一種蠟樣芽孢桿菌菌株及用途
【專利摘要】本發明公開了一種蠟樣芽孢桿菌菌株（Bacilluscereuszy-1）及其用途，本發明所述的蠟樣芽孢桿菌保藏在中國典型培養物保藏中心（地址：中國武漢武漢大學），保藏號：NO:M2014007。本發明所述蠟樣芽孢桿菌發酵無菌濾液的2倍稀釋液對草莓灰霉菌的孢子發芽抑制率為95.2%，發酵無菌濾液的10倍稀釋液對菌絲生長的抑制率優于40%嘧霉胺懸浮劑，因此，該菌在農業方面有很大的應用前景。本發明中的技術路線合理，可為大規模工業化生產提供可靠的中試數據和設計依據，為開發相關生物制劑及大田推廣應用奠定基礎。
【專利說明】一種蠟樣芽孢桿菌菌株及用途
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物【技術領域】，涉及一種細菌在生防領域中的應用，特別涉及蠟樣芽孢桿菌菌株在防治草莓灰霉病方面的用途。
【背景技術】
[0002]草莓營養豐富，素有“水果皇后”之稱，但由于其組織嬌嫩多汁，果皮很薄，因而在采收和貯運中易受到損傷和微生物侵染導致其腐爛變質。其中由灰葡萄孢cinerea Pers ex Fr)引起的灰霉病為草莓生產中最主要的病害之一,嚴重時可使草莓產量損失達50%以上，這直接影響了生產者的利益，也限制草莓產業的進一步發展。長期以來，控制草莓灰霉病最有效的方法仍然是使用化學殺菌劑，然而，隨著抗藥性和農藥殘留等問題的出現以及人們對環保意識的增強，因此安全、低毒的生物防治成為研究的熱點。生物防治是目前國際上進行植物病害防治的首選防治措施，這種從自然界中分離、篩選有益微生物并用于病原微生物的拮抗、抑制作用的防治方法，具有高效、無毒、無殘留和低成本等特點。從現有植物病害生物防治的研究報道來看，作為生物制劑中的木霉和酵母菌已在灰霉病的防治中發揮重大作用。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于提供一種提供蠟樣芽孢桿菌，使得該菌防治草莓灰霉病的效果與化學藥劑效果無明顯差異，且具有較高的環境友好的特點。
[0004]為實現上述目的，本發明提供一種從土壤中分離得到的細菌，命名為菌株zy_I，該菌在NA培養基上菌落近圓形，灰白色，不透明，菌落大3-7 mm,邊緣不整齊呈擴展狀，表面粗糙顆粒狀似毛玻璃狀或蠟狀，不分泌色素；為革蘭氏陽性細菌，桿狀，1.0~1.3X3.0~5.0μπι，成鏈，運動性，芽孢橢圓形，端生或次端生，芽孢膨大不明顯；能耐受7% NaCl的培養，接觸酶陽性、葡萄糖發酵陽性、淀粉水解陽性、硝酸鹽還原陽性、明膠液化陽性、麥芽糖發酵陽性、半固體穿刺試驗陽性、酪素水解陽性、VP試驗陰性、檸檬酸鹽利用試驗陰性、吲哚試驗陰性、蔗糖發酵陰性、乳糖發酵陰性、甘露醇水解陰性。此外，經16SrDNA分析，與菌株zy-Ι同源性高的菌株是芽孢桿菌，結合生理生化特征，鑒定其為蠟樣芽孢桿菌。
[0005]本發明所述蠟樣芽孢桿菌已于2014年I月6日保藏在中國典型培養物保藏中心(地址:中國武漢武漢大學)，保藏號:CCTCC NO: M 2014007，名稱為:蠟樣芽孢桿菌zy-1 (Bacillus cereus zy_l)。
[0006]本發明所述蠟樣芽孢桿菌zy-Ι的無菌濾液對草莓灰霉菌的孢子發芽具有顯著的抑制效果，與對照相比，菌株zy-Ι無菌濾液的2倍稀釋液抑制孢子的發芽率在95.2%，此外，zy-Ι的無菌濾液10倍稀釋液的對菌絲生長的抑制效果優于40%的嘧霉胺懸浮劑的800倍稀釋液。表明本發明所述的蠟樣芽孢桿菌對草莓灰霉菌的孢子和菌絲都有顯著抑制效果。
[0007]本發明所述的蠟樣芽孢桿菌zy-Ι的無菌濾液對灰霉菌離體葉片活性的測定結果顯示，用zy-Ι處理的草莓離體葉片未見發病，與對照相比，可以顯著降低病情發生。[0008]從以上技術方案可知:本發明的臘樣芽孢桿菌(ifeci77i/5.cereus zy_l)來源可靠，對溫度、PH等自然條件的適應范圍廣，對不良環境的耐受力強，能維持生態平衡，能適應病害生態系統，容易培養和保存，抑制草莓灰霉病菌的效果好，在農業方面有很大的應用前景。該技術路線合理，可為大規模工業化生產提供可靠的中試數據和設計依據，實現液體發酵工業化生產臘樣芽孢桿菌cereus zy-Ι),為開發相關生物制劑及大田推廣奠定基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1為生防菌zy-Ι菌株16SrDNA擴增片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。M表示DNA分子量；1表示生防菌zy-Ι樣品。
[0010]圖2為蠟樣芽孢桿菌zy-ι無菌濾液2倍稀釋液處理(左圖)對灰霉菌孢子發芽影響。
[0011]圖3蠟樣芽孢桿菌zy-ι無菌濾液的10倍稀釋液處理(右圖)對灰霉病菌菌絲生長影響。
[0012]圖4離體葉段測定蠟樣芽孢桿菌zy-Ι無菌濾液(右圖)對草莓灰霉病的防治效
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【具體實施方式】
[0013]以下是本發明的具體實施例，對本發明的技術方案做進一步作描述，但是本發明的保護范圍并不限于 這些實施例。凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本發明的保護范圍之內。
[0014]實施例1:本發明所述蠟樣芽孢桿菌zy-Ι的分離
拮抗菌的分離與純化:①稱取采自湖北省棗陽市的10 g麥田土樣，②放置于200 mL的六偏磷酸鈉溶液(分散劑)中震蕩懸浮5 min，③在懸浮的狀態下，吸取20 mL加入80 mL的
0.1%的水瓊脂中，震蕩懸浮5 min，④在懸浮處于攪拌的狀態下，吸取0.3 mL的懸浮液，⑤將0.3 mL的懸浮液按10倍梯度稀釋，分別為10_\ 10_2和10_3，⑥將梯度稀釋液分別置于80°C的烘箱中30 min,拿出后待冷卻后，⑦涂3個平板(每個稀釋濃度3個平板)，為1/10的TSA選擇性培養基，⑧所有平板置于22°C培養，2-3 d后挑選單菌落，編號保存。在平皿內對峙培養檢測其對草莓灰霉病菌的抑制作用，選擇形成抑菌帶的菌株，命名為菌株zy-Ι。
[0015]實施例2:本發明所述蠟樣芽孢桿菌生理生化以及16S rDNA序列的測定 生理生化檢測結果:zy-Ι在NA平板培養基上，28°C培養36 h，菌落近圓形，灰白色，
不透明，菌落大，3-7 mm,邊緣不整齊呈擴散狀，表面粗糙顆粒狀似毛玻璃或蠟狀，不分泌色素；為革蘭氏陽性細菌，桿狀，1.0~1.3 X 3.0~5.0 μ m，成鏈，運動性，芽孢橢圓形，端生或次端生，芽孢膨大不明顯；能耐受7%NaCl的培養，接觸酶陽性、葡萄糖發酵陽性、淀粉水解陽性、硝酸鹽還原陽性、明膠液化陽性、麥芽糖發酵陽性、半固體穿刺試驗陽性、酪素水解陽性、VP試驗陰性、檸檬酸鹽利用試驗陰性、吲哚試驗陰性、蔗糖發酵陰性、乳糖發酵陰性、甘露醇水解陰性。參考《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)、《常見細菌系統鑒定手冊》和《芽孢桿菌屬》，初步鑒定為芽孢桿菌屬。
[0016]16SrDNA序列的測定:將zy-Ι菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，180 rpm28°C培養24 h，離心收集菌體。采用上海生工Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(細菌)提取基因組。以提取到的基因組為模板，采用正向引物27bf5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；1492br 5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ 對菌株的 16SrDNA 基因進行 PCR 擴增。PCR 條件為:940C 3 min ；94°C 45s，54°C 30s, 72°C I min 30sec，35個循環；72°C延伸 5 min，4°C停止。PCR產物送上海英俊生物技術有限公司測序，長度為1466 bp(圖1)。測序結果在Ebiocloud中與 Bacillus cereus 相似性為 99.7%。
[0017]結合菌落形態、生理生化及分子鑒定，將這一菌株記為蠟樣芽孢桿菌cereus zy_l)。
[0018]實施例3:本發明所述蠟樣芽孢桿菌對草莓灰霉病菌孢子萌發和菌絲生長的試驗
1.蠟樣芽孢桿菌培養濾液的制備:菌株zy-Ι在28°c振蕩培養3 d后，發酵液離心
(12000 r / min, 20 min)，取上清液用細菌過濾器(0.22 μ m)除菌，獲得的無菌發酵液。
[0019]采用凹玻片發法進行孢子萌發試驗。將草莓灰霉病菌接在PDA平板上、23 °C下培養5d，待其產孢后用無菌水將孢子洗脫下來制成濃度為IO5個/ ml孢子懸浮液，吸取50 μ L無菌發酵液加入到500 μ L離心管中，然后吸取制備好的孢子懸浮液50 μ L，使藥液與孢子懸浮液等量混合均勻。吸取上述混合液40 μ L滴到凹玻片上，然后架放與帶有淺層水的培養皿中，加蓋保濕培養于23°C的培養箱中。每處理重復4次測定。以NA培養基的處理做空白對照。試驗結果見表1。從表1看出，蠟樣芽孢桿菌zy-Ι無菌濾液2倍稀釋液抑制孢子發芽率在95.2%，隨著稀釋倍數的增加對孢子發芽的抑制率在降低。
[0020]表1蠟樣芽孢桿菌zy-Ι無菌濾液對草莓灰霉病菌孢子發芽影響
【權利要求】
1.一種臘樣芽孢桿菌zy-1 (5aci77w5.cereus zy_l),其特征在于所述菌種的保藏號為CCTCC NO: M 2014007。
2.如權利要求1 所述的蠟樣芽孢桿菌zy-Ι在抑制草莓灰霉病方面的用途。
【文檔編號】C12R1/085GK103937699SQ201410061856
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年2月25日 優先權日:2014年2月25日
【發明者】喻大昭, 龔雙軍, 向禮波, 楊立軍, 史文琦, 張學江, 曾凡松, 薛敏峰, 汪華 申請人:湖北省農業科學院植保土肥研究所