專利名稱：自動捕獲、識別細胞生物芯片及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物細胞學檢測技術，具體地講是一種細胞芯片——自動捕獲、識別細胞的生物芯片及其制備方法。
背景技術：
近年來，隨著后基因組時代的到來，生物芯片技術得到了迅猛發展，包括基因芯片、蛋白芯片、 抗體芯片、細胞芯片、組織芯片在內的不同功能的生物芯片相繼問世。基因芯片技術的研究成果應用范圍最為廣泛。它不但可以應用于疾病發病機理、功能基因組學等方面的基礎研究，還可以用于遺傳病檢測、感染性疾病檢測、腫瘤相關基因檢測等多方面的疾病診斷。但基因芯片只能檢測樣品中核酸，往往由于其高成本和特殊的設備需要，限制了其在臨床中的應用。蛋白、抗體芯片用于分析樣品中的蛋白質種類及其含量。現有的細胞芯片是在芯片上制成微池陣列，然后在不同的微池中人為的加入不同類型的細胞，用于觀察不同種類的細胞生理、生化指標的變化；另一類細胞芯片是將細胞在芯片上培養形成單細胞層，研究細胞的單生理現象，尤其有利于神經細胞神經信號產道方面的研究。目前，檢測檢測某些細胞的方法，如惡性腫瘤細胞的檢測方法主要是原位雜交和免疫組化。原位雜交只能一次檢測一個標本，當許多標本需要檢測時，則需要一個一個檢測，費時費力，不能進行高通量檢測。而將免疫組化應用在組織芯片中彌補了這一缺陷，但組織芯片在制片過程中細胞核通常被切斷，不能提供完整的信息。所以需要一種新的高通量檢測細胞并且省時省錢的方法。
發明內容
1、發明目的本發明提供一種自動捕獲、識別細胞生物芯片及其制備方法，其目的在于提供一種高通量檢測、又能提供完整的信息、和降低檢測的成本及不需要特殊設備。
2、技術方案本發明是通過以下技術方案來加以實現的一種自動捕獲、識別細胞的生物芯片，其特征在于它是在玻璃基片上分布有多個不同區域的微陣列，在每個微陣列區域中，分別固定識別不同類型細胞膜表面特殊的生物分子特異性探針，同時另設有質控探針和陣列位置指示探針。
一種自動捕獲、識別細胞的生物芯片的制備方法，其特征在于配制探針點樣溶液，溶液濃度為150mg/L，PH＝9.5；在玻璃基片上進行點樣，點的大小為50～500微米；點好的芯片于37℃下水化45分鐘，然后在40℃下烘干2小時；以緩沖液及蒸餾水沖洗玻片，吹干；以封閉液封閉玻片，之后洗滌3次后，制備成成品。
一種自動捕獲、識別細胞的生物芯片的使用方法，其特征在于使用方法按如下步驟進行(1)洗滌細胞取含有游離細胞的樣品，用PBS洗三次，每次5分鐘，調整細胞濃度在108/L；(2).細胞雜交將細胞懸液直接滴在芯片上，室溫濕盒中雜交20分鐘，中間搖動三次；(3).雜交結果觀察用室溫放置的PBS漂洗玻片，用普通光學顯微鏡低倍鏡觀察，以背景干凈為宜；
(5).細胞固定用2.5％戊二醛固定細胞5分鐘；(6).形態觀察用瑞氏染液常規染色，時間為15分鐘；(7).分群鑒定用三色熒光染料對細胞芯片進行染色，用熒光掃描儀掃描觀察、檢測。
3、優點及效果本發明設計了一種新型的細胞芯片，其原理是應用細胞膜表面特殊的生物分子，與結合在玻片上能與細胞表面特殊分子發生特異性結合，通過一次實驗可以將被測細胞懸液中不同類型的細胞分離、固定在同一張玻片的不同區域。由于以玻片為介質，擺脫了硝酸纖維素膜的易脆性和不透明性，繼而為后續的各種操作奠定了良好的基礎。而且檢測結果觀察可以不需特殊設備，僅應用一臺普通光學顯微鏡即可。如果條件允許，也可以進行雜交信號的掃描等高通量分析。
四、實施方式；我們研制的細胞芯片利用生物大分子間的相互作用，將能與細胞表面分子發生結合作用的生物分子，以陣列的形式固定在玻璃表面不同的位點上，通過特異結合實現對不同種類細胞自動捕捉、識別、在特定位點分別固定不同種類的細胞。尤其在惡性腫瘤中，基因的突變產生特異性蛋白質，通常這種蛋白質會在病變細胞的不同部位得以表現，所以細胞學檢測在惡性腫瘤的診斷與治療中的作用是十分重要的。
一種自動捕獲、識別細胞的生物芯片，其特征在于它是在玻璃基片上分布有多個不同區域的微陣列，在每個微陣列區域中，分別固定識別不同類型細胞的膜蛋白、膜糖類特異性探針，同時另設有質控探針和陣列位置指示探針。能夠實現在陣列點原位自動捕獲、識別不同類型細胞，達到篩選、定點固定細胞的目的。
根據不同細胞表面分子的特征，選擇細胞調亡調控因子抗體，用于研究惡性腫瘤的預后；選擇細胞表面糖蛋白抗體，用于鑒別不同類型(腫瘤)細胞及耐藥性抗藥研究；選擇原癌基因蛋白的抗體，研究乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、食道癌、宮頸癌、涎腺癌、膀胱癌等預后及鑒別良惡型細胞；利用細胞骨架蛋白抗體，研究惡性腫瘤轉移及浸潤機制；利用白細胞表面分類抗原，分析血液和各種體液中細胞的種類及惡性腫瘤的鑒別；利用細胞表面膜受體抗體，鑒別不同細胞類型；利用惡性腫瘤細胞膜標志物抗體，鑒別腫瘤的類型。
由于芯片是在玻璃基片捕獲并且固定細胞，因此在捕獲細胞后，可以針對該細胞進行常規染色、組織化學染色、原位雜交、細胞培養、藥物分析等多種后續處理，進行細胞學分析、觀察。
本發明實施的具體步驟是(1).根據需要設定點樣程序，矩陣分布根據檢測要求及點樣方便與否安排。使用CEL公司生產的玻璃基片，用BioRobotics公司的點樣儀按預先設定好的程序進行點樣。按照不同要求從幾十點到上千點，點的大小為50-500微米左右，點間距依點的數量而定。抗體點樣溶劑為PBS水溶液pH＝9.5；溶質為蛋白，抗體濃度150mg/L，然后將點好的芯片于37℃下水化45分鐘，然后在40℃下烘干2小時。以緩沖液(PBS，0.1％SDS)及蒸餾水沖洗玻片，吹干。以封閉液(1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB)封閉玻片，之后洗滌3次。吹干備用。
上述自動捕獲、識別細胞芯片的應用方法包括以下步驟(以CD3；CD4；CD8淋巴細胞檢測為例)
(1).洗滌細胞取含有游離細胞的樣品，用PBS洗三次，每次5分鐘，調整細胞濃度在108/L。
(2).細胞雜交將細胞懸液直接滴在芯片上，室溫濕盒中雜交20分鐘，中間搖動三次。
(3).雜交結果觀察用室溫放置的PBS漂洗玻片，用普通光學顯微鏡低倍鏡觀察，以背景干凈為宜。
(4).細胞固定用2.5％戊二醛固定細胞5分鐘。
(5).形態觀察用瑞氏染液常規染色，時間為15分鐘。
(6).分群鑒定用CD3-Cy5+CD4-FITC+CD8-RPE三色熒光染料對細胞芯片進行染色，用Genomic Solutions公司的熒光掃描儀掃描觀察。
權利要求
1.一種自動捕獲、識別細胞的生物芯片，其特征在于它是在玻璃基片上分布有多個不同區域的微陣列，在每個微陣列區域中，分別固定識別不同類型細胞膜表面特殊的生物分子特異性探針，同時另設有質控探針和陣列位置指示探針。
2.根據權利要求1所述的一種自動捕獲、識別細胞的生物芯片的制備方法，其特征在于配制探針點樣溶液，溶液濃度為150mg/L，PH＝9.5；在玻璃基片上進行點樣，點的大小為50～500微米；點好的芯片于37℃下水化45分鐘，然后在40℃下烘干2小時；以緩沖液及蒸餾水沖洗玻片，吹干；以封閉液封閉玻片，之后洗滌3次后，制備成成品。
3.根據權利要求1所述的一種自動捕獲、識別細胞的生物芯片的使用方法，其特征在于使用方法按如下步驟進行(1)洗滌細胞取含有游離細胞的樣品，用磷酸鹽緩沖液洗三次，每次5分鐘，調整細胞濃度在108/L；(2).細胞雜交將細胞懸液直接滴在芯片上，室溫濕盒中雜交20分鐘，中間搖動三次；(3).雜交結果觀察用室溫放置的磷酸鹽緩沖液漂洗玻片，用普通光學顯微鏡低倍鏡觀察，以背景干凈為宜；(4).細胞固定用2.5％戊二醛固定細胞5分鐘；(5).形態觀察用瑞氏染液常規染色，時間為15分鐘；(6).分群鑒定用三色熒光染料對細胞芯片進行染色，用熒光掃描儀掃描觀察、檢測。
全文摘要
本發明涉及生物細胞學檢測技術，它是在玻璃基片上分布有多個不同區域的微陣列，在每個微陣列區域中，分別固定有可以與細胞表面生物分子特異結合有機分子。利用有機分子與細胞表面生物分子相互作用，將不同種類的細胞分離、固定在同一張芯片不同的點位上，經掃描儀掃描或顯微鏡觀察芯片上不同位點細胞結合的情況進行處理分析，獲得細胞類型的信息。這種芯片能同時檢測多種類型細胞的形態，并分析其不同類型及耐藥特性，可以用于胸水、腹水、尿液、血液、細針穿刺、組織勻漿等細胞學檢測，具有診斷快速準確、特異性高、信息量大的特點，對臨床診斷和流行病學篩查都有很大幫助。
文檔編號C12Q1/00GK1515906SQ0311153
公開日2004年7月28日 申請日期2003年4月24日 優先權日2003年4月24日
發明者趙雨杰, 侯偉健, 秦海明, 吳廣平, 潘忠誠, 何群, 馬汝海, 王紹成, 張玉魁, 王天驕, 馬佳明 申請人:趙雨杰, 侯偉健, 秦海明, 吳廣平, 潘忠誠, 何群, 馬汝海, 王紹成, 張玉魁, 王天驕, 馬佳明