一種檢測MAPT基因突變的探針和試劑盒及其方法與流程

本發明涉及生物醫學領域，具體是涉及一種檢測MAPT基因突變的探針和試劑盒及其方法。

背景技術：

進行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy，PSP)又稱Steele-Richardson-Olszewski綜合征，是一種臨床少見的中樞神經系統變性疾病。PSP是繼帕金森病(PD)之后最常見的退行性帕金森綜合征，其發病率約占PD的6％～10％。1904年由Posey首先發現并描述其臨床表現，1964年Steele等(Steele JC,Richardson JC,et al.Progressive supranuclear palsy:a heterogeneous degeneration involving the brainstem,basal ganglia and cerebellum with vertical supranuclear gaze and pseudobulbar palsy,nuchal dystonia and dementia.Arch Neurol,1964,10:333-359.)將此病列為獨立的神經系統疾病。PSP主要臨床特征為早期出現姿勢不穩、垂直性核上性麻痹、假性球麻痹、核上性眼球運動障礙、頸部肌張力障礙、構音障礙、假性延髓麻痹、輕度癡呆和帕金森綜合征類似癥狀等。

PSP的發病年齡在55～70歲之間，少數可早至45歲發病，平均初診年齡66.4±7歲。PSP的發病率有隨年齡增長而增高的趨勢，50～59歲為1.7/10萬，80-99歲為14.7/10萬，各年齡組中男性多于女性，男女之比約為5：3。有關PSP的流行病學的研究報道較少，Schrag等對英國倫敦約12萬人的流行病學調查顯示，PSP的患病率約為6.4/10萬，年發病率(1.14～1.21)/10萬；自出現癥狀后可生存1.2～16.6年，平均5.3年。患者多死于肺炎等并發癥(Schrag A,Ben-Shlomo Y,et al.Prevalance of progerssive supranuclear palsy and multiple system atrophy:a cross-sectional study.Lancet,1999,354:1771-1775.)。

目前認為PSP是一種Tau蛋白病(tauopathy)，病理上可見丘腦底核、腦干以及小腦上腳萎縮、黒質脫色等表現，鏡下可見在基底節、間腦和腦干有Tau蛋白病理性聚集形成的神經元纖維纏結、線型神經纖維網結構、叢狀星形細胞以及少突膠質細胞螺旋小體等結構(Dickson DW,Rademakers R,et al.Progressive supranuclear palsy:pathology and genetics.Brain Pathol,2007；17(1):74-82.)。確診PSP需要依靠上述組織病理學檢查結果，而臨床診斷主要依靠其臨床表現。目前，在PSP發病后期可以通過CT、MRI和PET檢測等功能影像學方法輔助診斷，但沒有在早期較好地客觀輔助醫生進行確診的技術方法。PSP與原發性PD及其他非典型帕金森綜合征，如多系統萎縮(MSA)、皮質基底節變性(CBD)、路易體癡呆(DLB)等都具有相似的癥狀，且早期臨床癥狀不典型，鑒別診斷非常困難，極易造成誤診和漏診(Armstrong RA.Visual signs and symptoms of progressive supranuclear palsy.Clin Exp Optom,2011；94(2):150-160.)，PSP患者從癥狀首發到獲得正確診斷的平均時間是3.6～4.9年(Barsottini OG,Felício AC,et al.Progressive supranuclear palsy:new concepts.Arq Neuropsiquiatr,2010；68(6):938-946.)。此外，近年來發現PSP具有明顯的臨床異質性(clinical heterogeneity)，許多尸檢病理證實的PSP患者生前并不具備上述典型臨床表現，各種臨床變異型相繼得到確認，這不僅推動了PSP疾病分類學的研究，同時也使得PSP的臨床診斷變得愈加復雜，面臨更大的挑戰。

Tau蛋白屬于微管相關蛋白家族成員，主要分布在神經元軸突中，具有促進微管組裝和穩定微管的生理功能。Tau蛋白是由位于人的17q21染色體上的MAPT基因編碼，正常成人腦內存在6種Tau蛋白的異構體。在病理狀態下，過度磷酸化的Tau蛋白聚集形成神經元纖維纏結，最終導致神經細胞死亡。PSP疾病的一個重要的病理特征是神經細胞內有Tau蛋白異常聚集形成的神經纖維纏結，而MAPT基因突變是引發神經纖維纏結的主要因素之一(Longoni G,Agosta F,et al.MRI measurements of brainstem structures in patients with Richardson's syndrome,progressive supranuclear palsy-parkinsonism,and Parkinson's disease.Mov Disord,2010Dec 15.[Epub ahead of print]PubMed PMID:21162106.)。目前許多研究發現，發生在編碼Tau蛋白的MAPT基因上的一些突變，包括R5L、A152T、L284R、S285R、N296del和G303V，都與PSP的發病密切相關。

由于MAPT基因突變是PSP發病因素之一，且PSP具有發病隱匿和明顯的異質性等特點，早期利用基因診斷進行快速檢測非常重要。它可直接檢測被檢者的MAPT基因結構或功能是否異常，相對于常規診斷，更注重個體基因狀態，不僅可以對患者做出進一步診斷，也可以對表型正常但攜帶MAPT基因某種突變或者對疾病的易感性做出判斷，為PSP的快速診斷和早期篩查提供技術支撐。目前應用于PSP風險基因突變檢測的技術主要是聚合酶鏈反應-限制性酶切片段長度多態性(PCR-RFLP)法。該方法是根據MAPT基因突變后堿基的不同選擇一種限制性內切酶，該種內切酶只對其中的一種多態性具有切割的作用，而對另一種多態性不會產生切割。這種方法首先通過引物對MAPT基因的突變位點進行PCR反應，然后對PCR產物使用限制性內切酶進行酶切反應，再把酶切產物進行電泳分析，根據所得到的片斷大小來對MAPT基因多態性位點進行分析。但該方法存在許多不足：首先，該方法依靠限制性內切酶的活性，在酶切過程中容易產生假陽性和假陰性的結果；其次，電泳的方法容易造成PCR產物污染，導致結果的誤判；再次，該方法費時(約5～6h)，耗工，至少包括PCR擴增、酶切、電泳、凝膠成像分析四個步驟，需要大量人工操作，自動化程度低，人為誤差大。

實時熒光PCR具有快速、準確、無污染的特點，已成為分子診斷實驗室的常規儀器平臺。目前，尚未見到利用實時熒光PCR的方法來對MAPT基因R5L、A152T、L284R、S285R、N296del和G303V突變進行研究的報道。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供快速、靈敏、特異的一種檢測MAPT基因突變的探針。

本發明的第二目的在于提供一種檢測MAPT基因突變的試劑盒。

本發明的第三目的在于提供一種檢測MAPT基因突變的方法。

所述檢測MAPT基因突變的探針包括但不限于TaqMan探針、TaqMan-MGB探針、分子信標、改良分子信標、雙鏈熒光置換探針、LightCycler探針、雙環探針等中的至少一種。

所述熒光探針的5’端標記熒光基團，3’端標記相應的淬滅基團。用于檢測MAPT基因編碼蛋白R5L突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白A152T突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白L284R突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白S285R突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白N296del突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白G303V突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示；探針序列可由其堿基互補序列替換。

所述檢測MAPT基因突變的試劑盒包括擴增引物、熒光探針、擴增試劑和參照試劑；

所述擴增引物包括特異性擴增MAPT基因編碼蛋白R5位點的引物，其堿基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；特異性擴增MAPT基因編碼蛋白A152位點的引物，其堿基序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；特異性擴增MAPT基因編碼蛋白L284、S285、N296和G303位點的引物，其堿基序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；引物序列可由其堿基互補序列替換。

所述試劑盒采用兩種不同熒光基團標記的核酸探針在一個反應管內可以同時指示兩個目標片段的存在情況。常用的熒光基團包括但不限于現有的各種熒光標記物，如ALEX-350、FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXAS RED、CY3、CY5、CY5.5等。常用的淬滅基團包括但不限于現有的各種淬滅劑，如DABCYL、BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、ECLIPE等。

所述熒光探針的5’端標記熒光基團，3’端標記相應的淬滅基團。用于檢測MAPT基因編碼蛋白R5L突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白A152T突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白L284R突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白S285R突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白N296del突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白G303V突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示；探針序列可由其堿基互補序列替換。

所述熒光探針包括但不限于TaqMan探針、TaqMan-MGB探針、分子信標、改良分子信標、雙鏈熒光置換探針、LightCycler探針、雙環探針等中的至少一種。

所述擴增試劑包括：PCR反應緩沖液；MgCl₂；熱啟動Taq酶；dATP、dCTP、dGTP、dTTP。所述MgCl₂的濃度可為1～5mmol/L；所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP的濃度均可為50～400μmol/L；所述熱啟動Taq酶的單位可為1～3U/反應。

所述參照試劑包括陽性對照和陰性對照；所述陽性對照為分別包含MAPT基因編碼蛋白的R5、A152、L284、S285、N296和G303位點的陽性標準品1(正常DNA片段)、陽性標準品2(突變DNA片段)和陽性標準品3(由陽性標準品1和陽性標準品2等量混合)；所述陰性對照可自選ddH₂O、Nuclease-free Water、Tris-HCl緩沖液等中的一種。

所述檢測MAPT基因突變的方法，包括以下步驟：

1)樣本的選擇

MAPT基因編碼蛋白R5位點基因型為WT/WT的樣本，基因型為R5L/R5L的樣本，基因型為WT/R5L的樣本，所有的樣本均已通過DNA測序的方法進行驗證；

2)基因組DNA的提取

用常規分子生物學方法或市售試劑盒從抗凝全血中提取人基因組DNA；

3)實時熒光PCR擴增與檢測

實時熒光PCR反應體系包括1×PCR buffer，1.5mmol/L Mg²⁺，200μmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP，0.5μmol/L的上、下游引物，0.5μmol/L各熒光探針，1U熱啟動Taq酶，25ng人基因組DNA；

實時熒光PCR反應在Roche LightCycler 480Ⅱ儀器上進行，按以下條件進行擴增檢測：

第一階段：95℃2min；

第二階段：95℃20sec，64℃20sec(熒光采集)，72℃30sec，38個循環；

兩個熒光檢測頻道分別為FAM和HEX；

4)結果分析

MAPT基因編碼蛋白R5位點基因型判定：只在FAM頻道中有擴增信號產生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產生的樣本為R5L/R5L突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產生的樣本為WT/R5L雜合子。

與現有檢測方法及相關技術相比，本發明具有以下突出優點：

(1)應用實時熒光PCR技術結合熒光探針，可以實時觀察實驗結果。同時檢測更加靈敏、快速，操作更加簡便，易于自動化，大大減少了交叉污染的幾率，提高了檢測的準確性。

(2)在一個反應管中就可以對MAPT基因的一個或多個突變位點進行基因分型，節省成本的同時又提高了通量。

附圖說明

圖1為利用本發明對已知MAPT基因編碼蛋白R5位點基因型的對照樣本和一未知的人基因組樣本進行PCR擴增分析的熒光結果圖。其中(A)為WT/WT陽性標準品1，(B)為R5L/R5L陽性標準品2，(C)為WT/R5L陽性標準品3，(D)為純水樣本作為陰性對照，(E)為未知的人基因組樣本。

圖2為利用本發明對已知MAPT基因編碼蛋白A152位點基因型的對照樣本和一未知的人基因組樣本進行PCR擴增分析的熒光結果圖。其中(A)為WT/WT陽性標準品1，(B)為A152T/A152T陽性標準品2，(C)為WT/A152T陽性標準品3，(D)為純水樣本作為陰性對照，(E)為未知的人基因組樣本。

圖3為利用本發明對已知MAPT基因編碼蛋白L284位點基因型的對照樣本和一未知的人基因組樣本進行PCR擴增分析的熒光結果圖。其中(A)為WT/WT陽性標準品1，(B)為L284R/L284R陽性標準品2，(C)為WT/L284R陽性標準品3，(D)為純水樣本作為陰性對照，(E)為未知的人基因組樣本。

圖4為利用本發明對已知MAPT基因編碼蛋白S285位點基因型的對照樣本和一未知的人基因組樣本進行PCR擴增分析的熒光結果圖。其中(A)為WT/WT陽性標準品1，(B)為S285R/S285R陽性標準品2，(C)為WT/S285R陽性標準品3，(D)為純水樣本作為陰性對照，(E)為未知的人基因組樣本。

圖5為利用本發明對已知MAPT基因編碼蛋白N296位點基因型的對照樣本和一未知的人基因組樣本進行PCR擴增分析的熒光結果圖。其中(A)為WT/WT陽性標準品1，(B)為N296del/N296del陽性標準品2，(C)為WT/N296del陽性標準品3，(D)為純水樣本作為陰性對照，(E)為未知的人基因組樣本。

圖6為利用本發明對已知MAPT基因編碼蛋白G303位點基因型的對照樣本和一未知的人基因組樣本進行PCR擴增分析的熒光結果圖。其中(A)為WT/WT陽性標準品1，(B)為G303V/G303V陽性標準品2，(C)為WT/G303V陽性標準品3，(D)為純水樣本作為陰性對照，(E)為未知的人基因組樣本。

具體實施方式

以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明，本發明并不限于這些實施例中提到的材料、反應條件或參數，任何在相關領域具備經驗的技術人員，都可以按照本發明的原理，利用其它類似材料或反應條件實現本發明所描述的MAPT基因突變的檢測。

實施例1實時熒光PCR檢測MAPT基因編碼蛋白R5L突變位點的基因型

一.材料

1.儀器：

實時熒光PCR儀、移液器、離心機。

2.引物、探針設計：

本發明設計了可以特異擴增包含MAPT基因編碼蛋白R5位點的引物，以及特異識別MAPT基因編碼蛋白R5位點野生型和突變型的探針。野生型探針5’端標記為FAM，3’端標記為BHQ1；野生型探針5’端標記為HEX，3’端標記為BHQ1。

用到的引物和探針信息如表1所示。

表1引物與探針信息列表

3.試劑：

1×PCR buffer：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50mmol/L KCl；MgCl₂；熱啟動Taq酶；dATP、dCTP、dGTP、dTTP。

二.方法

1.樣本的選擇

MAPT基因編碼蛋白R5位點基因型為WT/WT的樣本，基因型為R5L/R5L的樣本，基因型為WT/R5L的樣本。所有的樣本均已通過DNA測序的方法進行驗證。

2.基因組DNA的提取

用常規分子生物學方法或市售試劑盒從抗凝全血中提取人基因組DNA。

3.實時熒光PCR擴增與檢測

實時熒光PCR反應體系包括1×PCR buffer，1.5mmol/L Mg²⁺，200μmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP，0.5μmol/L的上、下游引物，0.5μmol/L各熒光探針，1U熱啟動Taq酶，25ng人基因組DNA。

實時熒光PCR反應在Roche LightCycler 480Ⅱ儀器上進行，按以下條件進行擴增檢測：

第一階段：95℃2min；

第二階段：95℃20sec，64℃20sec(熒光采集)，72℃30sec，38個循環；

兩個熒光檢測頻道分別為FAM和HEX。

4.結果分析

MAPT基因編碼蛋白R5位點基因型判定：只在FAM頻道中有擴增信號產生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產生的樣本為R5L/R5L突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產生的樣本為WT/R5L雜合子。

從圖1可以看出，(A)為已知MAPT基因型的陽性標準品1，只在FAM頻道中有擴增信號產生，為WT/WT純合子，與實際情況相符；(B)為已知MAPT基因型的陽性標準品2，只在HEX頻道中有擴增信號產生，為R5L/R5L突變純合子，與實際情況相符；(C)為已知MAPT基因型的陽性標準品3，在FAM和HEX頻道中均有擴增信號產生，為WT/R5L雜合子，與實際情況相符；(D)為純水作為陰性對照，FAM和HEX頻道均沒有擴增信號信號產生；(E)為未知人基因組樣本，可以看出與(A)結果相同，只在FAM頻道中有擴增信號產生，即為WT/WT純合子，可以判斷該未知樣本的MAPT基因沒有R5L突變。

實施例2實時熒光PCR檢測MAPT基因編碼蛋白A152T突變位點的基因型

按照實施例1的方法和步驟，進行實時熒光PCR擴增。

用到的引物和探針信息如表1所示。

結果分析：

MAPT基因編碼蛋白A152位點基因型判定：只在FAM頻道中有擴增信號產生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產生的樣本為A152T/A152T突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產生的樣本為WT/A152T雜合子。

從圖2可以看出，(A)為已知MAPT基因型的陽性標準品1，只在FAM頻道中有擴增信號產生，為WT/WT純合子，與實際情況相符；(B)為已知MAPT基因型的陽性標準品2，只在HEX頻道中有擴增信號產生，為A152T/A152T突變純合子，與實際情況相符；(C)為已知MAPT基因型的陽性標準品3，在FAM和HEX頻道中均有擴增信號產生，為WT/A152T雜合子，與實際情況相符；(D)為純水作為陰性對照，FAM和HEX頻道均沒有擴增信號信號產生；(E)為未知人基因組樣本，可以看出與(A)結果相同，只在FAM頻道中有擴增信號產生，即為WT/WT純合子，可以判斷該未知樣本的MAPT基因沒有A152T突變。

實施例3實時熒光PCR檢測MAPT基因編碼蛋白L284R突變位點的基因型

按照實施例1的方法和步驟，進行實時熒光PCR擴增。

用到的引物和探針信息如表1所示。

結果分析：

MAPT基因編碼蛋白L284位點基因型判定：只在FAM頻道中有擴增信號產生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產生的樣本為L284R/L284R突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產生的樣本為WT/L284R雜合子。

從圖3可以看出，(A)為已知MAPT基因型的陽性標準品1，只在FAM頻道中有擴增信號產生，為WT/WT純合子，與實際情況相符；(B)為已知MAPT基因型的陽性標準品2，只在HEX頻道中有擴增信號產生，為L284R/L284R突變純合子，與實際情況相符；(C)為已知MAPT基因型的陽性標準品3，在FAM和HEX頻道中均有擴增信號產生，為WT/L284R雜合子，與實際情況相符；(D)為純水作為陰性對照，FAM和HEX頻道均沒有擴增信號信號產生；(E)為未知人基因組樣本，可以看出與(A)結果相同，只在FAM頻道中有擴增信號產生，即為WT/WT純合子，可以判斷該未知樣本的MAPT基因沒有L284R突變。

實施例4實時熒光PCR檢測MAPT基因編碼蛋白S285R突變位點的基因型

按照實施例1的方法和步驟，進行實時熒光PCR擴增。

用到的引物和探針信息如表1所示。

結果分析：

MAPT基因編碼蛋白S285位點基因型判定：只在FAM頻道中有擴增信號產生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產生的樣本為S285R/S285R突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產生的樣本為WT/S285R雜合子。

從圖4可以看出，(A)為已知MAPT基因型的陽性標準品1，只在FAM頻道中有擴增信號產生，為WT/WT純合子，與實際情況相符；(B)為已知MAPT基因型的陽性標準品2，只在HEX頻道中有擴增信號產生，為S285R/S285R突變純合子，與實際情況相符；(C)為已知MAPT基因型的陽性標準品3，在FAM和HEX頻道中均有擴增信號產生，為WT/S285R雜合子，與實際情況相符；(D)為純水作為陰性對照，FAM和HEX頻道均沒有擴增信號信號產生；(E)為未知人基因組樣本，可以看出與(A)結果相同，只在FAM頻道中有擴增信號產生，即為WT/WT純合子，可以判斷該未知樣本的MAPT基因沒有S285R突變。

實施例5實時熒光PCR檢測MAPT基因編碼蛋白N296del突變位點的基因型

按照實施例1的方法和步驟，進行實時熒光PCR擴增。

用到的引物和探針信息如表1所示。

結果分析：

MAPT基因編碼蛋白N296位點基因型判定：只在FAM頻道中有擴增信號產生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產生的樣本為N296del/N296del突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產生的樣本為WT/N296del雜合子。

從圖5可以看出，(A)為已知MAPT基因型的陽性標準品1，只在FAM頻道中有擴增信號產生，為WT/WT純合子，與實際情況相符；(B)為已知MAPT基因型的陽性標準品2，只在HEX頻道中有擴增信號產生，為N296del/N296del突變純合子，與實際情況相符；(C)為已知MAPT基因型的陽性標準品3，在FAM和HEX頻道中均有擴增信號產生，為WT/N296del雜合子，與實際情況相符；(D)為純水作為陰性對照，FAM和HEX頻道均沒有擴增信號信號產生；(E)為未知人基因組樣本，可以看出與(A)結果相同，只在FAM頻道中有擴增信號產生，即為WT/WT純合子，可以判斷該未知樣本的MAPT基因沒有N296del突變。

實施例6實時熒光PCR檢測MAPT基因編碼蛋白G303V突變位點的基因型

按照實施例1的方法和步驟，進行實時熒光PCR擴增。

用到的引物和探針信息如表1所示。

結果分析：

MAPT基因編碼蛋白G303位點基因型判定：只在FAM頻道中有擴增信號產生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產生的樣本為G303V/G303V突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產生的樣本為WT/G303V雜合子。

從圖6可以看出，(A)為已知MAPT基因型的陽性標準品1，只在FAM頻道中有擴增信號產生，為WT/WT純合子，與實際情況相符；(B)為已知MAPT基因型的陽性標準品2，只在HEX頻道中有擴增信號產生，為G303V/G303V突變純合子，與實際情況相符；(C)為已知MAPT基因型的陽性標準品3，在FAM和HEX頻道中均有擴增信號產生，為WT/G303V雜合子，與實際情況相符；(D)為純水作為陰性對照，FAM和HEX頻道均沒有擴增信號信號產生；(E)為未知人基因組樣本，可以看出與(A)結果相同，只在FAM頻道中有擴增信號產生，即為WT/WT純合子，可以判斷該未知樣本的MAPT基因沒有G303V突變。

以下給出具體實施例。

用于檢測MAPT基因突變的試劑盒，包括擴增引物和熒光探針，所述擴增引物包括用于擴增MAPT基因編碼蛋白的R5、A152、L284、S285、N296和G303位點的引物，所述熒光探針包括用于檢測MAPT基因編碼蛋白R5、A152、L284、S285、N296和G303的野生型和突變型探針；

所述試劑盒還包括：

特異性擴增MAPT基因編碼蛋白R5位點的引物，其堿基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

特異性擴增MAPT基因編碼蛋白A152位點的引物，其堿基序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

特異性擴增MAPT基因編碼蛋白L284、S285、N296和G303位點的引物，其堿基序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；

用于檢測MAPT基因編碼蛋白R5位點的野生型和突變型探針，其堿基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；

用于檢測MAPT基因編碼蛋白A152位點的野生型和突變型探針，其堿基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；

用于檢測MAPT基因編碼蛋白L284位點的野生型和突變型探針，其堿基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；

用于檢測MAPT基因編碼蛋白S285位點的野生型和突變型探針，其堿基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示；

用于檢測MAPT基因編碼蛋白N296位點的野生型和突變型探針，其堿基序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示；

用于檢測MAPT基因編碼蛋白G303位點的野生型和突變型探針，其堿基序列如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示；

上述所有序列可由其堿基互補序列替換。

所述探針采用至少兩種不同熒光基團標記，在一個反應管內同時指示至少兩個目標片段的存在情況，所述多種不同熒光基團包括任意發射波長不同的熒光基團的組合。

所述SEQ ID NO:7、9、11、14、16堿基序列的5’和3’兩端分別偶聯上FAM熒光基團和BHQ1淬滅基團；所述SEQ ID NO:8、10、12、13、15、17堿基序列的5’和3’兩端分別偶聯上HEX熒光基團和BHQ1淬滅基團。

所述試劑盒還包括實時熒光PCR反應所需試劑：PCR反應緩沖液；MgCl₂；熱啟動Taq酶；dATP、dCTP、dGTP、dTTP。

所述MgCl₂的濃度可為1～5mmol/L；所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP的濃度均可為50～400μmol/L。

檢測時，每個反應管內包括用于檢測R5L、A152T、L284R、S285R、N296del和G303V突變中至少一種突變的探針，以及相應的擴增引物；對待檢測的DNA樣品進行PCR擴增檢測，根據熒光信號進行結果判斷。

所述PCR擴增反應程序為：95℃2min；95℃20sec，64℃20sec，72℃30sec，38個循環。

結果判斷為：只在FAM頻道中有擴增信號產生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產生的樣本為Mut/Mut突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產生的樣本為WT/Mut雜合子。

所述試劑盒中的熒光探針可用于檢測MAPT基因編碼蛋白R5L、A152T、L284R、S285R、N296del和G303V突變。

序 列 表

<110>廈門大學

<120>一種檢測MAPT基因突變的探針和試劑盒及其方法

<160> 17

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

atctgcctgccatgaactgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

gtcccagcgtgatcttccat 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

gactcttggtggcagtaactt 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

agcttcagcttcctctaagattc 23

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

tggcgtgtcactcatcct 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

cagtgtctcgcaagtgtacg 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

tgagccccgccaggagttc 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

tggctgagcccctccagga 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 9

aacgaagatcgccacaccgc 20

<210> 10

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<212> DNA

<213>人工序列

<400> 10

acgaagatcaccacaccgcg 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<400>11

agctggatcttagcaacgtccagt 24

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 12

aagctggatcgtagcaacgtcc 22

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 13

ctggatcttagaaacgtccagtcc 24

<210> 14

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<212> DNA

<213>人工序列

<400> 14

tggctcaaaggataatatcaaacacgtcc 29

<210>15

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 15

tggctcaaaggatatcaaacacgtcc 26

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<211> 16

<212> DNA

<213>人工序列

<400>1 6

ccgggaggcggcagtg 16

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<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 17

ccgggagtcggcagtgtg 18