預示間充質干細胞定向分化潛能的標志物、試劑及試劑盒的制作方法

本發明屬于干細胞領域，涉及預示間充質干細胞定向分化潛能的標志物、試劑及試劑盒。

背景技術：

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種多潛能成體干細胞，在人體發生、發育過程中存在于許多種組織中。20世紀70年代中期，Friedenstein等人[Friedenstein A J,Gorskaja J F,Kulagina N N.Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs.Exp Hematol,1976,4(5):267-274]從骨髓中獲得了少數能貼壁生長的細胞，這些細胞能分化為成骨或軟骨樣的沉著物，該發現被認為首次證實了MSCs的存在。目前，已經從成人的多種間充質組織中分離得到MSCs，這些細胞在體外可以擴增并且可以分化為骨、軟骨、骨髓基質、肌腱、韌帶、脂肪等多種結締組織細胞，以及骨骼肌細胞、神經細胞和神經膠質細胞等等[Reyes M,Lund T,Lenvik T,et al.Purification and ex vivo expansion ofpostnatal human marrow mesodermal progenitor cells.Blood,2001,98:2615-2625]。而且，不論是自體的還是同種異源的MSCs一般都不會引起宿主的免疫反應[Barry F P,Murphy J M.Mesenchymal stem cells:clinical applications and biological characterization.Int J Biochem Cell Biol,2004,36(4):568-584]。因此，MSCs可以作為組織工程的種子細胞，用于組織構建以治療一些機體無法自然修復的組織細胞損傷，有著良好的臨床應用前景。

MSCs的分化潛能有大量研究報道。一方面，體外實驗顯示在特定培養條件下，MSCs可分化為中胚層起源的成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞；內胚層起源的肝細胞、胰島β細胞；外胚層起源的視網膜細胞、神經細胞和神經膠質細胞等。另一方面，動物實驗和臨床表明，將全骨髓或初步純化的骨髓MSCs移植入損傷或轉基因動物及病人體內，骨髓干細胞可遷移并分化為骨骼肌細胞、心肌細胞、肝細胞、膽管細胞、表皮細胞、消化管細胞、肺泡細胞、胰島β細胞、腎細胞、神經細胞和神經膠質細胞等[Grove J E,Bruscia E,Krause D S.Plasticity ofbone marrow-derived stem cells.Stem Cells,2004,22(4):487-500]。

由于MSCs的增殖能力和定向誘導分化潛能，使其在矯形外科、心血管和神經系統等疾病的治療中均顯示出良好的應用前景。研究者試圖篩選出能體外誘導MSCs定向分化的誘導試劑，以有效控制MSCs的分化方向，獲得目標細胞或組織。目前，通常是用待篩選試劑對MSCs體外處理后，培養若干天，通過鑒別培養出的細胞是否具有靶細胞的生物學特點，確定該試劑是否具有誘導MSCs定向分化為目標細胞的能力。這種方法的缺點在于篩選時間長，篩選效率低，不適合高通量篩選。

細胞代謝組學可鑒定生化反應的產物－內源性小分子，揭示一個活細胞中所運轉的不同通路之間的聯系，并可反映和評價健康和病理機體之間的生化差異，反過來可為藥物干預提供一個方向。細胞代謝組學分析可定性、定量地描述胞內調控的最終產物，這些產物是生物系統對遺傳因素或外界環境改變的最終應答。細胞代謝組學研究表明，在強大的細胞代謝網絡中，生化途徑的能動行為可由一個高度互聯的調節系統來控制。目前細胞代謝組學已經在多種領域得到應用，如毒理學[Predicting human developmental toxicity ofpharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics,Toxicol Appl Pharmacol.2010；247(1):18-27]、藥效評價[Metabolic profiling of HepG2cells incubated with S(-)and R(+)enantiomers of anti-coagulating drug warfarin.Metabolomics,2011,7(3):353-362]、細胞培養監測[Metabolomics:a valuable tool for stem cell monitoring in regenerative medicine.Journal of the Royal Society Interface,2012,9(73):1713-24]、新藥研究[Pharmacometabolomics of docetaxel-treated human MCF7breast cancer cells provides evidence of varying cellular responses at high and low doses.Breast Cancer Research and Treatment,2010,120(3):613-626]、生物制藥生產[LC-MS-based metabolic characterization of high monoclonal antibody-producing Chinese hamster ovary cells.Biotechnology and Bioengineering,2012,109(12):3103–3111]等。與其他方法相比，體外細胞代謝組學表現出更多的優勢，如容易控制實驗變化、高度重現性、低成本、結果更易解釋等。

如果能通過細胞代謝組學的方法發現MSCs在誘導分化前、后胞內代謝物的差異，尋找到可以預測MSCs定向分化潛能的標志物，就有可能在MSCs經誘導試劑處理后迅速得知該誘導試劑的定向誘導效果，而不用培養數天后通過細胞生物學特點才能得出結論，必然可以提高篩選定向分化誘導試劑的效率，實現高通量篩選。

技術實現要素：

本發明旨在提供一種預示間充質干細胞定向分化潛能的標志物、試劑及試劑盒，以即時預測經定向誘導處理的MSCs是否具備定向分化為目標細胞的能力，不用培養數天后通過細胞生物學特點才能得出結論，進而提高篩選定向分化誘導試劑的效率，實現高通量篩選。

技術方案公布如下：

一組用于預示間充質干細胞定向分化為心肌樣細胞的潛能的標志物，由α-酮戊二酸、磷酸二羥丙酮、天冬酰胺和花生四烯酸組成。

進一步地，所述間充質干細胞為骨髓間充質干細胞。

一種用于預示間充質干細胞定向分化為心肌樣細胞的潛能的試劑，含有上述的標志物。

進一步地，所述間充質干細胞為骨髓間充質干細胞。

一種用于預示間充質干細胞定向分化為心肌樣細胞的潛能的試劑盒，含有上述的標志物。

進一步地，所述間充質干細胞為骨髓間充質干細胞。

一種篩選能誘導間充質干細胞分化為心肌樣細胞的誘導劑的方法：測定該誘導劑誘導處理后的間充質干細胞中α-酮戊二酸、磷酸二羥丙酮、天冬酰胺和花生四烯酸的含量，并與未經誘導處理的間充質干細胞比較，需同時滿足α-酮戊二酸上調≥4.3倍、磷酸二羥丙酮上調≥3.6倍、天冬酰胺上調≥1.7倍、花生四烯酸上調≥2.1倍。

進一步地，所述間充質干細胞為骨髓間充質干細胞。

一組用于預示間充質干細胞定向分化為神經元樣細胞的潛能的標志物，由苯丙氨酸、半胱氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸和草酰乙酸組成。

進一步地，所述間充質干細胞為骨髓間充質干細胞。

一種用于預示間充質干細胞定向分化為神經元樣細胞的潛能的試劑，含有上述的標志物。

進一步地，所述間充質干細胞為骨髓間充質干細胞。

一種用于預示間充質干細胞定向分化為神經元樣細胞的潛能的試劑盒，含有上述標志物。

進一步地，所述間充質干細胞為骨髓間充質干細胞。

一種篩選能誘導間充質干細胞分化為神經元樣細胞的誘導劑的方法：測定該誘導劑誘導處理后的間充質干細胞中苯丙氨酸、半胱氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸和草酰乙酸的含量，并與未經誘導處理的間充質干細胞比較，需同時滿足苯丙氨酸上調≥3.7倍、半胱氨酸上調≥3.2倍、磷酸烯醇式丙酮酸上調≥2.5倍、草酰乙酸上調≥3.4倍。

進一步地，所述間充質干細胞為骨髓間充質干細胞。

發明效果：

本發明創造提供的標志物α-酮戊二酸、磷酸二羥丙酮、天冬酰胺和花生四烯酸可以聯合作為預示骨髓間充質干細胞BMSCs定向分化為心肌細胞的潛能的標志物，準確性高，效率高；本發明標志物苯丙氨酸、半胱氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸和草酰乙酸可以聯合作為預示骨髓間充質干細胞BMSCs定向分化為神經元樣細胞的潛能的標志物，準確性高，效率高。

附圖說明

圖1為本發明標志物發現和驗證方法邏輯框圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例介紹本發明的技術方案。下述實施例中未特別強調的實驗材料均為常規實驗材料，無特別要求，都是本領域技術人員容易獲得的常規材料。

實施例1：預示骨髓間充質干細胞BMSCs定向分化為心肌細胞的潛能的標志物發現

一、實驗依據(誘導劑：5-氮雜胞苷、血管緊張素Ⅱ、二甲基亞砜)

5-氮雜胞苷[李雪等，5-氮雜胞苷誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為心肌細胞的實驗研究，心臟雜志2004,15(6)]、血管緊張素Ⅱ[石靜寶等，不同濃度血管緊張素Ⅱ誘導骨髓間充質干細胞向心肌細胞的定向分化，中國組織工程研究第18卷第50期]、二甲基亞砜[孫龍云，二甲基亞砜誘導骨髓間充質干細胞向心肌細胞的分化，中國組織工程研究第20卷第1期]是本領域公認的可以誘導骨髓間充質干細胞BMSCs定向分化為心肌細胞的誘導劑。因此，本實施例選擇這三種物質作為誘導劑，通過細胞代謝組學的方法測定BMSCs誘導前后的差異代謝物，尋找可以預示骨髓間充質干細胞BMSCs定向分化為心肌細胞的潛能的標志物。

二、實驗方法

1、BMSCs的分離培養

將大鼠移至無菌操作間內，用無菌器械剝離出四肢長骨，保留骨骺端。用含有雙抗(青霉素10⁵U/L，鏈霉素100mg/L)的D-Hank’s液沖洗大鼠長骨兩次。另取一套無菌器械去除長骨骨骺端顯露骨髓腔，以IMDM培養基(含體積分數10％胎牛血清)反復沖洗骨髓腔，收集沖洗液經無菌濾膜過濾，取一滴細胞懸液加入10μL 0.04％錐蟲藍混勻，血細胞計數板計數活細胞，然后調整接種細胞濃度為1×10⁴L^-1，接種于無菌培養瓶中，置于37℃、體積分數5％CO₂的恒溫培養箱中培養。12h后半量換液，輕柔操作，仔細觀察細胞貼壁情況，至24h完全更換培養基。此后每隔2d換液，當貼壁細胞均勻鋪滿瓶底90％時，即進行傳代。

2、BMSCs的分組和體外誘導

A：5-氮雜胞苷體外誘導。將生長良好、形態均一的第2代大鼠骨髓間充質干細胞培養48h后，去除培養基，PBS洗滌2次以除凈殘余生長培養基，分為添加10μmol/L誘導劑5-氮雜胞苷的5-氮雜胞苷誘導組和不加誘導劑的空白對照A組。5-氮雜胞苷誘導組、空白對照A組分別設23個重復，其中3個重復誘導24h后，去除誘導培養基，加入不含誘導劑的普通培養基繼續培養4周，用于傳統指標的觀察，以確保5-氮雜胞苷可以成功誘導骨髓間充質干細胞分化為心肌樣細胞。剩余20個重復分別編號為5-AT 1～20和Blank A 1～20，誘導培養24h后對細胞進行處理用于代謝分析，處理及分析方法見下。

B：血管緊張素Ⅱ體外誘導。將生長良好、形態均一的第2代大鼠骨髓間充質干細胞培養48h后，去除培養基，PBS洗滌2次以除凈殘余生長培養基，分為添加0.2μmol/L誘導劑血管緊張素Ⅱ的血管緊張素Ⅱ誘導組和不加誘導劑的空白對照B組。血管緊張素Ⅱ誘導組、空白對照B組分別設23個重復，其中3個重復誘導24h后，去除誘導培養基，加入不含誘導劑的普通培養基繼續培養4周，用于傳統指標的觀察，以確保血管緊張素Ⅱ可以成功誘導骨髓間充質干細胞分化為心肌樣細胞。剩余20個重復分別編號為ANT 1～20和Blank B 1～20，誘導培養24h后對細胞進行處理用于代謝分析，處理及分析方法見下。

C：二甲基亞砜體外誘導。將生長良好、形態均一的第2代大鼠骨髓間充質干細胞培養48h后，去除培養基，PBS洗滌2次以除凈殘余生長培養基，分為添加1.0％誘導劑二甲基亞砜的二甲基亞砜誘導組和不加誘導劑的空白對照C組。二甲基亞砜誘導組、空白對照C組分別設23個重復，其中3個重復誘導24h后，去除誘導培養基，加入不含誘導劑的普通培養基繼續培養4周，用于傳統指標的觀察，以確保二甲基亞砜可以成功誘導骨髓間充質干細胞分化為心肌樣細胞。剩余20個重復分別編號為DMSO 1～20和Blank C 1～20，誘導培養24h后對細胞進行處理用于代謝分析，處理及分析方法見下。

訓練集：5-AT 1～20和Blank A 1～20、ANT 1～20和Blank B 1～20、DMSO 1～20和Blank C1～20共同組成訓練集。

3、細胞樣品的取出和前處理

各誘導組和空白組誘導培養24h后將細胞消化制成不含誘導劑的單細胞懸液，調整細胞濃度為1×10⁶個/mL，轉到凍存管中(每管1.5mL)，加入100μL血清和100μLDMSO，最終放在-80℃冰箱保存。

將凍存在-80℃的細胞樣品取出來，迅速放在37℃溫水中恒溫解凍，25℃條件下3000rpm離心5min；將上清的培養基去掉，沉淀加入1mL的PBS溶液搖晃潤洗30s使之懸浮，同樣采取上述條件離心后，棄去上清液；上述沉淀再次加入1.5mL的PBS搖晃30s懸浮后，再經過上述條件離心后，去掉上清PBS溶液；加入-80℃甲醇0.5mL，對細胞樣品進行破碎提取；將樣品放在-80℃冰箱30min，取出使之溶化，置超聲儀中超聲1min；再于4℃條件10000rpm離心10min，取上清，氮氣常溫吹干樣品，置-80℃冰箱保存；進樣前30min將樣品取出，以100μL的10％乙腈復溶后，4℃條件10000rpm離心10min，取上清進樣分析。

4、細胞樣品LC-MS分析條件

色譜系統：Waters Acquity HPLC/Q-TOF；

色譜柱：Phenomenex Luna C18(4.6mm×150mm×3μm)；

流動相：A相為水(含5mM己胺，乙酸調節pH至5.5)；B相為乙腈-水(乙腈和水體積比為8:2；水中含20mM乙酸銨，氨水調節pH至8.5)；

梯度條件：0-20min，10-25％B；20-35min，25-95％B；35-40min，95％B；40-45min，95-10％B；45-50min，10％B；

流速：0.8mL/min；柱溫：35℃；

MS條件：Q-TOF/MS ESI離子源，負離子模式，掃描范圍m/z 50-1500；毛細管電壓3.0kV，錐孔電壓35kV，離子源溫度100℃，干燥氣溫度為350℃，流速800L/h，錐孔氣流量50L/h。

5、誘導組與空白對照組差異代謝物的篩選

定性分析。將LC-MS得到的數據導入SIMCA軟件(version 13.0.2，Umetrics)進行多元統計分析。通過建立OPLS-DA模型，尋找誘導組(包括樣品5-AT 1～20、ANT 1～20和DMSO1～20，共60個樣品)和空白對照組(包括樣品Blank A 1～20、Blank B 1～20和Blank C 1～20，共60個樣品)之間代謝輪廓貢獻較大(VIP＞1.0且p＜0.01)的代謝物，然后將這些代謝物的分子量數據提交至在線數據庫KEGG(http://wwwkeg.com)、METLIN(http://www.metlin.scipps.edu)、HMDB(http://www.hmdb.ca)搜尋，解析化合物質譜，對化合物進行結構鑒定，最終通過這些化合物標準品確證差異代謝物的結構。

定量分析。通過Q-q-Q質譜對差異代謝物定量分析，統計誘導組中差異代謝物相對于空白對照組的變化倍數。

6、用測試集驗證標志物

測試集樣品的制備：按照訓練集樣品的制備方法，制備測試集樣品，包括誘導組5-AT31～90、ANT 31～90、DMSO 31～90和空白對照組Blank A 31～90、Blank B 31～90和Blank C31～90，共180個誘導樣品和180個空白對照樣品。

用上述差異代謝物區分誘導樣品和空白樣品的能力，得到可以用于區分誘導樣品和空白對照樣品進而用于預示骨髓間充質干細胞定向分化為心肌細胞的潛能的標志物。

三、實驗結果

1、原代骨髓間充質干細胞形態

骨髓懸液中原代細胞呈懸浮狀態，大小不一，數目較多，并混有大量紅細胞；接種24h后，可見有少部分細胞貼壁，多呈類圓形或紡錘形，換液后去除未貼壁的細胞。此后每隔2d換液，貼壁細胞逐漸伸出突起，呈扁平三角形或多邊形，核大而飽滿。10d后細胞胞體呈現典型的成纖維細胞狀，核圓形或橢圓形，位于細胞中心，多數細胞排布規則呈放射狀生長。14d左右細胞集落融合超過90％時即可傳代。傳代后的細胞生長迅速，排列較為一致。

2、體外誘導四周后形態學和標記物變化

2.1形態學變化

第2代骨髓間充質干細胞經5-氮雜胞苷、血管緊張素Ⅱ、二甲基亞砜誘導后，細胞形態漸漸出現與空白對照A、B、C組不同的形態。各誘導組的骨髓間充質干細胞誘導7d時形態轉變成類長柱形，28d時細胞體積變小，細胞呈片狀生長，排列一致，呈心肌樣特征。對照組未見類似上述改變，隨換液和傳代次數增多，對照組中細胞大部分為梭形。

2.2免疫細胞化學變化

各誘導組的骨髓間充質干細胞誘導28d時，心肌特異性標記物cTnT、cTnI均呈陽性表達，空白對照A、B、C組心肌特異性標記物cTnT、cTnI均呈陰性表達。

各組心肌特異性抗原陽性細胞百分比見下表。

結果表明，5-氮雜胞苷、血管緊張素Ⅱ、二甲基亞砜可以有效誘導骨髓間充質干細胞體外分化成心肌細胞，為有效誘導劑。

3、誘導組與空白對照組差異代謝物的篩選

通過定性和定量結果發現：與空白對照組相比，誘導組中α-酮戊二酸上調4.3～4.9倍，磷酸二羥丙酮上調3.6～4.4倍，天冬酰胺上調1.7～2.4倍，花生四烯酸上調2.1～2.7倍。

4、測試集驗證結果

從測試集中，隨機選擇30個空白對照樣品，測定其中α-酮戊二酸、磷酸二羥丙酮、天冬酰胺和花生四烯酸的含量各自取均值作為空白參考值。其余測試集樣品隨機分析，且分析人員不知道其分析的樣品是誘導樣品還是空白對照樣品，如果該樣品與空白參考值相比同時符合下述條件即歸為誘導樣品，否則為空白對照樣品：α-酮戊二酸上調≥4.3倍、磷酸二羥丙酮上調≥3.6倍、天冬酰胺上調≥1.7倍、花生四烯酸上調≥2.1倍。

結果發現，該方法準確性非常高，能準確區分150個樣品為誘導樣品還是空白對照樣品，準確率100％，證明α-酮戊二酸、磷酸二羥丙酮、天冬酰胺和花生四烯酸可以聯合作為預示骨髓間充質干細胞BMSCs定向分化為心肌細胞的潛能的標志物。

該實施例表明：α-酮戊二酸、磷酸二羥丙酮、天冬酰胺和花生四烯酸聯合預示價值非常高，可以作為預示BMSCs定向分化為心肌細胞的潛能的標志物，用于高通量篩選可以誘導BMSCs定向分化為心肌細胞的誘導劑，效率高，不需等待數周才能獲知誘導結果。

發明人還考察了BMSCs不同培養基(含15％胎牛血清的DMEM培養液)對標志物結果的影響，結果證明不同培養基并不影響上述結果。

實施例2：預示骨髓間充質干細胞BMSCs定向分化為神經細胞的潛能的標志物發現

一、實驗依據(誘導劑：紅景天苷、全反式維甲酸、甲鈷胺)

紅景天苷[張全偉等，紅景天苷體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為神經元樣細胞，中國組織工程研究第16卷第14期]、全反式維甲酸[張全偉等，紅景天苷體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為神經元樣細胞，中國組織工程研究第16卷第14期]、甲鈷胺[羊明智等，甲鈷胺體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞向神經元樣細胞分化，中國組織工程研究第17卷第32期]是本領域公認的可以誘導骨髓間充質干細胞BMSCs定向分化為神經元細胞的誘導劑。因此，本實施例選擇這三種物質作為誘導劑，通過細胞代謝組學的方法測定BMSCs誘導前后的差異代謝物，尋找可以預示BMSCs定向分化為神經元樣細胞的潛能的標志物。

二、實驗方法

1、BMSCs的分離培養

將大鼠移至無菌操作間內，用無菌器械剝離出四肢長骨，保留骨骺端。用含有雙抗(青霉素10⁵U/L，鏈霉素100mg/L)的D-Hank’s液沖洗大鼠長骨兩次。另取一套無菌器械去除長骨骨骺端顯露骨髓腔，以IMDM培養基(含體積分數10％胎牛血清)反復沖洗骨髓腔，收集沖洗液經無菌濾膜過濾，取一滴細胞懸液加入10μL 0.04％錐蟲藍混勻，血細胞計數板計數活細胞，然后調整接種細胞濃度為1×10⁴L^-1，接種于無菌培養瓶中，置于37℃、體積分數5％CO₂的恒溫培養箱中培養。12h后半量換液，輕柔操作，仔細觀察細胞貼壁情況，至24h完全更換培養基。此后每隔2d換液，當貼壁細胞均勻鋪滿瓶底90％時，即進行傳代。

2、BMSCs的分組和體外誘導

A：紅景天苷體外誘導。將生長良好、形態均一的第2代大鼠骨髓間充質干細胞培養48h后，去除培養基，PBS洗滌2次以除凈殘余生長培養基，分為添加20mg/L誘導劑紅景天苷的紅景天苷誘導組和不加誘導劑的空白對照D組。紅景天苷誘導組、空白對照D組分別設23個重復，其中3個重復誘導24h后，去除誘導培養基，加入不含誘導劑的普通培養基繼續培養6天，用于傳統指標的觀察，以確保紅景天苷可以成功誘導骨髓間充質干細胞分化為神經元樣細胞。剩余20個重復分別編號為HJTG 1～20和Blank D 1～20，誘導培養24h后對細胞進行處理用于代謝分析，處理及分析方法見下。

B：全反式維甲酸體外誘導。將生長良好、形態均一的第2代大鼠骨髓間充質干細胞培養48h后，去除培養基，PBS洗滌2次以除凈殘余生長培養基，分為添加5μg/L誘導劑維甲酸的維甲酸誘導組和不加誘導劑的空白對照E組。維甲酸誘導組、空白對照E組分別設23個重復，其中3個重復誘導24h后，去除誘導培養基，加入不含誘導劑的普通培養基繼續培養6天，用于傳統指標的觀察，以確保維甲酸可以成功誘導骨髓間充質干細胞分化為神經元樣細胞。剩余20個重復分別編號為WJS 1～20和Blank E 1～20，誘導培養24h后對細胞進行處理用于代謝分析，處理及分析方法見下。

C：甲鈷胺體外誘導。將生長良好、形態均一的第2代大鼠骨髓間充質干細胞培養48h后，去除培養基，PBS洗滌2次以除凈殘余生長培養基，分為添加100mg/L誘導劑甲鈷胺的甲鈷胺誘導組和不加誘導劑的空白對照F組。甲鈷胺誘導組、空白對照F組分別設23個重復，其中3個重復誘導24h后，去除誘導培養基，加入不含誘導劑的普通培養基繼續培養6天，用于傳統指標的觀察，以確保甲鈷胺可以成功誘導骨髓間充質干細胞分化為神經元樣細胞。剩余20個重復分別編號為JKA 1～20和Blank F 1～20，誘導培養24h后對細胞進行處理用于代謝分析，處理及分析方法見下。

訓練集：HJTG 1～20和Blank D 1～20、WJS 1～20和Blank E 1～20、JKA 1～20和Blank F 1～20共同組成訓練集。

3、細胞樣品的取出和前處理

各誘導組和空白組誘導培養24h后將細胞消化制成不含誘導劑的單細胞懸液，調整細胞濃度為1×10⁶個/mL，轉到凍存管中(每管1.5mL)，加入100μL血清和100μLDMSO，最終放在-80℃冰箱保存。

將凍存在-80℃的細胞樣品取出來，迅速放在37℃溫水中恒溫解凍，25℃條件下3000rpm離心5min；將上清的培養基去掉，沉淀加入1mL的PBS溶液搖晃潤洗30s使之懸浮，同樣采取上述條件離心后，棄去上清液；上述沉淀再次加入1.5mL的PBS搖晃30s懸浮后，再經過上述條件離心后，去掉上清PBS溶液；加入-80℃甲醇0.5mL，對細胞樣品進行破碎提取；將樣品放在-80℃冰箱30min，取出使之溶化，置超聲儀中超聲1min；再于4℃條件10000rpm離心10min，取上清，氮氣常溫吹干樣品，置-80℃冰箱保存；進樣前30min將樣品取出，以100μL的10％乙腈復溶后，4℃條件10000rpm離心10min，取上清進樣分析。

4、細胞樣品LC-MS分析條件

色譜系統：Waters Acquity HPLC/Q-TOF；

色譜柱：Phenomenex Luna C18(4.6mm×150mm×3μm)；

流動相：A相為水(含5mM己胺，乙酸調節pH至5.5)；B相為乙腈-水(乙腈和水體積比為8:2；水中含20mM乙酸銨，氨水調節pH至8.5)；

梯度條件：0-20min，10-25％B；20-35min，25-95％B；35-40min，95％B；40-45min，95-10％B；45-50min，10％B；

流速：0.8mL/min；柱溫：35℃；

MS條件：Q-TOF/MS ESI離子源，負離子模式，掃描范圍m/z 50-1500；毛細管電壓3.0kV，錐孔電壓35kV，離子源溫度100℃，干燥氣溫度為350℃，流速800L/h，錐孔氣流量50L/h。

5、誘導組與空白對照組差異代謝物的篩選

定性分析。將LC-MS得到的數據導入SIMCA軟件(version 13.0.2，Umetrics)進行多元統計分析。通過建立OPLS-DA模型，尋找誘導組(包括樣品HJTG 1～20、WJS 1～20和JKA1～20，共60個樣品)和空白對照組(包括樣品Blank D 1～20、Blank E 1～20和Blank F 1～20，共60個樣品)之間代謝輪廓貢獻較大(VIP＞1.0且p＜0.01)的代謝物，然后將這些代謝物的分子量數據提交至在線數據庫KEGG(http://wwwkeg.com)、METLIN(http://www.metlin.scipps.edu)、HMDB(http://www.hmdb.ca)搜尋，解析化合物質譜，對化合物進行結構鑒定，最終通過這些化合物標準品確證差異代謝物的結構。

定量分析。通過Q-q-Q質譜對差異代謝物定量分析，統計誘導組中上述差異代謝物相對于空白對照組的變化倍數。

6、用測試集驗證標志物

測試集樣品的制備：按照訓練集樣品的制備方法，制備測試集樣品，包括誘導組HJTG31～90、WJS 31～90、JKA 31～90和空白對照組Blank D 31～90、Blank E 31～90和Blank F 31～90，共180個誘導樣品和180個空白對照樣品。

用上述差異代謝物區分誘導樣品和空白樣品的能力，得到可以用于區分誘導樣品和空白樣品進而用于預示骨髓間充質干細胞定向分化為神經元樣細胞的潛能的標志物。

三、實驗結果

1、原代骨髓間充質干細胞形態

骨髓懸液中原代細胞呈懸浮狀態，大小不一，數目較多，并混有大量紅細胞；接種24h后，可見有少部分細胞貼壁，多呈類圓形或紡錘形，換液后去除未貼壁的細胞。此后每隔2d換液，貼壁細胞逐漸伸出突起，呈扁平三角形或多邊形，核大而飽滿。10d后細胞胞體呈現典型的成纖維細胞狀，核圓形或橢圓形，位于細胞中心，多數細胞排布規則呈放射狀生長。14d左右細胞集落融合超過90％時即可傳代。傳代后的細胞生長迅速，排列較為一致。

2、體外誘導四周后形態學和標記物變化

2.1形態學變化

利用免疫熒光法標記細胞骨架β-Tubulin觀察誘導前后細胞的形態結構。第2代骨髓間充質干細胞經紅景天苷、全反式維甲酸、甲鈷胺誘導后，細胞形態漸漸出現與空白對照D、E、F組不同的形態。空白對照組BMSCs形態多呈多角形或紡錘形，紅景天苷、全反式維甲酸、甲鈷胺誘導12h時可見部分細胞胞體變大，有突起形成，24h后大多數細胞胞體普遍增大、可見2個以上不等的突起形成，誘導6d后形成典型的神經樣細胞，胞體變小、突起細長。

2.2免疫細胞化學變化

各誘導組的骨髓間充質干細胞誘導6d時，神經細胞特異性標志分子NSE和β-Tubulin均呈陽性表達，空白對照D、E、F組NSE和β-Tubulin均呈陰性表達。陽性率見下表。

結果表明，紅景天苷、全反式維甲酸、甲鈷胺可以有效誘導骨髓間充質干細胞體外分化成神經元樣細胞，為有效誘導劑。

3、誘導組與空白對照組差異代謝物的篩選

通過定性和定量結果發現：與空白對照組相比，誘導組中苯丙氨酸上調3.7～4.3倍，半胱氨酸上調3.2～3.9倍，磷酸烯醇式丙酮酸上調2.5～2.9倍，草酰乙酸上調3.4～3.8倍。

4、測試集驗證結果

從測試集中，選擇30個空白對照樣品，測定其中苯丙氨酸、半胱氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸和草酰乙酸的含量各自取均值作為空白參考值。其余測試集樣品隨機分析，且分析人員不知道其分析的樣品是誘導樣品還是空白對照樣品，如果該樣品與空白參考值相比同時符合下述條件即歸為誘導樣品，否則為空白對照樣品：苯丙氨酸上調≥3.7倍、半胱氨酸上調≥3.2倍、磷酸烯醇式丙酮酸上調≥2.5倍、草酰乙酸上調≥3.4倍。

結果發現，該方法準確性非常高，能準確區分150個樣品為誘導樣品還是空白對照樣品，準確率100％，苯丙氨酸、半胱氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸和草酰乙酸可以聯合作為預示骨髓間充質干細胞BMSCs定向分化為神經元樣細胞的潛能的標志物。

該實施例表明：苯丙氨酸、半胱氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸和草酰乙酸聯合預示價值非常高，可以作為預示BMSCs定向分化為神經元樣細胞的潛能的標志物，用于高通量篩選可以誘導BMSCs定向分化為神經細胞的誘導劑，效率高，不需等待數天才能獲知誘導結果。

發明人還考察了BMSCs不同培養基(含15％胎牛血清的DMEM培養液)對標志物結果的影響，結果證明不同培養基并不影響上述結果。

上述具體實施例僅用于解釋本發明的技術方案，本領域技術人員應當明白，本發明的保護范圍并不受限于上述具體實施例。