利用家蠶卵黃原蛋白啟動子性別和組織特異性表達外源基因及方法
【專利摘要】本發明提供利用家蠶卵黃原蛋白啟動子在性別特異性和組織特異性地表達外源基因中的用途以及方法。該方法突破傳統轉基因家蠶不能有效的雌雄特異性和組織特異性的表達外源基因的局限性，首次開發和利用家蠶卵黃原蛋白啟動子在家蠶細胞系和轉基因家蠶中性別特異性和組織特異性地表達外源基因。從而首次利用轉基因家蠶的性別表達可控制性和組織表達可控制性，擴展了家蠶的應用領域，保持蠶業的可持續發展，并可研究害蟲的遺傳控制。
【專利說明】利用家蠶卵黃原蛋白啟動子性別和組織特異性表達外源基因及方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】。具體地說，本發明涉及利用家蠶(Bombyx moriLinnaeus)卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)啟動子進行性別特異性和組織特異性地表達外源基因的方法和應用。
【背景技術】
[0002]家蠶是絹絲昆蟲，同時也是鱗翅目昆蟲中重要的經濟昆蟲和模式生物，為我國的經濟發展做出了巨大貢獻并且正在為中國的經濟可持續發展進一步做著更大的貢獻。隨著我國家蠶基因組計劃宣布家蠶基因組框架圖的完成，標志著家蠶后基因組時代的到來，功能基因組學的主要工作包括:大量功能基因的克隆鑒定、重要生物學性狀的分子調控機理，以及實現人為控制和調節這些基因和性狀以滿足人類的需求。因此，利用家蠶作為昆蟲，特別是鱗翅目昆蟲的遺傳防治的研究對象，將在農林業害蟲遺傳防治方面產生重大的影響，而且還將在鱗翅目其他昆蟲中推廣應用。
[0003]然而，現階段的家蠶轉基因中，使用最多的啟動子大都是外源性啟動子，例如來自家蠶NPV病毒的IE1。而本領域技術人員知道，目前利用的外源性啟動子有各種各樣的缺陷，例如，目前所用的外源性啟動子不具備時間和空間特異性，如性別或組織的特異性，進而無法對昆蟲進行特異性地調控，或者給外源性基因產物的檢測或純化帶來種種困難。此外，本領域技術人員知道，內源性啟動子對成功建立轉基因體系至關重要。然而，目前在家香中尚未有相關啟動子的報道。
[0004]因此，本領域急需獲得家蠶體內的性別特異性和組織特異性的啟動子。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種能夠性別特異性和組織特異性地驅動外源基因表達的啟動子及其用途和使用方法。
[0006]在第一方面，本發明提供一種分離的卵黃原蛋白啟動子，所述的卵黃原蛋白啟動子為選自下組的序列:
[0007](a)如SEQ ID N0.:1所示的核苷酸序列；
[0008](b)與SEQ ID N0.:1所示序列的同源性≥95% (較佳地≥98%)，且基本具有SEQIDN0.:1所示多核苷酸功能的核苷酸序列；或
[0009](c)在SEQ ID N0.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短一個或多個，較佳地1-30，更佳地1-6個核苷酸，且基本具有SEQ ID N0.:1所示多核苷酸功能的多核苷酸。
[0010]在優選的實施方式中，所述卵黃原蛋白啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所
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[0011]在第二方面，本發明提供一種構建物，所述構建物含有外源基因以及本發明第一方面所述的卵黃原蛋白啟動子。[0012]在優選的實施方式中，所述構建物具有在雌性鱗翅目昆蟲的脂肪體中性別特異性和組織特異性地表達外源基因的功能。
[0013]在進一步的優選實施方式中，所述鱗翅目昆蟲是家蠶。
[0014]在第三方面，本發明提供一種表達盒，所述表達盒從5’至3’依次具有下述元件:本發明第一方面所述的卵黃原蛋白啟動子、外源基因ORF序列和終止子。
[0015]在優選的實施方式中，所述的表達盒還包括選自下組的一種或多種元件:poly(A)元件、增強子、轉運元件或基因靶向元件。
[0016]在另一優選的實施方式中，所述表達盒具有在雌性鱗翅目昆蟲的脂肪體中性別特異性和組織特異性地表達外源基因的功能。[0017]在進一步的優選實施方式中，所述鱗翅目昆蟲是家蠶。
[0018]在第四方面，本發明提供一種載體，所述載體含有本發明第一方面所述的卵黃原蛋白啟動子、或本發明第三方面所述的表達盒。
[0019]在優選的實施方式中，所述載體具有在雌性鱗翅目昆蟲的脂肪體中性別特異性和組織特異性地表達外源基因的功能。
[0020]在進一步的優選實施方式中，所述鱗翅目昆蟲是家蠶。
[0021]在第五方面，本發明提供一種昆蟲細胞，所述昆蟲細胞含有本發明第四方面所述的載體、或其染色體整合有本發明第一方面所述的卵黃原蛋白啟動子、或其染色體整合有本發明第三方面所述的表達盒。
[0022]在優選的實施方式中，所述昆蟲細胞具有在雌性鱗翅目昆蟲的脂肪體中性別特異性和組織特異性表達外源基因的功能。
[0023]在優選的實施方式中，所述宿主細胞的染色體具有一個或多個(如1-50個，較佳地2-6個)拷貝的本發明第一方面所述啟動子、或本發明第三方面所述的表達盒。
[0024]在另一優選實施方式中，所述的昆蟲細胞是鱗翅目昆蟲，優選家蠶。
[0025]在第六方面，本發明提供本發明第一方面所述的啟動子，第二方面所述的構建物，第三方面所述的表達盒或第四方面所述的載體的用途，所述啟動子、構建物、表達盒或載體在雌性鱗翅目昆蟲中性別特異性地表達外源基因。
[0026]在優選的實施方式中，所述啟動子在雌性鱗翅目昆蟲的脂肪體中性別特異性和組織特異性地表達外源基因。
[0027]在另一優選實施方式中，所述的鱗翅目昆蟲是家蠶。
[0028]在第七方面，本發明提供一種在雌性鱗翅目昆蟲中性別特異性地表達外源基因的方法，所述方法包括以下步驟:
[0029](a)提供本發明第二方面所述的構建物；
[0030](b)將步驟(a)中的構建物導入雌性鱗翅目昆蟲細胞或雌性鱗翅目昆蟲卵，獲得轉化的雌性昆蟲細胞或昆蟲卵；
[0031](C)培養步驟(b)中轉化的鱗翅目昆蟲細胞或將所述昆蟲卵再生成昆蟲，從而使外源基因在雌性鱗翅目昆蟲細胞或雌性鱗翅目昆蟲中特異性表達。
[0032]在優選的實施方式中，所述外源基因在雌性鱗翅目昆蟲的脂肪體中特異性表達。
[0033]在優選的實施方式中，所述鱗翅目昆蟲是家蠶。
[0034]在第八方面，本發明提供一種制備雌性轉基因昆蟲的方法，包括步驟:[0035](a)提供昆蟲卵，所述昆蟲卵含有本發明第四方面所述的載體、或其染色體整合有本發明第一方面所述的啟動子、或其染色體整合有本發明第三方面所述的表達盒；
[0036](b)將所述的轉基因昆蟲卵再生為昆蟲，從而獲得雌性轉基因昆蟲。
[0037]在優選的實施方式中，所述昆蟲是鱗翅目昆蟲，優選家蠶。
[0038]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0039]圖1顯示了家蠶卵黃原蛋白啟動子克隆及轉基因質粒的構建。A:合成的啟動子PUC-57-Vgp質粒酶切(EcoRI和Sail)圖譜，白色箭頭所指處為Vgp ；B:用pXL-BacI1-Blank質粒構建目的轉基因質粒，在多克隆酶切位點插入待檢驗啟動子和報告基因EGFP ；C:構建的三種轉基因質粒，分別為含有啟動子和報告基因、只含啟動子或只含有報告基因的三種質粒，圖示為關鍵元件在質粒上的位置；
[0040]圖2顯示了家蠶卵黃原蛋白基因啟動子在BmN細胞中的表達。A:為空白對照，即，不加入任何質粒=PXLBacI1-1ElDsRed2-Vgp在BmN細胞中的轉染結果；C:PXLBacI1-1ElDsRed2-EGFP 在 BmN 細胞中的轉染結果；D =PXLBacI1-1ElDsRed2-VgpEGFP 在BmN細胞中的轉染結果。“紅”表示在紅色熒光下觀察結果，“綠”代表在綠色熒光下觀察的結果; [0041]圖3顯示了 PXLBacI1-1ElDsRed2-Vgp-EGFP質粒在家蠶蛹期的表達。分別在白光、綠色熒光、紅色熒光下觀察雌雄的熒光表達。
【具體實施方式】
[0042]發明人經過廣泛而深入的研究，出乎意料地發現家蠶卵黃原蛋白基因啟動子能夠性別特異性和組織特異性地表達，從而能夠性別特異性和組織特異性地表達外源基因，進而擴展了家蠶的應用領域以及可以研究昆蟲，特別是鱗翅目昆蟲的遺傳控制。在此基礎上完成了本發明。
[0043]鱗翅目
[0044]鱗翅目包括蛾、蝶兩類昆蟲。屬于有翅亞綱、全變態類。全世界已知約20萬種，中國已知約8000余種。該目為昆蟲綱中僅次于鞘翅目的第2個大目。包括麥蛾科；粉蝶科，如麥蛾、棉紅鈴蟲、馬鈴薯塊莖蛾和甘薯麥蛾等；卷蛾科，如棉褐帶卷蛾、大豆食心蟲等；螟蛾科，如梨大食心蟲、玉米螟等；尺蛾科，如大造橋蟲等；粉蝶科，如菜粉蝶等；夜蛾科，如粉蚊夜蛾、棉鈴蟲等；毒蛾科，如舞毒蛾等；鳳蝶科，如玉帶風蝶、金風蝶等；舟蛾科，如舟形毛蟲等；燈蛾科，如黃腹燈蛾、紅腹燈蛾、美國白蛾等；天蛾科，如葡萄天蛾等；蠶蛾科，如家蠶等；天蠶蛾科，如樗蠶等；弄蝶科，如稻苞蟲等。
[0045]鱗翅目昆蟲的分布范圍極廣，以熱帶種類最為豐富。絕大多數種類的幼蟲為害各類栽培植物，體形較大者常食盡葉片或鉆蛀枝干。體形較小者往往卷葉、綴葉、結鞘、吐絲結網或鉆入植物組織取食為害。成蟲多以花蜜等作為補充營養，或口器退化不再取食，一般不造成直接危害。[0046]綜上所述，鱗翅目昆蟲周大多數是害蟲，也有少數，例如家蠶是有經濟價值的昆蟲。因此，對鱗翅目昆蟲的性別特異性和組織特異性啟動子進行研究，對于害蟲的防治以及有經濟價值的轉基因產物將產生極大的現實意義。
[0047]因此，在優選的實施方式中，本發明的鱗翅目昆蟲是家蠶。
[0048]目前昆蟲轉基因技術常用轉座子的方式進行。piggyBac轉座子是一種來源于鱗翅目昆蟲的轉座子，最初是通過桿狀病毒(Baculovirus)侵染粉蚊夜蛾(Trichoplusia ni)TN-368 細胞株系，從 Galleria mellonella(GmMNPV)和 Autographa californica(AcMNPV)核多角體病毒內首次分離得到的，在粉紅色螟蛉蟲(Pectinophora gassypiella)胚胎、家蠶(Bombyx mori)卵細胞的切除測試等都證明了 piggyBac轉座子切除的準確性。在黃色傷寒蚊(Aedes aegypti)、粉蚊夜蛾和家蠶卵細胞內等的實驗也顯示了 piggyBac能夠進行順利轉座，而且切除和轉座的頻率都較高。在家蠶中的研究始于1997年，發現piggyBac轉座子對家蠶的轉座作用，研究人員隨后利用piggyBac轉座子對家蠶進行了研究。piggyBac轉座子的深入研究將為害蟲的遺傳防治奠定理論基礎。
[0049]啟動子
[0050]本文所用的術語“啟動子”是指一種準確有效起始基因轉錄功能的核酸序列，其引導基因核酸序列轉錄為mRNA，通常存在于目的基因編碼序列的上游(5，端)。啟動子或啟動子區域一般提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它因子的識別位點。
[0051]本文所用的術語“本發明啟動子”、“卵黃原蛋白啟動子”、“Vg啟動子”、“Vgp啟動子”、“Vgp”或“性別特異性和組織特異性的啟動子”或“雌性特異性或脂肪體特異性的啟動子”具有相同的含義，在本文中可互換使用；具體地說，本發明的啟動子表示來源于鱗翅目昆蟲，優選家蠶的，具有SEQ ID N0.:1所示核苷酸序列或其活性片段的啟動子:CAAGCTTGGCGCGCCCCCGATCCATTAACAGTGCTTTTAGGTACCACAAGCACCGGTCACCGTTGTCGTCGAACCCGTCGCTTGCGACGAAGGGCTCGACGAGCGAATTAACCCATAGACACAGCCCACTGAGTTTCTTGCCGGATCTTCTAGGTGGGTCGCGTTTCCGATCCGGTGGTAGATTCTGCGAAGCACTGCCCTTGCTAGGGCCAGTGTTAGCAACACTCCGGTTTGAACGCCGTGAGCTAACCTACACGTTAGGGCGAAGCTGAAATAGCCTCTCAAGGCTATCAGCATAGGTAGGAAAAAAAAAGCAATTTTGTCCATATTCCTATAATTCGAAATTCCAGATATTTTTTTTATTGCCTTTGTAGGCAGACGGGCATACGGCCCACCTGATGGTGAGTGGTTACCGTCGCCCATGGACTTCAGCAATGCCAGGGGCAGAGCCAAGCCGCTGCCTACCGCTTAACACTCTCCACAAGCCTCGTTTGAAGAAGGACATGTCATAGCGCTCGGTAAACACCGTGGAGGGGAGCTCATTCCATAGCCGGATGGTACGCGATCTTTCGCGTTCTAATTTTTATTTTATTAAAAGCGAATATTCGCGCTTGATTTAACTCCTCGCCCCAGTTCCCTCAAATTTCAGTCTCCACAAAGACAAAGGAATAAGAAAATGATTCGTTACATTGTATTTTATCTGTGTTTACTATCTAGGGTCACAGTTCTGGGACGCGTGTACCCTCCCTATATAAAGGGGGTGACCTGGCCAGAGATGTTCAGATCCGCTAGCATATG(SEQ IDNO:1)。
[0052]鑒于本發明的教導和現有技術，本領域普通技術人員不難理解，盡管本發明的實例中提供了來源于家蠶的Vg啟動子，但是來源于鱗翅目的其它昆蟲，尤其是與家蠶屬于同一科或屬的，例如亞洲玉米螟，棉鈴蟲，與本發明啟動子具有一定同源性(保守性)的啟動子，也包括在本發明的范圍內，只要本領域技術人員在閱讀了本申請后根據本申請提供的信息可以方便地從其它昆蟲中分離得到該啟動子并驗證其功能。 [0053]因此，本發明包括與本發明的優選啟動子序列(SEQ ID N0.:1)具有50%或以上(優選60%以上，70%以上，80%以上，更優選90%以上，更優選95%以上，最優選98%以上，如99%)同源性的核酸，所述核酸也具有性別特異性和組織特異性表達外源性基因的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，兩條或多條核酸之間的相似水平(即序列相似性或同一I"生)。
[0054]同樣，本領域技術人員還應理解，所述啟動子或啟動子區(域)包括啟動子的變體，啟動子變體可以通過插入或刪除調控區域，進行隨機或定點突變等來獲得。
[0055]因此，在具體的實施方式中，本發明還包括在SEQ ID N0.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短一個或多個，較佳地1-30，更佳地1-6個核苷酸，且基本具有SEQ ID N0.:1所示多核苷酸功能的多核苷酸。
[0056]卵黃原蛋白
[0057]在大多數昆蟲中，卵黃原蛋白(Vg)在天然狀態下是一種寡聚糖磷脂蛋白，分子量為200-700kD，等電點為6.1-6.3。昆蟲Vg是由6_7kb的mRNA編碼的分子量約為200kD的前體蛋白，經修飾后成為由幾個亞基組成。它的單體可由1-4個亞基構成，包括一個分子量大于180kD的大亞基和分子量小于50kD的小亞基。在家蠶中，Vg前體被酶切為一個大分子量的亞基(>180kD)和一個小分子量的亞基(<50kD)，通常情況下昆蟲Vg含有幾個比較保守的結構域或氨基酸基序，如多聚絲氨酸區(polyserine domains)、GL/ICG、RXXR、DGXR和C-端半胱氨酸等。昆蟲Vg序列中的多聚絲氨酸區域多位于N-末端，也有少數位于C-端，其位置相對保守。多聚絲氨酸區域的個數在昆蟲中也是不相同的。鱗翅目昆蟲中的鳳蝶總科和夜蛾總科，卵黃發生在成蟲羽化前就已經開始，JH對其Vg的合成和卵子成熟是必需的。從體外培養的美洲粘蟲的咽側體中釋放出的JH與脂肪體Vg合成的速率呈正相關；在去頭的雌蟲中，Vg合成受到抑制，而用JH處理時，又能恢復Vg的合成。在家蠶的蛹期，咽側體摘除不能抑制4齡幼蟲脂肪體中Vg的合成和卵成熟，而用蛻皮激素處理時，血淋巴中Vg和卵巢內Vt的含量 顯著增加，并隨著劑量的增加而增加。在吐絲期老齡幼蟲的腹部和胸部處結扎，能夠阻止前胸合成與分泌20E，且能抑制Vg的合成；向其腹腔注射少量的20E，則能誘導Vg的合成與成熟，蛻皮激素對于家蠶卵黃發生和Vg的合成是必須的。
[0058]因此，研究家香的Vg啟動子不僅能揭不家香卵黃原蛋白的表達和調控機理，而且將為研究鱗翅目昆蟲的利用和防治提供有效的基因工程元件。
[0059]性別特異性和組織特異性
[0060]本文所用的術語“性別特異性”表示本發明的啟動子特異性地在某種性別中驅動基因，優選外源基因的表達。在具體的實施方式中，本發明的啟動子在雌性鱗翅目昆蟲中驅動基因，優選外源基因的表達。在優選的實施方式中，本發明的啟動子在家蠶中驅動基因，優選外源基因的表達。
[0061 ] 類似地，本文所用的術語“組織特異性”表示本發明的啟動子特異性地在某種組織中驅動基因，優選外源基因的表達。在具體的實施方式中，本發明的啟動子在雌性鱗翅目昆蟲的脂肪體中驅動基因，優選外源基因的表達。在優選的實施方式中，本發明的啟動子在家蠶的脂肪體中驅動基因，優選外源基因的表達。
[0062]本發明啟動子的功能和用途
[0063]本發明提供的啟動子能夠高效、專一地在雌性鱗翅目昆蟲，優選家蠶的脂肪體中表達。因此，本發明的啟動子可以用于鱗翅目昆蟲，優選家蠶中性別特異性和組織特異性地表達轉基因以及害蟲的遺傳控制。[0064]在具體的實施方式中，本發明的啟動子在雌性鱗翅目昆蟲的脂肪體中性別特異性和組織特異性地表達外源基因，所述啟動子選自下組:
[0065](a)核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示的多核苷酸；
[0066](b)核苷酸序列與SEQ ID N0.:1所示序列的同源性≥95% (較佳地≥98%)，且基本具有SEQ ID N0.:1所示多核苷酸功能的多核苷酸；或
[0067](c)在SEQ ID N0.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短一個或多個，較佳地1-30，更佳地1-6個核苷酸，且基本具有SEQ ID N0.:1所示多核苷酸功能的多核苷酸。
[0068]在優選的實施方式中，所述啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示。
[0069]在進一步的優選實施方式中，所述鱗翅目昆蟲是家蠶(Bombyx mori Linnaeus)。
[0070]性別特異性和組織特異性地表達外源基因的方法
[0071]本發明提供在雌性鱗翅目昆蟲中性別特異性和組織特異性地表達外源基因的方法，所述方法包括以下步驟:
[0072](a)提供一構建物，所述構建物含有外源基因以及本發明啟動子；
[0073](b)將步驟(a)中的構建物導入雌性鱗翅目昆蟲細胞或雌性鱗翅目昆蟲卵，獲得轉化的雌性昆蟲細胞或昆蟲卵；
[0074](C)培養步驟(b)中轉化的鱗翅目昆蟲細胞或將所述昆蟲卵再生成昆蟲，從而使外源基因在雌性鱗翅目細胞或雌性鱗翅目昆蟲的脂肪體中特異性表達。
[0075]在一優選例中，所述鱗翅目昆蟲是家蠶。
[0076]本發明還提供一種構建物，所述構建物含有外源基因以及本發明的啟動子。
[0077]在優選的實施方式中，所述構建物具有在雌性鱗翅目昆蟲，優選家蠶的脂肪體中性別特異性和組織特異性地表達外源基因的功能。
[0078]本發明還提供一種表達盒，所述表達盒從5’至3’依次具有下述元件:本發明的啟動子、外源基因ORF序列和終止子。
[0079]在優選的實施方式中，所述的表達盒還包括選自下組的一種或多種元件:poly(A)元件、增強子、轉運元件或基因靶向元件。
[0080]在優選的實施方式中，所述表達盒具有在雌性鱗翅目昆蟲，優選家蠶的脂肪體中性別特異性和組織特異性地表達外源基因的功能。
[0081 ] 本發明提供一種載體，所述載體含有本發明的啟動子、或本發明的表達盒。
[0082]在優選的實施方式中，所述載體具有在雌性鱗翅目昆蟲，優選家蠶的脂肪體中性別特異性和組織特異性地表達外源基因的功能。
[0083]本發明的啟動子、構建物、表達盒或載體可用于在雌性鱗翅目昆蟲，優選家蠶中性別特異性地表達外源基因；優選地，在雌性鱗翅目昆蟲，優選家蠶的脂肪體中性別特異性和組織特異性地表達外源基因。
[0084]本發明還提供一種昆蟲細胞，所述昆蟲細胞含有本發明的載體、或其染色體整合有外源性的本發明啟動子、或其染色體整合有本發明的表達盒。
[0085]在優選的實施方式中，所述昆蟲細胞(優選鱗翅目昆蟲，更優選家蠶)具有在脂肪體中組織特異性表達外源基因的功能。
[0086]在優選的實施方式中，所述宿主細胞的染色體具有一個或多個(如1-50個，較佳地2-6個)拷貝的本發明啟動子元件、或本發明的表達盒。[0087]本發明還提供一種制備雌性轉基因昆蟲的方法，包括步驟:
[0088](a)提供昆蟲卵，所述昆蟲卵含有本發明的載體、或其染色體整合有本發明的啟動子、或其染色體整合有本發明的表達盒；
[0089](b)將所述的轉基因昆蟲卵再生為昆蟲，從而獲得雌性轉基因昆蟲。
[0090]在一優選例中，所述昆蟲是鱗翅目昆蟲，優選家蠶。
[0091]本發明的優點:
[0092]1.本發明首次發現家蠶卵黃原蛋白啟動子能夠性別特異性和組織特異性地表達外源基因；
[0093]2.本發明利用家蠶卵黃原蛋白啟動子，通過轉基因家蠶在雌性個體表達外源基因，突破傳統轉基因家蠶不能性別特異性和組織特異性的表達外源基因的局限性，成功實現了性別特異性和組織特異性表達；
[0094]3.本發明首次利用轉基因家蠶的性別表達可控制性和組織表達可控制性，擴展了家蠶的應用領域，保持蠶業的可持續發展，進而可以研究害蟲的遺傳控制。
[0095]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0096]實施例1.載體的構建
[0097]本發明利用的PXL-BaCI1-1El-DSRed2注射轉座子載體是piggyBac衍生來的(參見 Elick 等，Genetica, 1996 ；W0 2006122442)，在 Piggybac 轉座子載體中導入了由啟動子(Kojima等，Virus Research, 2008)驅動的紅色突光蛋白DsRed (NCBI登錄號:AJ851284 ；SEQ ID NO: 2)，構建 PXL-BacI1-1El-DsRed2 轉基因載體。家蠶 Vgp 啟動子序列來自Vg蛋白上游800bp序列，通過分段全基因合成法獲得，并克隆在載體PUC-57 (SangonBiotech)上。用含有 KpnI 和 ApaI 的特異性引物 VgF (CGGGGTACCCCGCCCGATCCATTAACAGTGCT，SEQ ID NO:3)和 VgR(AAGGGCCCTTGGATCTGAACATCTCTGGCC，SEQ ID NO:4)用高保真酶KOD(Genview)從載體質粒roC-57-vgp進行PCR擴增，克隆到pMD-18T (TaKaRa)上，構建成質粒pMD-18T-Vgp，測序正確后用KpnI和ApaI (NEB)分別酶切pMD-18T_Vgp和PXL-BacI1-1El-DsRed2,然后將vgp片段插入到載體質粒PXL-BacI1-1El-DsRed2上，構建成質粒 PXL-BacI1-1El-DsRed2-Vgp。同時用含有 ApaI 的特異性引物 EGF(ATGTTCAGATCCAAGGGCCGCCACCATGGTGAGCAAGG, SEQ ID NO:5)和 EGR (TCGACCTCGAGGGGTTCGTACGCGTATCGATAAGCTTTAA, SEQID NO:6)用 KOD 酶擴增 EGFP(NCBI 登錄號:HQ416901 ；SEQ ID NO:7),膠收后連接到PMD-18T載體上測序，構建成質粒PMD-18T-EGFP，獲得正確的序列后，用ApaI酶切PXL-BaCI1-1El-DSRed2和pMD_18T_EGFP，膠收目的片段后連接，獲得目的質粒PXL-BacI1-1El-DsRed2-EGFP,用 ApaI 酶切 PXL-BacI1-1El-DsRed2_Vgp 和 pMD_18T_EGFP，膠收目的片段后連接，獲得目的質粒PXL-BaCI1-1El-DSRed2-Vgp-EGFP，經測序正確備用。
[0098]實施例2.BmN細胞水平的檢測
[0099]將構建好的三種質粒分別轉入家蠶卵巢細胞(BmN細胞，參見EP0225777)中，如果該Vgp啟動子有活性并且如預測的那樣具有組織特異性和性別特異性，即，只在某種性別的特定器官中表達，那么實驗中將會觀察到有綠色熒光。實驗用的細胞轉染方法參照Qiagen公司生產的Effectene Transfection Reagent kit試劑盒,方法簡要如下:取24孔板,選擇12孔，每孔加入300ul的BmN細胞，隔夜培養。將轉染質粒PXL-BacI1-1El-DsRed2-EGFP、PXL-BacI1-1El-DsRed2-VgpEGFP, PXL-BacI1-1El-DsRed2-Vgp 純化準備好，稀釋濃度到200ng/ul。在超凈臺進行如下操作:分別取70ul的EC加入1.5ml的EP管；再取7.5ul的質粒加入，混勻;加入12ul的Enhance,混勻，靜置4min ;加入15ul的Effectance,混勻，靜置lOmin，期間將24孔板中的培養液吸去；然后加900ul的小牛血清培育基到EP管中，混合后，分別加到3個孔中，密封；28°C培養箱培養。72小時后,在突光聚焦顯微鏡下觀察轉染結果。
[0100]三種質粒的轉染結果如圖2所示。從結果可以得出結論:該啟動子可以在家蠶的卵巢細胞中表達。參見圖2.C，Vgp啟動子驅動報告基因表達(即質粒PXLBacI1-1ElDsRed2-VgpEGFP)，而在對照A中沒有觀察到任何的熒光和實驗組B、C沒有檢測到綠色熒光。同時從實驗結果可以知道該啟動子在BmN細胞中驅動報告基因EGFP表達時間較晚，這是因為在家蠶體內卵巢表達卵黃原蛋白水平遠遠低于脂肪體表達量。
[0101]本實施例證明本發明的啟動子可以在雌性環境中驅動報告基因表達。
[0102]實施例3.轉基因家蠶的獲得以及檢測啟動子的特異性表達
[0103]本實施例中，將只含有報告基因、含有啟動子和報告基因以及只含啟動子的三種質粒，即，PXL-BacI1-1El-DsRed2-EGFP 、 PXL-BacI1-1El-DsRed2_Vgp-EGFP、PXL-BacI1-1El-DsRed2_Vgp 分別與 PHA3PIG (Tamura 等., Nature Biotechnology, 2000,還可參見EP1482035 ;用作輔助質粒產生轉座酶)等量混合后注射到家蠶初產卵(產下后4_8小時)中，注射質粒DNA的純化試劑盒用Qiagen公司的Plasmid Midi kit試劑盒純化,注射方法參照Kanda&Tamura(1991)描述的方法進行家蠶顯微注射。注射后的蠶卵用無毒膠封口以防止污染。在25°C條件 下，進行催青直到孵化，飼養孵化出來的蟻蠶，將當代(GO)的蠶蛾自交，獲得Gl代蠶卵，在熒光顯微鏡下挑出轉基因個體飼養，待其生長到蛹期檢測啟動子的表達。
[0104]發明人通過以下方法檢測啟動子的特異性表達:
[0105]為驗證該啟動子是否具有性別特異性和組織特異性，可檢測外源基因表達是否具有性別特異性和組織特異性。獲得轉基因材料可通過觀察紅色熒光，進而挑選出有紅色熒光蛋白表達的蠶卵即可。觀察轉染三種質粒的細胞在綠色熒光和紅色熒光下的表達狀況，確定其在雌性細胞中的表達以及快速確定該質粒和啟動子功能是否正常。通過蛹期區分不同性別，在綠色熒光下檢測外源基因綠色熒光蛋白(GFP)的表達可以確定其是否具有性別特異性表達，以及通過解剖來確定表達部位。若是其他基因可通過相應的分子生物學手段檢測。
[0106]從圖3可知，攜帶有啟動子Vgp和報告基因EGFP的質粒已經成功轉入到家蠶基因組中并且可以穩定表達(IEl-DsRed2為參照系統)，并且只在雌性蛹期觀察到了綠色熒光的強表達。由圖3還可以明顯看出，雌性蠶蛹有明顯的熒光產生，而雄性蠶蛹沒有熒光。經過對蠶蛹進行解剖，發明人發現熒光出現在脂肪體中。
[0107]因此，本實施例證明本發明的啟動子能在雌性家蠶的脂肪體中性別特異性和組織特異性地驅動報告基因的表達。
[0108]在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
【權利要求】
1.一種分離的卵黃原蛋白啟動子，其特征在于，所述的卵黃原蛋白啟動子為選自下組的序列: (a)如SEQID N0.:1所示的核苷酸序列； (b)與SEQID N0.:1所示序列的同源性≤95%(較佳地≤98%)，且基本具有SEQIDN0.:1所示多核苷酸功能的核苷酸序列；或 (c)在SEQID N0.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短一個或多個，較佳地1-30，更佳地1-6個核苷酸，且基本具有SEQ ID N0.:1所示多核苷酸功能的多核苷酸。
2.—種構建物，其特征在于，所述構建物含有外源基因以及權利要求1所述的卵黃原蛋白啟動子。
3.—種表達盒，其特征在于，所述表達盒從5’至3’依次具有下述元件:權利要求1所述的卵黃原蛋白啟動子、外源基因ORF序列和終止子。
4.一種載體，其特征在于，所述載體含有權利要求1所述的卵黃原蛋白啟動子、或權利要求3所述的表達盒。
5.一種昆蟲細胞，其特征在于，所述昆蟲細胞含有權利要求4所述的載體、或其染色體整合有權利要求1所述的卵黃原蛋白啟動子、或其染色體整合有權利要求3所述的表達盒。
6.如權利要求1所述的卵黃原蛋白啟動子，權利要求2所述的構建物，權利要求3所述的表達盒或權利要求4所述的載體的用途，其特征在于，所述卵黃原蛋白啟動子，構建物，表達盒或載體在雌性鱗翅目昆蟲中性別特異性地表達外源蛋白。
7.—種在雌性鱗翅目昆蟲中性別特異性地表達外源基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (a)提供權利要求2所述的構建物； (b)將步驟(a)中的構建物導入雌性鱗翅目昆蟲細胞或雌性鱗翅目昆蟲卵，獲得轉化的雌性昆蟲細胞或昆蟲卵； (C)培養步驟(b)中轉化的鱗翅目昆蟲細胞或將所述昆蟲卵再生成昆蟲，從而使外源基因在雌性鱗翅目昆蟲細胞或雌性鱗翅目昆蟲中特異性表達。
8.一種制備雌性轉基因昆蟲的方法，包括步驟: (a)提供昆蟲卵,所述昆蟲卵含有權利要求4所述的載體、或其染色體整合有權利要求1所述的卵黃原蛋白啟動子、或其染色體整合有權利要求3所述的表達盒； (b)將所述的轉基因昆蟲卵再生為昆蟲，從而獲得雌性轉基因昆蟲。
【文檔編號】C12N15/85GK103865927SQ201210553180
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月18日 優先權日:2012年12月18日
【發明者】譚安江, 許軍, 尤朗, 黃勇平 申請人:中國科學院上海生命科學研究院