一種分子改造手段提高釀酒酵母的乙醇耐受性的方法與流程

本發明涉及工業微生物脅迫耐受性領域和分子生物學領域，特別是涉及一種分子改造手段提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法。

背景技術：

自近幾十年爆發的資源危機以來，能源枯竭以及日趨惡化的環境問題，使燃料乙醇作為新型可再生清潔能源備受關注。燃料乙醇是一種代表性的可再生清潔能源，可以緩解我國能源緊張的現狀、降低原油進口依賴度，并能大大緩解化石燃料煉制與消費過程中帶來的嚴重環境污染問題，目前燃料乙醇已經實現了大規模工業化生產和應用。人們希望利用廉價的木質纖維素原料最終實現超高濃度(Very High Gravity，VHG)乙醇發酵，通過超過25％(v/v)的高終點乙醇濃度來大大降低了乙醇精餾能耗和廢槽液總量、提高生產效率。

但在發酵過程中，隨著終產物乙醇濃度的提高，乙醇在一眾環境脅迫因子(溫度、滲透壓、低pH、纖維素原料降解產生的有毒副產物等)中成為最主要的脅迫因素，酵母細胞活性被高濃度乙醇嚴重抑制甚至出現生長停滯和死亡的現象。從過程工程控制角度進行的工藝優化只能部分緩解這種脅迫因素，不能完全彌補酵母菌本身性能下降引發的發酵效率的降低問題。因此，揭示酵母細胞復雜的乙醇脅迫響應機制、有效的篩選或構建具有高耐受性高發酵性能的菌株一直是發酵工業追求的目標。

組學的深入分析揭示應對乙醇脅迫細胞在整體的轉錄/翻譯水平發生了調整，表達水平發生變化的基因數量依據不同的乙醇作用方式可達上百甚至上千，因此分子水平上的耐性改造策略已采用全局性、非靶向性的方法來代替傳統單基因操作，如基因組改組、全局轉錄調控等；生理生化水平的研究集中在乙醇脅迫響應下酵母細胞膜和細胞壁的組分改變、防止蛋白變性的大分子物質的積累、更活躍的氧化-還原酶系統等，但對細胞形態和乙醇耐受性關系研究及機理探討還很鮮見，酵母細胞在乙醇脅迫下出現的"伸長"、"單極出芽"等現象僅被認為是細胞被動承受乙醇脅迫的附屬結果，并且認為這種"伸長"使細胞的處境更為不利，活性進一步降低。

但是，已有很多實例表明酵母細胞受到環境的刺激、伴隨極化狀態改變而出現的細胞形態變化其目的是更快更好的適應環境，如假絲酵母只有在假絲型生長狀態下才具有致病性，釀酒酵母在限氮固體培養基上出現的絲狀生長現象使其擴展生存空間獲取營養。因此猜測釀酒酵母乙醇脅迫下形態的改變可能與細胞主動的乙醇響應存在關系，解決這一問題的關鍵是找到細胞形態與脅迫耐受性之間的媒介與橋梁，小分子量GTP水解酶家族引起了我們的關注。

小分子量GTP酶的功能為結合并水解鳥苷酸，當其活性部位被GTP占據后發生構象變化，特定部位可介導自身與下游靶點相互作用。在釀酒酵母的研究中已證明小GTP酶的活性與多種脅迫響應有關，如細胞壁損傷修復、多效藥物響應(pleiotropic drug response，PDR)、離子脅迫響應、饑餓及耐熱性、滲透壓脅迫、活性氧(ROS)產生與消除途徑等，直接或間接影響眾多基因的轉錄表達，如與多效脅迫響應相關的雷帕霉素靶TOR復合物I(TORC1)依賴的信號級聯過程、HOG MAP kinase途徑、Pkc1依賴的細胞壁完整CWI途徑等。但小GTP酶與乙醇耐受性直接或間接相關的報導還較少見。

技術實現要素：

為彌補現有技術的不足，本發明提供了一種以RhoGTPase為中心靶點改造菌種的方法用于提高釀酒酵母乙醇脅迫耐受性。

本發明的技術方案如下：一種分子改造手段提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法，建立RHO1基因的突變序列文庫，導入釀酒酵母，通過添加乙醇的平板篩選方法獲得耐受性提高的菌株。

優選地，所述RHO1基因的突變序列文庫由易錯PCR獲得。

優選地，突變序列文庫靶基因為RhoGTPase中的RHO1基因。

優選地，用于釀酒酵母轉化的載體以pRS316為骨架、由對應宿主的PGK1啟動子調節插入片段表達。

優選地，以PGK-F/R為引物PCR擴增啟動子片段pRS316載體。

更為具體地，一種提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法，包括以下步驟：

S1.基因組選取；取釀酒酵母種子接種于YPD培養基30℃過夜培養后，以標準方法提取酵母基因組。

S2.以PGK-F/R為引物PCR擴增對應宿主PGK1啟動子片段，以BamHI和EcoRI雙酶切、回收后，連入經BamHI和EcoRI雙酶切線性化的pRS316載體，轉化E.coli DH5α，挑選陽性克隆并提取質粒，同樣雙切驗證片段正確后，命名該載體為pRS316-PGK01；

S3.以基因組為模板，用引物對RHO-F/R利用易錯PCR擴增RHO1基因，克隆得到的片段純化后與載體pRS316-PGK01分別進行EcoRI、KpnI雙酶切，隨后進行連接反應，進行轉化大腸桿菌E.coli DH5α，挑選陽性克隆制成混菌，提取質粒，即為突變序列的載體文庫。

S4.將突變序列的載體文庫的突變載體轉入釀酒酵母，以G418(終濃度100ug/mL)為篩選藥物，涂布于含5-12％(v/v)乙醇的平板上，篩選得到耐受性高的菌株。

優選的，所述步驟S4中，乙醇平板培養條件具體為：30℃培養48h，挑選可以正常生長的菌落，進行耐受性評價，篩選得耐受性高的菌株。

上述方法可適用于工業釀酒酵母或實驗室模式菌株。

本發明利用小GTP水解酶從調節細胞形態入手進而提高細胞乙醇脅迫耐受響應，采用類似全局轉錄調控的方法對小GTP水解酶進行隨機突變，通過主動干預細胞形態來達到調節細胞乙醇耐受性的目的。這一新的耐受性調節方式的引入對乙醇耐性機理研究與提高燃料乙醇生產效率都有重要的意義，并可以為適應性進化研究提供參考。通過本發明方法可有效篩選到乙醇耐受性提高的菌株，構建的載體有普遍適用性，可適用于實驗室酵母、工業酵母。

附圖說明

圖1為本發明實施例1啟動子電泳圖；

圖2為本發明實施例1測序發現的套峰；

圖3為本發明實施例1的pRS315-PGK-RHO01雙酶切驗證電泳圖；

圖4為本發明實施例1乙醇耐受性考察結果圖；其中，A為YPD平板；B為含5％(v/v)無水乙醇的YPD平板；

圖5為本發明實施例2突變株乙醇耐受性驗證結果圖；其中，A為YPD平板，B為含12％(v/v)乙醇的YPD平板。

具體實施方式

下面以具體實施例對本發明的技術方案作進一步的說明，但本發明不以任何形式受限于實施例內容。實施例中所述實驗方法如無特殊說明，均為常規方法；如無特殊說明，所述試劑和生物材料，均可從商業途徑獲得。

(1)菌株：實驗室模式釀酒酵母Sc288c、工業釀酒酵母Sc4126；大腸桿菌E.coli DH5α。

(2)載體骨架：pRS316。

(3)培養基：

YPD培養基：葡萄糖2.5wt％，蛋白胨0.5wt％，酵母浸粉0.5wt％，自來水溶解，固體培養基加瓊脂2wt％

LB液體培養基：蛋白胨1wt％，酵母浸出粉0.5wt％，NaCl 1wt％，去離子水配置，pH7.0-7.2，固體培養基加2wt％的瓊脂。

(4)引物：

實施例1

提高實驗室模式菌株S288c乙醇脅迫耐受性：

(1)基因組提取：取處于對數生長期后期到穩定期前期的實驗室酵母Sc288c過夜培養物，3000r/min離心5min，棄上清，用3ml無菌水洗細胞，3000r/min離心5min，用500ul裂解緩沖液(0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，50mmol/L EDTA，1％SDS)再次懸浮，加入干凈酸洗玻璃珠(約1.5mi離心管2/3體積)和25ul的5mmol/L NaCl，以最高速震蕩2min，10000r/min離心2min，轉移上清液至新離心管；加入500ul苯酚，震蕩，離心1min。吸取水相至新的離心管，加入2倍體積的無水乙醇，在—20℃下沉淀至少1h，最高轉速離心5min沉淀DNA，棄上清，用70％乙醇清洗，最后懸浮在50ul緩沖液中(2.5mM Tris-HCl(pH8.0))，獲得酵母基因組。

(2)含啟動子片段的載體構建：以PGK-F/R為引物PCR擴增啟動子片段。

PCR體系：

PCR程序：

如圖1所示為啟動子電泳圖，其中，M：DL2000Marker；P1：PGK1啟動子克隆片段。擴增產物用Takara回收試劑盒回收后，以BamHI和EcoRI雙酶切，37℃酶切2h。

酶切體系：

同上進行片段回收。同時pRS316質粒也進行同樣的酶切反應，反應體系：

隨后進行連接反應。反應體系：

該反應體系于16℃水浴，過夜連接。連接產物隨后進行感受態細胞制備與轉化實驗。

從-80℃取出凍存的E.coli DH5α，接種于50ml LB液體培養基中，37℃下振蕩培養過夜。將該菌種懸液以1:100的比例接種，取250ul菌液轉接到50ml LB液體培養基中，37℃振蕩培養2～3h至OD₆₀₀＝0.4-0.5左右。將菌液轉入50mL離心管中，冰上放置10min。在4℃下，4000r/min離心10min。棄去上清，將管倒置1min以便培養液流盡。用冰上預冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液10mL輕輕懸浮細胞，冰上放置30min，4℃4000r/min離心10min，棄去上清，加入2mL預冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置。加入質粒DNA溶液，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后，42℃水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻5分鐘。向管中加入1ml LB液體培養基(不含Amp和Kan)，混勻后37℃振蕩培養1小時，使細菌恢復正常生長狀態，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因。將上述菌液搖勻后取100ul涂布于含Amp及Kan雙抗的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿，37℃培養16-24小時。以Takara質粒小提試劑盒提取質粒，以上述酶切驗證是否連接正確。驗證片段正確后，命名該載體為pRS316-PGK01

(3)突變文庫載體構建：以上述基因組為模板，利用易錯PCR擴增RHO1基因，突變率保持在5％以下。

擴增體系如下：

擴增產物為含堿基突變的混合物。測序檢測到一定信號強度的套峰(圖2)，表明引入了突變位點。

同上用Takara純化試劑盒純化PCR片段，與pRS316-PGK01分別進行EcoRI、KpnI的雙酶切，隨后進行連接反應，同上進行轉化大腸桿菌，挑選陽性克隆制成混菌，提取質粒，即獲得突變序列的載體文庫。載體命名為pRS315-PGK-RHO01,用EcoRI、KpnI雙酶切驗證結果如圖3所示，其中，M：DL2000Marker；R：表達載體酶切驗證。

(4)耐受性提高的突變體篩選

將含不同突變序列的混合載體pRS315-PGK-RHO01電轉化入釀酒酵母S288c。在含5ml YPD的50ml離心管中，培養酵母，30℃過夜，取0.1-0.5ml過夜培養物，接種含100ml新鮮培養基的500ml搖瓶，30℃生長至OD₆₀₀大約1.3-1.5左右；在4℃，3000r/min離心5min收集細胞，用50ml預冷的滅菌水懸浮細胞；在4℃，3000r/min離心5min收集細胞，用25ml預冷的滅菌水懸浮細胞；在4℃，3000r/min離心5min收集細胞，用2ml預冷的1M山梨醇懸浮細胞；在4℃，5000r/min離心5min收集細胞，用200ul預冷的1M山梨醇懸浮細胞；分裝細胞用以電轉。每40uL細胞加入約5～10ug的線性化的DNA 2ul，槍吹勻，置0.2cm電轉杯冰浴5min；使用預設程序Sc2(1500V，BioRad)，立即加入1ml 1M山梨醇，靜置培養1h以上。將菌體懸液涂布于YPD(含有100ug/mL的G418)和5％(v/v)乙醇的平板上，濃縮涂布篩選平板，培養48h。

可以正常生長的細胞即可能為乙醇耐受性提高菌株，選菌落直徑最大的進行復篩。將其作十倍梯度稀釋，2ul點滴含5％(v/v)乙醇平板和正常的YPD平板，觀察菌落生長情況。圖4為含突變序列的菌體乙醇耐受性考察結果，其中，Control：出發菌株為實驗室酵母S288c；1：篩選得到的一株突變體。從圖4可知，突變體耐受性要較出發菌株提高了一個數量級。

實施例2

提高工業釀酒酵母菌株Sc4126乙醇脅迫耐受性：

實驗基本步驟同實施例1，將基因組換為Sc4126基因組；電轉的宿主酵母為Sc4126。結果如圖5所示為突變株乙醇耐受性驗證結果圖，出發菌株為工業酵母Sc4126，Sc4126-12與Sc4126-19為兩株突變體，其中圖5A為YPD平板，圖5B為含12％(v/v)乙醇的YPD平板，從圖5A和圖5B可知，突變體較出發菌株Sc4126乙醇耐受性有不同程度的提高。說明此方法可以適用于工業釀酒酵母和實驗室酵母。