修良, 王勁松, 宋青龍, 張海燕 申請人:北京龍科方舟生物工程技術有限公司