本發明屬于基因檢測
技術領域：
，具體涉及一種TaqMan-MGB探針法檢測人類ADH1B基因多態性的引物及其應用。
背景技術：
：酒精(乙醇)代謝相關基因是分子進化和群體遺傳學研究的熱點之一。酒精一般通過口腔、食管、胃、腸粘膜等吸收到體內的各種組織器官中，并于5分鐘即可出現于血液中，待到30-60分鐘時，血液中的酒精濃度就可以達到最高點。酒精在人體內代謝緩慢，絕大多的酒精主要在肝臟中代謝，且與ADH1B相關。ADH1B基因編碼乙醇脫氫酶1B，能夠把乙醇迅速降解為乙醛，乙醇脫氫酶是人體內重要的代謝酶，它與乙醛脫氫酶(ALDH2)構成了乙醇脫氫酶系統，參與體內乙醇代謝。其中，ADH1B基因在編碼48位置發生了從精氨酸(ADH1B*1，Arg)到組氨酸(ADH1B*2，His)的非同義替換。具有該突變的ADH1B活性大為增強，使得攝入的酒精迅速轉化成乙醛，容易導致酗酒。同時，攜帶ADH1B*1基因型者，上消化道腫瘤高風險。攜帶ADH1B*2基因型，易產生酒精依賴、酒精中毒；與早發冠心病也有一定關系。因此檢測ADH1B具有重要意義：(1)揭示個體酒精代謝能力的不同：不同的基因型對酒精的耐受不同。(2)健康風險提示：提示受檢者避免對酒精產生依賴，降低上消化道腫瘤的發生風險。Taqman探針法可用于基因熒光定量分析、甲基化檢測、SNP分型、miRNA定量分析等。Taqman探針法SNP分型技術的核心就是特異性的MGB探針技術，已證實的Taqman探針，3’段結合MGB技術，能更好的進行等位基因的區分。MGB分子結合到DNA螺旋小溝，通過穩定MGB探針/模板聯合體提高雜交的檢驗。這種超強的穩定性可使短至13個堿基的探針提高錯配的辨別力，并為困難多變的序列設計提供更高的靈活性。所有的MGB探針都包括一個不發熒光的猝滅基團(NFQ)，它能真正消除傳統猝滅基團產生的背景熒光，提高信噪比，從而提供檢測靈敏性。其具體方法是：針對同一SNP位點的不同基因型設計兩條不同的TaqMan-MGB探針，把它們同時加入到PCR反應體系中，只有與靶序列完全匹配的探針才能被水解并釋放出熒光信號。兩條探針分別標記不同的熒光基團，分別用實時熒光定量PCR儀中對應的熒光檢測通道檢測熒光信號。某種基因型對應的熒光探針能夠釋放熒光信號，說明在原始DNA樣本中含有該種基因型。如果只有一條探針能釋放熒光信號，那么檢測到SNP位點上是純合子，如果兩條探針都有熒光信號，那么在該SNP位點上是雜合子。該方法可以直接在實驗結果中讀出每個樣本中SNP的基因型，不需要再對序列進行分析，具有直觀性。該技術不僅實現了對核酸特異性擴增的實時監測，而且具有靈敏度和特異性高、自動化程度高、無污染、成本低廉等特點。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是提供一種TaqMan-MGB探針法檢測人類ADH1B基因多態性的引物。本發明還要解決的技術問題是提供上述引物在檢測人類ADH1B基因多態性中的應用。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：一種TaqMan-MGB探針法檢測人類ADH1B基因多態性的引物，包括如下核酸序列：(1)擴增ADH1B基因rs1229984多態性位點的引物對，其核苷酸序列SEQIDNO.：1和SEQIDNO.：2所示；(2)用于檢測ADH1B基因rs1229984多態性位點的TaqMan-MGB探針，其核苷酸序列SEQIDNO.：3和SEQIDNO.：4所示，其中SEQIDNO.：3在5末端標記Fam信號，SEQIDNO.：4在5末端標記VIC信號；上述引物對和熒光探針對在一次檢測中共同使用。上述TaqMan-MGB探針法檢測人類ADH1B基因多態性的引物在檢測ADH1B基因多態性中的應用在本發明的保護范圍之內。一種TaqMan-MGB探針法用于檢測人類ADH1B基因多態性的試劑盒，該試劑盒包括權利要求1所述的引物和探針。作為優選，該試劑盒包括2xPCR反應混合液，陽性標準品。所述2xPCR反應混合液的配方如下：10mMTris-HCL、2mMMgCl2、50mMKCL、0.2mMdNTPs、2U/μLTaqDNA聚合酶。所述陽性標準品為GG基因型質粒和AA基因型質粒，其中，GG基因型質粒的插入序列如SEQIDNO.：5所示，AA基因型質粒的插入序列如SEQIDNO.：6所示。一種TaqMan-MGB探針法用于檢測人類ADH1B基因多態性的方法，包括如下步驟：(1)提取人外周血基因組DNA；(2)分別以提取的人外周血基因組DNA和陽性標準品為模板、權利要求1和2中的引物、探針、PCR反應混合液，進行實時熒光定量PCR反應；(3)根據檢測到的熒光信號值對rs1229984位點進行基因型判定。步驟(2)中，實時熒光定量PCR反應的擴增體系為：總體積20μL，2xPCR反應混合液10uL，SEQIDNO.：10.2uM，SEQIDNO.：2，0.2uM，SEQIDNO.：10.2uM，SEQIDNO.：10.2uM，模板DNA50ng。步驟(2)中，實時熒光定量PCR反應中的擴增程序為：95℃，2min；95℃，5s，60℃，45s，收集熒光，40個循環。有益效果：本發明提供了一種TaqMan-MGB探針法檢測人類ADH1B基因多態性的引物和試劑盒，采用TaqMan-MGB探針法實現了對ADH1B基因rs1229984位點進行快速、簡單的檢測。本發明檢測結果準確，易于判讀。與測序法相比，該方法不需要對PCR產物進行一系列復雜的后續處理，PCR擴增和檢測同步進行，整個檢測過程無需開蓋操作，降低了PCR產物造成污染的風險，大大縮短了檢測時間，降低了檢測成本。附圖說明圖1為10例標本的檢測結果圖示。具體實施方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1：步驟1：DNA提取取200μL外周血，按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取(購自杭州新捷生物科技有限公司)，提取DNA用于后續實驗或者存放于-20℃。步驟2：定量PCR擴增和檢測(1)擴增ADH1B基因rs1229984多態性位點的引物對，其核苷酸序列SEQIDNO.：1和SEQIDNO.：2所示；(2)用于檢測ADH1B基因rs1229984多態性位點的TaqMan-MGB探針，其核苷酸序列SEQIDNO.：3和SEQIDNO.：4所示，其中SEQIDNO.：3在5末端標記Fam信號-，SEQIDNO.：4在5末端標記VIC信號。在96孔板中，配制如下反應體系：2xPCR反應混合液10μL，SEQIDNO.：10.2μM，SEQIDNO.：20.2μM，SEQIDNO.：30.2μM，SEQIDNO.：40.2μM，模板DNA50ng，加水補足至總體積20μL，同時設立陽性標準品和陰性對照。所述2xPCR反應混合液的配方如下：10mMTris-HCL，2mMMgCl2，50mMKCL，0.2mMdNTPs，2U/μLTaqDNA聚合酶，在制備試劑盒是也可以將SEQIDNO.：1～4所示的序列加入混合液中。實時熒光定量PCR反應中的擴增程序為：95℃，2min；95℃，5s，60℃，45s，收集熒光，40個循環。陽性標準品為GG基因型質粒和AA基因型質粒，其中，GG基因型質粒的插入序列如SEQIDNO.：5所示，AA基因型質粒的插入序列如SEQIDNO.：6所示。步驟3：結果分析反應結束后，應用儀器自帶軟件進行數據分析。根據擴增結果，對標本基因型進行判定，具體檢測結果圖見圖1。步驟4：結果統計10例標本的基因型結果統計如下：編號結果編號結果1001A/A1006G/G1002A/G1007A/A1003A/A1008A/G1004A/G1009A/G1005A/A1010G/G以上所述，是本發明較佳的實施例，并非本發明任何形式上或實質上的限制，應當指出，對于本
技術領域：
的技術人員，在不脫離本發明的范圍前提下，還可以對之做一些修改和改進，這些改進和補充也應該視為本發明的保護范圍。SEQUENCELISTING<110>黑龍江迪安醫學檢驗所有限公司<120>一種TaqMan-MGB探針法檢測人類ADH1B基因多態性的引物及其應用<130>SG20161222001<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>擴增ADH1B基因rs1229984多態性位點的上游引物<400>1tctgaatctgaacagcttctct22<210>2<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>擴增ADH1B基因rs1229984多態性位點的下游引物<400>2ggtcaccaggttgccacta19<210>3<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>檢測ADH1B基因rs1229984多態性位點的TaqMan-MGB探針<400>3aggaatctgtcacacaga18<210>4<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>檢測ADH1B基因rs1229984多態性位點的TaqMan-MGB探針<400>4aggaatctgtcacgcaga18<210>5<211>93<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>GG基因型標準品質粒的插入序列<400>5tctgaatctgaacagcttctctttattctgtagatggtggctgtaggaatctgtcgcaca60gatgaccacgtggttagtggcaacctggtgacc93<210>6<211>93<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>AA基因型標準品質粒的插入序列<400>6tctgaatctgaacagcttctctttattctgtagatggtggctgtaggaatctgtcacaca60gatgaccacgtggttagtggcaacctggtgacc93當前第1頁1 2 3