1.一種分子改造手段提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法,其特征在于,建立RHO1基因的突變序列文庫,導入釀酒酵母,通過添加乙醇的平板篩選方法獲得耐受性提高的菌株。
2.根據權利要求1所述的一種分子改造手段提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法,其特征在于,所述RHO1基因的突變序列文庫由易錯PCR獲得。
3.根據權利要求1所述的一種分子改造手段提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法,其特征在于,突變序列文庫靶基因為RhoGTPase中的RHO1基因。
4.根據權利要求1所述的一種分子改造手段提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法,其特征在于,用于釀酒酵母轉化的載體以pRS316為骨架、由對應宿主的PGK1啟動子調節插入片段表達。
5.根據權利要求1所述的一種分子改造手段提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法,其特征在于,以PGK-F/R為引物PCR擴增啟動子片段pRS316載體。
6.根據權利要求1所述的一種分子改造手段提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法,其特征在于,具體包括以下步驟:
S1.基因組選取;
S2.以PGK-F/R為引物PCR擴增對應宿主PGK1啟動子片段,以BamHI和EcoRI雙酶切、回收后,連入經BamHI和EcoRI雙酶切線性化的pRS316載體,轉化E.coli DH5α構建載體pRS316-PGK01;
S3.以基因組為模板,用引物對RHO-F/R利用易錯PCR擴增RHO1基因,克隆得到的片段純化后與載體pRS316-PGK01分別進行雙酶切、進行連接反應,建立突變序列文庫,得突變載體;
S4.將突變載體轉入釀酒酵母,涂布于5-12%(v/v)乙醇的平板上,篩選得到耐受性高的菌株。
7.根據權利要求6所述的一種分子改造手段提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法,其特征在于,所述步驟S2中,
PGK-F:TTGGATCCACTGTAATTGCTTTTAGTTG
PGK-R:CCAGAATTCTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAG。
8.根據權利要求6所述的一種分子改造手段提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法,其特征在于,所述步驟S3中,
RHO-F:CGTGAATTCATGTCACAACAAGTTGGTAACAG
RHO-R:CTCGGTACCCTATAACAAGACACACTTCTTCT。
9.根據權利要求6所述的一種分子改造手段提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法,其特征在于,所述步驟S4中,乙醇平板培養條件具體為:30℃培養48h,挑選可以正常生長的菌落,進行耐受性評價,篩選得耐受性高的菌株。
10.根據權利要求1所述的一種分子改造手段提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法,其特征在于,其適用于工業釀酒酵母或實驗室模式菌株。