一種敲除豬胚胎p66shc基因的方法與流程

本發明主要涉及胚胎工程技術和基因工程領域，具體地說，涉及一種利用CRISPR/Cas9基因編輯方法構建敲除p66^shc基因豬胚胎的方法。

背景技術：

早期胚胎的發育與培養環境中的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平有很大的關系。已有研究結果顯表明，過氧化氫的存在會誘導小鼠受精卵在體外培養過程中發生周期性停滯、凋亡、壞死等生物學事件^[13]。輕微的氧化損傷最初導致線粒體內膜去極化，線粒體基質和細胞內線粒體分布改變；研究發現用H₂O₂處理48h后，受精卵皺縮，72h后發育停滯，出現DNA碎片，表明在胚胎發育的早期，氧化損傷線粒體致線粒體功能不良，可能導致細胞周期停滯和凋亡的主要原因^[13]。有研究表明，胚胎p66^shc(66-kilodahon isoform of Shc gene products)的表達與ROS水平有著密切的關系，而且研究發現，發現牛早期胚胎發育阻滯中胚胎中的p66^shc mRNA水平要顯著高于正常的胚胎^[10]。大約有14％左右的牛體外生產胚胎阻滯在分裂的2-4細胞階段，在這些阻滯的胚胎中發現有大量的ROS存在，主要以H₂O₂形式存在，這些ROS的產生及數量隨著在體外胚胎發育進程而增加；相對于體內胚胎，體外發育胚胎的ROS水平要高得多，產生的這些ROS會對胚胎產生不利的影響，會使得DNA鏈斷裂及蛋白的氧化水平提高等^[17,18]。已有研究也表明，產生的ROS水平能夠引起胚胎發生凋亡，影響胚胎體外發育的效率，同時研究表明p66^shc能夠識別由ROS引起的DNA破壞^[1]。為此，通過降低胚胎內部p66^shc的表達，就能降低胚胎內ROS的產生，從而提高豬胚胎體外發育效率。

眾所周知，CRISPR-Cas系統(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats-associated proteinsystems)是細菌及古細菌進化出來用以抵御病毒和質粒入侵的適應性機制。CRISPR-Ca系統的高效基因組編輯功能已被應用于多種生物，包括斑馬魚、小鼠、大鼠、秀麗隱桿線蟲、植物及細菌。多個科研小組的研究都顯示，與鋅指核酸酶(ZFNs)和轉錄激活樣效應核酸酶(Transcriptionactivator-like effector nucleases,TALEN)相比較，CRISPR-Cas系統介導的基因組靶向實驗在細胞或斑馬魚中顯示出相似甚至更高的效率。CRISPR-Cas9體系的RNA-DNA識別機制為選擇性基因組編輯提供了一個簡便而強大的工具。在實際應用中，CRISPR/Cas系統通常會把兩個編碼trancRNA與crRNA的基因結合成一個單鏈向導RNA(sgRNA)，即現在運用的CRISPR/Cas系統主要是由Cas9蛋白和sgRNA組成。該體系其中一個最重要的優勢是Cas9蛋白可在多個不同的sgRNA(small guide RNA)的引導下同時修飾多個基因組靶點。

基于上述的思路，本發明利用CRISPR/Cas9基因編輯方法在胚胎早期(原核注射方法)，敲除掉p66^shc基因，降低胚胎的ROS表達，通過篩選陽性胚胎，進行后續的研究性工作，從而最終建立高效的豬胚胎體外生產技術體系。

技術實現要素：

本發明旨在構建一種的敲除p66^shc基因豬胚胎生產體系，降低體外胚胎培養過程中的ROS水平，從而通過減少體外培養過程中的損傷等，提高豬胚胎體外生產的效率，最終構建有效的豬胚胎體外生產體系。

為了實現本發明的目的，本發明首先提供一種利用CRISPR-Cas9基因編輯方法敲除主胚胎中p66^shc的方法，具體的操作步驟如下：

(1)設計Oligo DNA序列

在p66^shc基因的表達DNA區域中設計一對20bp左右的oligo DNA，可以通過在線工具設計。按照得分優先選擇1-3對的Oligo合成。另外，需在位點上下游各設計一條引物，用于后續PCR或測序檢測陽性克隆，引物能擴增約300bp的DNA片段，上游引物距突變位點約100bp，下游引物距突變位點約200bp。將設計后的序列送到值得信賴的公司合成，純化級別為PAGE，準備進行下面的實驗。

(2)Oligo的連接

將合成的2條單鏈Oligo DNA稀釋至1μg/μl后，退火形成雙鏈DNA，再與載體連接。pGLKO(Genloci公司購買)是線性載體，無需酶切處理，可直接用于T4 DNA連接酶連接反應。

(3)構建好的質粒轉化與擴增

將上述產物按照常規分子克隆技術方法轉化到大腸桿菌感受態細胞，篩選陽性克隆，挑取陽性克隆擴增培養后，大量提取質粒，得到構建好的包含敲除p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統的表達質粒，保存備用。

(4)質粒轉染細胞驗證敲除效率

首先解凍培養293T細胞，待生長培養傳代2次后，進行轉染操作。共轉染前提，稀釋至質粒濃度為1μg/μl，轉染前48小時，接種細胞至備用生產慢病毒的孔板或是培養皿中，轉染時，細胞匯合度約為70％-80％為最佳感染狀態，活力≥95％以上。以轉染時間為起始點，一次收獲時間為24h后收獲上清，保存于4℃下，如長期保存則在-84℃下。接種適量靶細胞，加入上述收集的含有質粒的病毒顆粒溶液，混勻。將靶細胞有限稀釋后，分到96孔板中進行單克隆培養，待細胞長好后，取1000個左右的細胞，提基因組。然后使用T7核酸內切酶初步篩選陽性克隆，并且對篩選后的陽性克隆進行測序分析，并對堿基缺失結果進行比對分析，從而可以驗證該p66^shc基因CRISPR-Cas9系統的有效性。

(5)p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統構建

設計好上述質粒上Cas9的引物，試劑盒mMESSAGEmMACHINE Ultra Kit(Ambion)其擴增上述得到的Cas9 mRNA，同時用設計好的引物利用試劑盒MEGAshortscript(Ambion)擴增gRNA的序列。得到PCR產物后分別用1.5％凝膠進行電泳，辨認其得到的片段大小。得到p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統mRNA后，保存備用。

(6)豬p66^shc基因敲除胚胎生產

把構建好的豬胚胎，在受精后17h進行胞質注射上述p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統mRNA，按照濃度為10ng/ul，其每個胚胎注射的總量為3ul。在培養后，利用后續的系統檢驗該基因的敲除效果，評價其敲除效率。

(7)p66^shc基因敲除結果驗證

PCR克隆囊胚后的p66^shc基因DNA序列(一般產物在0.5-1K為好)，其引物設計注意得到的產物的突變位點不要位于中間比較好，利用T7內切酶酶切后，凝膠電泳分析，確認其是不是已經敲除。同時，還可以結合利用PCR產物測序后對比分析得出結論。

附圖說明

圖1為通過篩選獲得三對p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統的Oligo引物。

圖2為試驗中涉及的載體結構圖，用于鏈接gRNA和表達用于胚胎注射的mRNA合成模板序列。

圖3為驗證其構建p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統的敲除效率的酶切示意圖。

具體實施方式

(1)設計Oligo DNA序列

首先，在豬流產胎兒組織中提取總的DNA，通過設計p66^shc基因的上游引物和反向的下游引物PCR克隆p66^shc基因全長，然后進行DNA測序，保存序列，分析其啟動子區域備用。接著，在p66^shc基因的表達DNA區域中設計一對20bp左右的oligo DNA，可以通過以下在線工具設計：麻省理工學院的CRISPR Design (http://crispr.mit.edu/)或德國癌癥研究中心的E-Crisp(www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)。按照得分優先選擇1-3對的Oligo合成。通過在線設計，選擇得到如下較好的3對Oligo:

(1).TCAATAAGCCCACGCGGGGCTGG

(2).CCGGGGTTTCCTACTTGGTTCGG

(3).GCGAGGAGTGGACCCGCCACGGG

由此按照連接質粒的要求，分別換成以下3對引物

(1)p66^shc-F:5’…accgGTCAATAAGCCCACGCGGGGC…3’

p66^shc-R:5’…aaacGCCCCCGCGTGGGCTTATTGAC…3’

(2)p66^shc-F:5’…accgGCCGGGGTTTCCTACTTGGTT…3’

p66^shc-R:5’…aaacGAACCAAGTGGAAACCCCGGC…3’

(3)p66^shc-F:5’…accgGCGAGGAGTGGACCCGCCACG…3’

p66^shc-R:5’…aaacGCGTGGCGGGTCCACTCCTCGC…3’

將設計后的序列送到值得信賴的公司合成，純化級別為PAGE，準備進行下面的實驗。

(2)T4 DNA Ligase連接

將合成的2條單鏈Oligo DNA稀釋至1μg/μl后，退火形成雙鏈DNA，再與載體連接。pGLKO線性載體，無需酶切處理，可直接用于T4 DNA連接酶連接反應，退火反應體系如下：

將以上體系瞬時離心后，置于PCR儀中95℃孵育3min，孵育后自然冷卻20min。取1.75μl的雜交后的雙鏈DNA進行T4連接酶連接反應，反應體系如下：

(3)構建好的質粒轉化與擴增

將上述產物按照常規分子克隆技術方法轉化到大腸桿菌感受態細胞，其具體操作過程如下：在LB平板上挑取DH5α的單個菌落接種于3.0mL LB液體培養基中，200rpm過夜振蕩培養；次日按2％的體積接種于新的LB培養基中，200rpm震蕩培養3～4h至OD600＝0.3～0.5；將細菌轉移至1.5mL的滅菌離心管中，每管1.0mL，冰浴30min；4℃12000rpm離心30s；完全棄去上清，用1.0mL 0.1mol/L冰冷的CaCl2重懸細菌，冰浴10min；4℃12000rpm離心30s；完全棄上清，用100μL 0.1mol/L冰冷的CaCl2重懸細菌，放置4℃冰箱24h內備用。取質粒1.0μL(適量)加入到100μL新鮮制備的大腸桿菌感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min；然后置42℃水浴中熱休克90s，迅速置冰中冷卻1～2min；每管加入預熱的800μL LB培養基，37℃200rpm震蕩培養45min；取100μL菌液，然后涂布于相應抗性平板上，37℃培養16～24h。

篩選陽性克隆，挑取陽性克隆擴增培養后，大量提取質粒，具體的操作步驟如下：挑取外源基因與載體連接產物轉化所涂布抗性平板上的單個菌落，接種于3.0mL的含50μg/mL氨芐青霉素的LB培養基中，200rpm過夜振蕩培養。取1.5mL菌液，12000rpm離心30s，沉淀菌體；完全棄去上清后加入300μL 4℃預冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris-Cl，pH8.0；10mmol/L EDTA)重懸細菌；加入新配制的溶液II 300μL(0.2mol/L NaOH；1％SDS)，快速顛倒離心管5次，將離心管置于冰上；加入225μL用冰預冷的溶液III(5mol/L乙酸鉀60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL)，蓋緊管口，將管倒置后溫和顛倒至蛋白變性成白色團塊，置冰上3～5min；4℃12000rpm離心5min，將上清移至新的離心管中；加入等體積的酚∶氯仿，顛倒混勻后置室溫5min，12000rpm離心5min；取上清到新的離心管，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10min；12000rpm離心l0min，棄上清，用70％乙醇洗滌沉淀一次，干燥，加入30μL的TE(pH8.0)或雙蒸水溶解；加入1μL RNase A(10mg/mL)，37℃作用30min。

得到構建好的包含敲除p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統的表達質粒，保存備用。

(4)質粒轉染細胞驗證敲除效率

首先解凍培養293T細胞，待生長培養傳代2次后，進行轉染操作。共轉染前提，稀釋至質粒濃度為1μg/μl，轉染前48小時，接種細胞至備用生產慢病毒的孔板或是培養皿中，轉染時，細胞匯合度約為70％-80％為最佳感染狀態，活力≥95％以上。其具體操作過程如下：

(1).加入800ul 0.25％胰酶消化大概30s，隨時觀察細胞形態，消化結束，加入2倍胰酶體積的完全培養基終止消化，吹打均勻；

(2).5℃，900rpm，離心5min，去上清；

(3).加入1ml PBS，重懸后，25℃，900rpm，離心5min，去上清，重復此步驟1-2次；

(4).加入200ul無血清的培養基，重懸細胞，各加入5μl pGLKO線性載體(Genloci公司)和Packaging Mix(Genloci公司)；

(5).離心過程中，可準備電轉設備，開通電源，移液槍吸取200ul的細胞懸液至電極管中(保證不要出現起泡)，按照1200V，20ms，2次脈沖的電轉條件進行電轉；

(6).電轉結束，放入預先準備好的孔板或是培養皿中，加入適量的含血清濃度為2％～10％的DMEM培養基，細胞培養箱培養。

以轉染時間為起始點，一次收獲時間為24h后收獲上清，保存于4℃下，如長期保存則在-84℃下。接種適量靶細胞，加入上述收集的含有質粒的病毒顆粒溶液，混勻。將靶細胞有限稀釋后，分到96 孔板中進行單克隆培養，待細胞長好后，取1000個左右的細胞，提基因組。然后使用T7核酸內切酶初步篩選陽性克隆，并且對篩選后的陽性克隆進行測序分析，并對堿基缺失結果進行比對分析，從而可以驗證該p66^shc基因CRISPR-Cas9系統的有效性。

(5)p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統構建

設計好上述質粒上Cas9的引物，試劑盒mMESSAGEmMACHINE Ultra Kit(Ambion)其擴增上述得到的Cas9 mRNA，同時用設計好的引物利用試劑盒MEGAshortscript(Ambion)擴增gRNA的序列。得到PCR產物后分別用1.5％凝膠進行電泳，辨認其得到的片段大小。得到p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統mRNA后，保存備用。

(6)豬合子胚胎注射

把構建好的豬胚胎，在受精后17h進行胞質注射上述p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統mRNA，按照濃度為10ng/ul，其每個胚胎注射的總量為3ul。并且按照CRISPR-Cas9系統胚胎組、注射緩沖胚胎組和不注射胚胎組三組進行對比性注射。注射完成后，培養4-6小時，觀察胚胎的存活情況，選擇質量良好的胚胎進行后續的培養，培養6天后觀察。

(7)胚胎發育效率比較

注射p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統胚胎組、注射緩沖胚胎組和不注射胚胎組(對照組)在體外進行后續培養。在胚胎培養液洗2～3遍后轉入25μL微滴中，上蓋礦物油，每滴1-2枚胚胎，38.5℃，飽和濕度，5％CO2培養。44～48h后記錄卵裂數，分別在第6和7天時記錄桑椹胚和囊胚數，觀察不同組別的卵裂率，囊胚胎率等指標。

(8)p66^shc基因敲除結果驗證

選擇發育到囊胚的胚胎通過吸取滋養層5-10個細胞進行RT-PCR檢測p66^shc基因是不是表達，同時計算其敲除的效率。PCR克隆囊胚后的p66^shc基因DNA序列(一般產物在0.5-1K為好)，其引物設計注意得到的產物的突變位點不要位于中間比較好，利用T7內切酶酶切后，凝膠電泳分析，確認其是不是已經敲除。同時，還可以結合利用PCR產物測序后對比分析得出結論。

下表為p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統的Oligo引物設計

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