一種引物組合物及其應用的制作方法

本發明涉及生物技術領域，涉及醫學分子診斷及生物技術，具體涉及一種引物組及其應用，尤其涉及一種用于肥厚型心肌病相關致病基因熱點突變的檢測的引物組合物及其應用。

背景技術：

肥厚型心肌病(HCM)為一種最常見的遺傳性心臟疾病，主要表現為左心室或雙心室不對稱性肥厚，較少患者表現出左室流出道梗阻。主要病理特征為心肌細胞彌漫性肥大、畸形、核大、深染和心肌纖維紊亂等。HCM臨床表現從無征兆到呼吸困難、暈厥、胸痛甚至發生心源性猝死和致命性的心律失常。

HCM是第一個從遺傳角度闡明病因的遺傳性心臟疾病。1990年在一個加拿大家族性肥厚型心肌病患者中發現第一個致病基因MYH7，其遵循的是常染色體顯性遺傳模式。HCM的全球發病率和年死亡率分別約為1/500和1％。相關證據表明，Zou等人隨機抽查中國9個省的成年人8080人，其中男性4064人，女性4016人，并對其進行超聲心動圖檢測，結果表明中國人群患HCM的概率大約為0.8/500。實際上，超聲心動圖對肥厚型心肌病的檢測為一種患病后的診斷方式，還存在更多潛在的HCM患者，依此推斷，中國人群中至少存在200萬HCM患者。該病也是是青少年和年輕運動員猝死的最主要原因之一，Morn等人對1986-2006年猝死的1886名美國年輕運動員進行統計分析發現，死亡的主要原因為心血管疾病1056名，占約56％，其中HCM的患者就占據了36％。

眾多研究表明，HCM主要由肌節基因突變所致，故HCM又稱為肌小節疾病。HCM主要遵循常染色體顯性遺傳模式，大約有50％的HCM患者為家族性遺傳，稱為家族性肥厚型心肌病(FHCM)。對HCM患者進行基因檢測和家族篩 查能夠為臨床診斷提供重要的指導作用，主要體現為：1)產前診斷，指導優生優育；2)輔助明確診斷，進行臨床干預；3)家族篩查，進行家族疾病發生風險評估及管理。

目前，遺傳疾病基因突變的檢測方法較多，如：限制性片段長度多太性、單鏈構象多態性、高分辨率溶解曲線分析、熒光定量PCR的檢測方法、PCR擴增直接測序和高通量測序。上方法各有優缺點，毛細管電泳技術是基因突變檢測的金標準，但因其對設備的要求高、價格昂貴等缺點，很難從實驗室普及到臨床，熒光定量PCR具有快速、簡便、經濟和準確等特點。

CN 102965428A公開了一種檢測遺傳性心肌肥厚相關基因突變樣品制備試劑盒。該試劑盒采用探針捕獲測序，與其他傳統的DNA芯片雜交和毛細管電泳測序技術一樣，不僅費時費力，而且價格昂貴，根本不能滿足對HCM的基因檢測。

值得一提的是TaqMan-MGB熒光定量PCR的檢測方法，該方法與傳統的TaqMan不同的是在探針的3’端連接了非熒光的猝滅基團MGB(minor groove binder，MGB)，當探針序列與模板結合時，MGB能高度結合于DNA雙鏈的小溝，增加了寡核苷酸探針和單鏈模板結合的穩定性，由此通過縮短探針序列長度，增加探針序列的特異性，實現了能區分一個堿基的差別。當具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶對堿基進行延伸時，可把發光基團解離下來，解除了非熒光的猝滅基團對發光基團的抑制，實現了熒光信號的積累與PCR產物的同步進行，從而能較好的區分野生型、純合突變和雜合突變樣本。TaqMan-MGB對單核苷酸多態性檢測方面有較多的應用，如：慢性骨髓增殖性疾病、病原微生物的耐藥突變檢測和腫瘤細胞P⁵³基因突變等。

CN 104388595 A公開了一種豬圓環病毒2型實時熒光定量 PCRMGB-TaqMan探針檢測方法，該方法利用熒光定量PCR技術，采用MGB探針，建立了豬圓環病毒2型(PCV2)檢測方法。但目前MGB探針還未用于HCM的檢測。

因此，為肥厚型心肌病建立一種簡便、快速、經濟和準確的突變篩查方法，為肥厚型心肌病的預防、輔助臨床診斷和預后評估提供技術平臺顯得尤為重要。

技術實現要素：

針對現有技術的不足及實際的需求，本發明提供了一種引物組及其應用，本發明通過所述引物組可以構建陽性野生型和純合突變型五個熱點突變位點(MYH7-c.1987C>T、TNNI3-c.370G>C、MYH7-c2155C>T、TNNI3-c.433C>G和PRKAG2-c.298G>A)的載體，應用ABI7500實時熒光PCR儀，對每個陽性樣品同時進行聯合檢測，建立一種簡便、快速、準確和經濟的肥厚型心肌病基因突變檢測方法，為肥厚型心肌病的臨床早期診斷和預防提供了新的技術平臺。

為達到上述目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供一種引物組合物，所述引物組合物包括檢測MYH7-c.1987C>T、TNNI3-c.370G>C、MYH7-c2155C>T、TNNI3-c.433C>G或PRKAG2-c.298G>A這五個熱點突變位點的五組實時熒光PCR引物和Taqman-MGB探針序列中的至少一組。

優選地，所述檢測MYH7-c.1987C>T熱點突變位點的實時熒光PCR引物的核酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述Taqman-MGB探針的核酸序列如SEQ ID NO.3-4所示；

優選地，所述檢測TNNI3-c.370G>C熱點突變位點的實時熒光PCR引物的核酸序列如SEQ ID NO.5-6所示，所述Taqman-MGB探針的核酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；

優選地，所述檢測MYH7-c2155C>T熱點突變位點的實時熒光PCR引物的核酸序列如SEQ ID NO.9-10所示，所述Taqman-MGB探針的核酸序列如SEQ ID NO.11-12所示；

優選地，所述檢測TNNI3-c.433C>G熱點突變位點的實時熒光PCR引物的核酸序列如SEQ ID NO.13-14所示，所述Taqman-MGB探針的核酸序列如SEQ ID NO.15-16所示；

優選地，所述檢測PRKAG2-c.298G>A熱點突變位點的實時熒光PCR引物的核酸序列如SEQ ID NO.17-18所示，所述Taqman-MGB探針的核酸序列如SEQ ID NO.19-20所示。

具體的序列如下所示：

優選地，所述Taqman-MGB探針的核酸序列5’端標記有發光的報告熒光基團，3’端標記有不發光的淬滅基團MGB。

優選地，所述發光的報告熒光基團為FAM、HEX或Cy5中的任意一種。

優選地，所述不發光的淬滅基團為MGB小分子化合物。

第二方面，本發明提供一種試劑盒，所述試劑盒包括權利要求1-3中任一項所述的引物組合物中的五組實時熒光PCR引物和Taqman-MGB探針序列中的至少一組。

第三方面，本發明提供一種如第一方面所述的引物組合物或如第二方面所述的試劑盒用于肥厚型心肌病相關致病基因熱點突變的檢測。

第四方面，本發明提供一種肥厚型心肌病相關致病基因熱點突變的檢測方法，包括如下步驟：

(1)提取基因組；

(2)以步驟(1)的基因組為模板，進行PCR擴增，構建野生型、純合突變型及雜合突變型陽性質控品；

(3)將步驟(2)得到的陽性質控品采用如第一方面所述的引物組合物進行實時熒光PCR檢測。

優選地，步驟(1)所述的基因組來自于人的外周血、心肌組織、淋巴器官、脾臟、骨髓或肝臟中的任意一種或至少兩種的組合。

優選地，步驟(2)所述的PCR擴增的引物的核酸序列如SEQ ID NO.21-30所示，所述PCR擴增的引物的核酸序列如下：

優選地，步驟(2)所述的PCR擴增的反應條件為：95℃預變性3分鐘；95℃變性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共40個循環；72℃延伸5分鐘；

優選地，構建陽性質控品的具體步驟如下：將PCR擴增產物進行純化，將純化后的片段克隆到PMD-18T載體上，轉化到大腸桿菌JM109，挑選單克隆，測序驗證野生型及純合突變型陽性質粒，將野生型和純合突變型陽性質粒按摩爾比1:1混合后即得到雜合突變型陽性質控品。

優選地，步驟(3)所述的實時熒光PCR的條件中檢測MYH7-c.1987C>T熱點突變位點的反應體系為：Premix Ex Taq酶5μL，50×的Rox DyII緩沖液0.1μL，上下游引物各0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.3 0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.4 1μL，基因組0.5μL和ddH₂O為2.8μL；

優選地，步驟(3)所述的實時熒光PCR的條件中檢測MYH7-c.1987C>T熱點突變位點的PCR反應條件為循環外95℃預變性30s，循環內95℃變性5s、56℃退火及延伸34s、45個循環，循環外60℃延伸1min；

優選地，步驟(3)所述的實時熒光PCR的條件中檢測TNNI3-c.370G>C熱點突變位點的反應體系為：Premix Ex Taq酶5μL，50×的Rox DyII緩沖液0.1μL， 上下游引物各0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.7 0.1μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.8 1.2μL，基因組0.5μL和ddH₂O為2.7μL；

優選地，步驟(3)所述的實時熒光PCR的條件中檢測TNNI3-c.370G>C熱點突變位點的PCR反應條件為循環外95℃預變性30s，循環內95℃變性5s、56℃退火及延伸34s、45個循環，循環外60℃延伸1min；

優選地，步驟(3)所述的實時熒光PCR的條件中檢測MYH7-c2155C>T熱點突變位點的反應體系為：Premix Ex Taq酶5μL，50×的Rox DyII緩沖液0.1μL，上下游引物各0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.11 0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.12 1.2μL，基因組0.5μL和ddH₂O為2.6μL；

優選地，步驟(3)所述的實時熒光PCR的條件中檢測MYH7-c2155C>T熱點突變位點的PCR反應條件為循環外95℃預變性30s，循環內95℃變性5s、56℃退火及延伸34s、45個循環，循環外60℃延伸1min；

優選地，步驟(3)所述的實時熒光PCR的條件中檢測TNNI3-c.433C>G熱點突變位點的反應體系為：Premix Ex Taq酶5μL，50×的Rox DyII緩沖液0.1μL，上下游引物各0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.15 0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.16 0.8μL，基因組0.5μL和ddH₂O為3μL；

優選地，步驟(3)所述的實時熒光PCR的條件中檢測TNNI3-c.433C>G熱點突變位點的PCR反應條件為循環外95℃預變性30s，循環內95℃變性5s、56℃退火及延伸34s、45個循環，循環外60℃延伸1min；

優選地，步驟(3)所述的實時熒光PCR的條件中檢測PRKAG2-c.298G>A熱點突變位點的反應體系為：Premix Ex Taq酶5μL，50×的Rox DyII緩沖液0.1μL，上下游引物各0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.19 0.1μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.20 0.5μL，基因組0.5μL和ddH₂O為3.8μL；

優選地，步驟(3)所述的實時熒光PCR的條件中檢測PRKAG2-c.298G>A熱點突變位點的PCR反應條件為循環外95℃預變性30s，循環內95℃變性5s、56℃退火及延伸34s、45個循環，循環外60℃延伸1min。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

(1)本發明一次可檢測多個病例樣本，且可對每個樣本同時進行5個突變位點的聯合檢測，具有簡便、快速、準確和經濟等特點，為肥厚型心肌病的臨床早期分子診斷和預防建立了新的方法；

(2)本發明方法可用于產前診斷，指導優生優育，輔助明確診斷，進行臨床干預，家族篩查，進行家族疾病發生風險評估及管理。

(3)本發明的方法方便快捷，成本低，利用96孔PCR反應管一次性檢測多個樣本，每個樣本可聯合檢測5個突變位點。

附圖說明

圖1是本發明陽性質控品TNNI3,c.370G>C菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2是本發明陽性質控品TNNI3,c.370G毛細管電泳檢測；

圖3是本發明陽性質控品TNNI3,c.370C毛細管電泳檢測；

圖4是本發明陽性質控品TNNI3,c.433C>G菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖5是本發明陽性質控品TNNI3,c.433C毛細管電泳檢測；

圖6是本發明陽性質控品TNNI3,c.433G毛細管電泳檢測；

圖7是本發明陽性質控品MYH7,c.2155C>T菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖8是本發明陽性質控品MYH7,c.2155C毛細管電泳檢測；

圖9是本發明陽性質控品MYH7,c.2155T毛細管電泳檢測；

圖10是本發明陽性質控品MYH7,c.1987C>T菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖11是本發明陽性質控品MYH7,c.1987C毛細管電泳檢測；

圖12是本發明陽性質控品MYH7,c.1987T毛細管電泳檢測；

圖13是本發明陽性質控品PRKAG2,c.298G>A菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖14是本發明陽性質控品PRKAG2,c.298G毛細管電泳檢測；

圖15是本發明陽性質控品PRKAG2,c.298A毛細管電泳檢測；

圖16 TaqMan-MGB的靈敏性檢驗，其中，圖16(A)-圖16(B)分別為MYH7，1987CC基因型的擴增曲線和標準曲線，圖16(C)-圖16(D)分別為MYH7，1987TT的擴增曲線和標準曲線；

圖17變異位點MYH7,1987C>T的TaqMan-MGB特異性檢測，其中，FAM代表野生型探針，HEX代表突變型探針，圖17(A)為野生型模板，圖17(B)為純合突變型模板，圖17(C)為雜合突變模板，圖17(D)為不同基因型的散點圖分布；

圖18 TaqMan-MGB的靈敏性檢驗，其中，圖18(A)-圖18(B)分別為TNNI3，370GG基因型的擴增曲線和標準曲線，圖18(C)-圖18(D)分別為TNNI3，370CC的擴增曲線和標準曲線；

圖19變異位點TNNI3,370G>C的TaqMan-MGB特異性檢測，其中，FAM代表野生型探針，HEX代表突變型探針，圖19(A)為野生型模板，圖19(B)為純合突變型模板，圖19(C)為雜合突變模板，圖19(D)為不同基因型的散點圖分布；

圖20 TaqMan-MGB的靈敏性檢驗，其中，圖20(A)-圖20(B)分別為MYH7，2155CC基因型的擴增曲線和標準曲線，圖20(C)-圖20(D)分別為MYH7，2155TT的擴增曲線和標準曲線；

圖21變異位點MYH7,2155C>T的TaqMan-MGB特異性檢測，其中，FAM 代表野生型探針，Cy5代表突變型探針，圖21(A)為野生型模板，圖21(B)為純合突變型模板，圖21(C)為雜合突變模板，圖21(D)為不同基因型的散點圖分布；

圖22 TaqMan-MGB的靈敏性檢驗，其中，圖22(A)-圖22(B)分別為TNNI3，433CC基因型的擴增曲線和標準曲線，圖22(C)-圖22(D)分別為TNNI3，433GG的擴增曲線和標準曲線；

圖23變異位點TNNI3,433C>G的TaqMan-MGB特異性檢測，其中，FAM代表野生型探針，HEX代表突變型探針，圖23(A)為野生型模板，圖23(B)為純合突變型模板，圖23(C)為雜合突變模板，圖23(D)為不同基因型的散點圖分布；

圖24 TaqMan-MGB的靈敏性檢驗，其中，圖24(A)-圖24(B)分別為PRKAG2，298GG基因型的擴增曲線和標準曲線，圖24(C)-圖24(D)分別為PRKAG2，298AA的擴增曲線和標準曲線；

圖25變異位點PRKAG2,298G>A的TaqMan-MGB特異性檢測，其中，FAM代表野生型探針，HEX代表突變型探針，圖25(A)為野生型模板，圖25(B)為純合突變型模板，圖25(C)為雜合突變模板，圖25(D)為不同基因型的散點圖分布。

圖26 10例已知基因型的肥厚型心肌病患者進行實時熒光檢測。圖26(A)-圖26(E)分別代表MYH7,c.1987C>T、TNNI3,c.370G>C、MYH7,c.2155C>T、TNNI3,c.433C>G及PRKAG2,c.298G>A 5個變異位點的基因分型散點圖。

具體實施方式

為更進一步闡述本發明所采取的技術手段及其效果，以下結合附圖并通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案，但本發明并非局限在實施例范 圍內。

實施例1

應用本發明方法對在云南省第一人民醫院心血管內科臨床確診的5例肥厚型心肌病先證者(除收集HCM患者的人口統計學資料外，還收集了其心電圖及超聲心動圖)外周血基因組進行實時熒光PCR的突變篩查，尋找可能的與HCM發病相關的致病性變異位點。

一種肥厚型心肌病相關致病基因熱點突變的檢測方法，包括如下步驟：

(1)提取基因組：對入選臨床確診的肥厚型心肌病5例先證者，抽取其外周靜脈血1ml，EDTA抗凝后，采用商業化的Miniprep Kit(Axygen,美國)提取其全基因組后，進行瓊脂糖凝膠電泳后、對濃度和OD值進行測定，OD_260/280為1.8-2.0之間為可用。；

(2)以步驟(1)的基因組為模板，進行PCR擴增，構建野生型、純合突變及雜合突變陽性質控品；

其中，步驟(2)所述的PCR擴增的引物的核酸序列如SEQ ID NO.21-30所示，具體如下：

，PCR擴增的反應條件如下：

，PCR擴增反應完成后，進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果顯示目的片段大小與預期大小一致，結果如圖1、4、7、10和13分別代表攜帶有TNNI3,c.370G>C；TNNI3,c.433C>G；MYH7,c.2155C>T；MYH7,c.1987C>T和PRKAG2,c.298G>A突變位點的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖；

構建野生型、純合突變及雜合突變陽性質控品的具體步驟如下：將純化后的片段克隆到PMD-18T載體上，轉化到大腸桿菌JM109，挑選單克隆，測序驗證野生型和純合突變型陽性質粒，將野生型和純合突變型陽性質粒按摩爾比1:1混合后即得到雜合突變型陽性質控品；

(3)將步驟(2)得到的陽性質控品采用所述的引物組合物進行實時熒光PCR檢測，所述引物組合物如下：

具體各個熱點突變位點的反應體系如下：

5個熱點突變位點(MYH7-c.1987C>T、TNNI3-c.370G>C、MYH7-c2155C>T、TNNI3-c.433C>G或PRKAG2-c.298G>A)的實時熒光PCR反應條件均為：利用ABI7500實時熒光PCR儀，循環外95℃預變性30s，循環內95℃變性5s、56℃退火及延伸34s、45個循環，循環外60℃延伸1min。

實施例2

應用本發明方法對在云南省第一人民醫院心血管內科臨床確診的5例肥厚型心肌病先證者(除收集HCM患者的人口統計學資料外，還收集了其心電圖及超聲心動圖)外周血基因組進行實時熒光PCR的突變篩查，尋找可能的與HCM 發病相關的致病性變異位點。

一種肥厚型心肌病相關致病基因熱點突變的檢測方法，包括如下步驟：

(1)提取基因組：對入選臨床確診的肥厚型心肌病5例先證者，抽取其外周靜脈血1ml，EDTA抗凝后，采用商業化的Miniprep Kit(Axygen,美國)提取其全基因組后，進行瓊脂糖凝膠電泳后、對濃度和OD值進行測定，OD_260/280為1.8-2.0之間為可用；

(2)以步驟(1)的基因組為模板，進行PCR擴增：其中，步驟(2)所述的PCR擴增的引物的核酸序列如SEQ ID NO.21-30所示，具體如下：

，PCR擴增的反應條件如下：

，PCR擴增反應完成后，進行瓊脂糖凝膠電泳并進行純化；

(3)PCR產物經瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒純化后，用PMD-18T載體 進行T-A克隆后，篩選出陽性克隆菌株，提取其質粒載體。

(4)利用ABI3130毛細管電泳儀對含有克隆目的片段后的質粒載體進行毛細管電泳，其檢測反應體系為：模板DNA 1μL，引物(3.2pmol/uL)1μL，BigDye(2.5x)8μL，ddH₂O 10μL；

(5)克隆載體毛細管電泳PCR反應條件如下

(6)以靶基因MYH7(GenBank:NG_007884.1)、TNNI3(GenBank:NG_007866.2)和PRKAG2(GenBank:NG_007486.1)的基因序列為模板，利用bioedit序列分析軟件對變位點進行分析。

結果如圖2、3、5、6、8、9、11、12、14和15，可以看出，全部成功構建野生型和突變型的陽性質控品，

實施例3

經條件優化，步驟(4)所述的引物-探針的序列的重復性驗證，分別進行3次重復試驗(批間和批內重復)。觀察模板的Ct值，并計算其變異系數，變異系數(p)＝標準偏差(SD)/平均數(X)，測試檢測方法的靈敏性和重復性。

結果如表1-2所示：

表1

表2

從表1-2可見，批間和批內重復變異系數均小于2％，具有較好的批間和批內重復性。

實施例4

經條件優化，步驟(4)所述的引物-探針的序列的特異性驗證。

特異性驗證以5個變異位點的野生型、純合突變型和雜合突變型的陽性質粒為模板，同時加入雙標記探針，按照優化好的條件對其進行TaqMan-MGB的特異性實驗驗證，結果如圖16-25所示。

結果顯示：圖16-25(A)野生型樣本反應的曲線表現為野生型探針產生的熒光信號增高，而純合突變無熒光信號或僅有很低的熒光信號；圖16-25(B) 雜合突變樣本能使野生型和突變型探針都表現出相對較高的熒光信號；圖16-25(C)純合突變表現為只有突變型探針產生熒光信號，圖16-25(D)野生型探針不產生熒光信號或產生較少的熒光信號。更重要的是，通過反應結果的散點圖可以明顯看出不同基因型的樣本單獨成簇。

實施例5

本發明中，對來自于已知(Sanger測序)基因型的10例肥厚型心肌病患者進行該5個熱點突變位點進行突變檢測。圖26(A-E)分別代表MYH7,c.1987C>T、TNNI3,c.370G>C、MYH7,c.2155C>T、TNNI3,c.433C>G及PRKAG2,c.298G>A 5個變異位點的基因分型散點圖。檢測結果與Sanger測序結果一致，準確率為100％，具體基因型檢測結果比例見表3所示。

表3

綜上所述，由實施例5的結果分析可得出，本發明建立了肥厚型心肌病主要致病基因的簡便、快速、準確和經濟的遺傳篩查方法。

申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細方法，但本發明并不局限于上述詳細方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。

SEQUENCE LISTING

<110> 昆明理工大學

<120> 一種引物組合物及其應用

<130> 2017

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 1

cctccagccc catgtctg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 2

taggagaacg ggaacacggt 20

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

aagaccagcc ccggc 15

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 4

aagaccagcc ccagc 15

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

gaccttcgag gcaagtttaa gc 22

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 6

cagcgcctgc atcatgg 17

<210> 7

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 7

accctgcgga gagt 14

<210> 8

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 8

accctgggga gagt 14

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 9

tggccacagg aaaatctgaa c 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 10

tgtggcctca cctggagact 20

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 11

caacttgcgc tcca 14

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 12

ccaacttgtg ctcca 15

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 13

gtgtggacaa ggtggatgaa ga 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 14

ccaagtccca gccatctcac 20

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 15

aagaacatca cggaggt 17

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 16

aagaacatca cgcaggt 17

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 17

cccaaccgca tcctctacg 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 18

gagctctggt gcaccctcat 20

<210> 19

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 19

cttccggcag aggt 14

<210> 20

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 20

acttctggca gaggt 15

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 21

gcagaatcca tgtccacctg t 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 22

tgtcctagga ggtcctgttc c 21

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 23

aggtctccct gtttttggtt cc 22

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 24

ggaccttcat gtacctcttt gctct 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 25

gctaatcagt gacaaagcca ggatc 25

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 26

agggtggaag agccaacagt agc 23

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 27

gcctaagccg ggaagagact ggta 24

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 28

gaggacccct tactagctgc ttct 24

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 29

cagtcctgtg tggtcagaac ttgg 24

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 30

ggaccagaag gattacgctt tgat 24