本發明公開了一種采用氧化酶拆分α-羥酸酯的方法，屬于工業微生物領域。
背景技術：
α-羥酸酯(alpha-hydroxy esters)是α-羥酸與醇酯化脫水后得到產物，在醫藥領域有著廣泛的應用，如丹參素與異丙醇脂化后生成的丹參素異丙酯等。
化學合成的外消旋α-羥酸酯常用的酶拆分的方法是采用脂肪酶或酯酶水解方案，如一種酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法(中國專利201510212293.4)、豬胰脂肪酶作水解拆分甘油丁酸酯(縮水甘油丁酸酯的對映選擇性酶促水解.華南理工大學學報，1999，25(2)：209～212)、Novozym 435對羥基苯甘氨酸甲酯的不對稱水解(脂肪酶催化外消旋對羥基苯甘氨酸甲酯水解制備對映體純D-對羥基苯甘氨酸的新方法.催化學報，2005，26(2)：106～110)等。但脂肪酶的立體選擇性不高，很難在高回收率下得到99％以上的光學純產品。
本發明采用α-羥酸氧化酶進行α-羥酸酯的手性拆分，α-羥酸氧化酶家族已知成員有：乳酸氧化酶、乙醇酸氧化酶、扁桃酸氧化酶和長鏈α-羥酸氧化酶等。這些酶通常被用于外消旋α-羥酸的手性拆分(中國專利201210109290.4)。
技術實現要素：
α-羥酸氧化酶拆分外消旋α-羥酸酯的步驟為：稱取外消旋α-羥酸酯加入到反應器中使外消旋α-羥酸酯的初始反應濃度為1-40mM，再加入pH為4-10的反應緩沖液和α-羥酸氧化酶形成反應體系，α-羥酸氧化酶用量為1-100μg/ml，在20-50℃下水浴搖床150r/min振蕩，反應時間為1-24小時，α-羥酸氧化酶氧化其對應的α-羥酸酯。按照此方法進行拆分，對映體過量高達到99.9％，產率最高接近50％。
產物(R)-α-羥酸酯的光學純度通過對映體過量值(％e.e)來評價。
當采用L-α-羥酸氧化酶拆分時，得到光學純的(R)-α-羥酸酯(D-α-羥酸酯)
對映體過量值％e.e＝[(SR-SS)/(SR+SS)]×100％
(R)-α-羥酸酯得率(％)＝(SR/S0)×100％
當采用D-α-羥酸氧化酶拆分時，得到光學純的(S)-α-羥酸酯(L-α-羥酸酯)
對映體過量值％e.e＝[(SS-SR)/(SR+SS)]×100％
(S)-α-羥酸酯得率(％)＝(SR/S0)×100％
式中SS為反應后(S)-對映體的峰面積，SR為反應后(R)-對映體的液相色譜峰面積，S0為反應前(S)-和(R)-對映體的液相色譜峰面積總和。
產物測定的液相色譜條件為：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流動相體積比為正己烷：異丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5mL/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，進樣量20μL。
所述的α-羥酸酯為下列之一：丹參素冰片酯、丹參素異丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸異丙酯、對羥基苯乳酸冰片酯、對羥基苯乳酸異丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸異丙酯、丹參素細辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸細辛醇酯、對羥基苯乳酸細辛醇酯、乳酸乙醇酯、α-羥基丁酸丙醇酯。所述的α-羥酸酯，可以根據中國專利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。
本發明所用的α-羥酸氧化酶有：L型和D型兩類。
L型α-羥酸氧化酶有：鼠肝α-羥酸氧化酶(根據文獻制備得到：Aliphatic l-α-hydroxyacid oxidase from rat livers purification and properties.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)–Enzymology,1968,167:9-22)，雞肝α-羥酸氧化酶(根據文獻制備得到：Purification and some characteristics of chicken liver L-2-hydroxyacid oxidase A.FEBS Lett.1990,266:183-6)，Pediococcus sp.乳酸氧化酶(購自sigma),Aerococcus viridans乳酸氧化酶(購自日本Asahi Kasei Pharma Corporation)，Lactococcus lacti乳酸氧化酶(根據文獻制備得到：Gene cloning,purification,and characterization of a lactate oxidase from Lactococcus lactis subsp.cremoris IFO3427，Journal of Fermentation and Bioengineering，1998,85(5),507-510)。
D型α-羥酸氧化酶有：Archaeoglobus fulgidus乳酸氧化酶(根據文獻制備得到：Cellular localization of D-lactate dehydrogenase and NADH oxidase from Archaeoglobus fulgidus，Archaea.2002；1(2):95-104),Sulfolobus tokodaii乳酸氧化酶(根據文獻制備得到：A novel flavin adenine dinucleotide(FAD)containing d-lactate dehydrogenase from the thermoacidophilic crenarchaeota Sulfolobus tokodaii strain 7:purification,characterization and expression in Escherichia coli.J Biosci Bioeng.2008，106(1):16-21)，
本發明的有益之處：本專利所指的氧化酶均以FAD或FMN為輔酶，與以NAD或NADP為輔酶的羥酸脫氫酶或乳酸脫氫酶相比，逆反應極微弱，無論提取的酶液或α-羥酸氧化酶的基因工程菌全細胞均適用于規模化制備手性純α-羥酸酯。同時該方法解決了脂肪酶水解拆分法光學選擇性差的缺點，具有重要的工業應用價值。
具體實施方式
實施例1
配制5ml反應體系，外消旋丹參素異丙酯濃度為40mM，L型鼠肝α-羥酸氧化酶濃度為100μg/ml，pH6，30℃水浴搖床150r/min振蕩24小時，測定(R)-丹參素異丙酯的對映體過量為99.9％，產率為49.9％。
實施例2
配制5ml反應體系，外消旋丹參素冰片酯濃度為1mM，L型雞肝α-羥酸氧化酶濃度為1μg/ml，pH7，35℃水浴搖床150r/min振蕩1小時，測定(R)-丹參素冰片酯的對映體過量為85.2％，產率為36.2％。
實施例3
配制10ml反應體系，外消旋丹參素細辛醇酯濃度為5mM，L型Pediococcus sp.乳酸氧化酶濃度為50μg/ml，pH 8，40℃水浴搖床150r/min振蕩12小時，測定(R)-丹參素細辛醇酯的對映體過量為99.7％，產率為49.8％。
實施例4
配制10ml反應體系，外消旋乳酸冰片酯濃度為10mM，L型Aerococcus viridans乳酸氧化酶濃度為5μg/ml，pH 4，40℃水浴搖床150r/min振蕩8小時，測定(R)-乳酸冰片酯的對映體過量為73.1％，產率為38.5％。
實施例5
配制5ml反應體系，外消旋苯乳酸冰片酯濃度為20mM，L型Lactococcus lacti乳酸氧化酶濃度為10μg/ml，pH 5，45℃水浴搖床150r/min振蕩8小時，測定(R)-苯乳酸冰片酯的對映體過量為95.2％，產率為44.4％。
實施例6
配制5ml反應體系，外消旋苯乳酸異丙酯濃度為30mM，D型Archaeoglobus fulgidus乳酸氧化酶濃度為20μg/ml，pH 6，50℃水浴搖床150r/min振蕩4小時，測定(S)-苯乳酸異丙酯的對映體過量為91.9％，產率為40.5％。
實施例7
配制5ml反應體系，外消旋對羥基苯乳酸冰片酯濃度為1mM，D型Sulfolobus tokodaii乳酸氧化酶濃度為30μg/ml，pH 7，20℃水浴搖床150r/min振蕩2小時，測定(S)-對羥基苯乳酸冰片酯的對映體過量為99.9％，產率為49.9％。
實施例8
配制5ml反應體系，外消旋對羥基苯乳酸異丙酯濃度為5mM，L型鼠肝α-羥酸氧化酶濃度為40μg/ml，pH 8，25℃水浴搖床150r/min振蕩4小時，測定(R)-對羥基苯乳酸異丙酯的對映體過量為79.6％，產率為38.9％。
實施例9
配制5ml反應體系，外消旋扁桃酸冰片酯濃度為10mM，L型雞肝α-羥酸氧化酶濃度為50μg/ml，pH 9，30℃水浴搖床150r/min振蕩6小時，測定(R)-扁桃酸冰片酯的對映體過量為99.9％，產率為49.9％。
實施例10
配制5ml反應體系，外消旋扁桃酸異丙酯濃度為20mM，L型Pediococcus sp.乳酸氧化酶濃度為60μg/ml，pH 6，35℃水浴搖床150r/min振蕩8小時，測定(R)-扁桃酸異丙酯的對映體過量為99.9％，產率為49.9％。
實施例11
配制5ml反應體系，外消旋苯乳酸細辛醇酯濃度為30mM，L型Aerococcus viridans乳酸氧化酶濃度為100μg/ml，pH 7，40℃水浴搖床150r/min振蕩10小時，測定(R)-苯乳酸細辛醇酯的對映體過量為95.9％，產率為46.9％。
實施例12
配制5ml反應體系，外消旋乳酸對羥基苯乳酸細辛醇酯濃度為1mM，L型Lactococcus lacti乳酸氧化酶濃度為30μg/ml，pH 8，45℃水浴搖床150r/min振蕩12小時，測定(R)-對羥基苯乳酸細辛醇酯的對映體過量為99.9％，產率為49.9％。
實施例13
配制5ml反應體系，外消旋乳酸乙醇酯濃度為40mM，D型Archaeoglobus fulgidus乳酸氧化酶濃度為30μg/ml，pH 9，50℃水浴搖床150r/min振蕩14小時，測定(S)-乳酸乙醇酯的對映體過量為99.9％，產率為49.9％。本實施例中液相測定所用的檢測器為視差檢測器。
實施例14
配制5ml反應體系，外消旋α-羥基丁酸丙醇酯濃度為1mM，D型Sulfolobus tokodaii乳酸氧化酶濃度為20μg/ml，pH 7，30℃水浴搖床150r/min振蕩20小時，測定(S)-α-羥基丁酸丙醇酯的對映體過量為99.9％，產率為49.9％。本實施例中液相測定所用的檢測器為視差檢測器。