一種提高牛類胚胎干細胞形成效率及陽性克隆比例的方法與流程

本發明涉及胚胎干細胞體外培養技術，具體地說，涉及一種提高牛類胚胎干細胞形成效率及陽性克隆比例的方法。

背景技術：

escs是來源于附植前胚胎內細胞團(innercellmass,icm)，保持未分化狀態并能自我增殖的多能性細胞。escs具有分化為機體所有細胞的潛力，可用于早期胚胎發育的研究。自從m.j.evans等1981年建立了第1個小鼠escs，陸續獲得了獼猴、人和大鼠的escs。在牛上，經過研究人員大量努力，仍無法獲得公認的牛escs，只獲得了牛類escs。其中一個重要的原因就是牛icm體外培養效率低，獲得的類escs克隆假陽性率高。

在小鼠誘導干細胞(ipscs)研究領域，人們不斷發現小分子物質及抗氧化劑在提高ipscs的形成效率方面有著重要作用。褪黑素(mt)是一種公認的抗氧化劑，在提高哺乳動物卵母細胞體外成熟、胚胎體外生產效率和成熟過程中發揮越來越重要的作用。目前，關于mt對牛類escs形成效率及陽性克隆比例等方面還缺乏深入細致的研究。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種提高牛類胚胎干細胞形成效率及陽性克隆比例的方法。

為了實現本發明目的，本發明提供褪黑素在提高牛類胚胎干細胞形成效率及陽性克隆比例中的應用。所述牛類胚胎干細胞來自于牛體外受精胚胎干細胞。

本發明提供的提高牛類胚胎干細胞形成效率及陽性克隆比例的方法，其是在牛體外受精胚胎培養液以及干細胞培養液中全程添加10^-11-10^-7m(優選10^-9m)褪黑素，進而提高牛類escs形成效率及陽性克隆比例。

本發明所述牛體外受精胚胎培養液為含10％fbs的cr1a培養液，所述干細胞培養液為2i/lif培養液。其它種類的用于牛類胚胎干細胞體外培養技術的牛體外受精胚胎培養液及干細胞培養液，均落入本發明保護范圍。

在本發明的一個具體實施方式中，提高牛類胚胎干細胞形成效率及陽性克隆比例的方法包括以下步驟：

1)卵母細胞的收集和體外成熟

從牛卵巢采集直徑2-8mm卵泡中卵丘-卵母細胞復合體cocs，選擇含有3層及以上顆粒細胞的cocs，用成熟液洗滌3遍后，按50枚cocs/每孔/500μl成熟培養液放入預平衡2h的四孔板中，于培養箱內在38.5℃、5％co2和飽和濕度的條件下培養。

其中，所述成熟液配方：tcm199+10μg·ml^-1卵泡刺激素+10μg·ml^-1·黃體生成素·+10μg·ml^-1雌二醇+10％fbs。

2)體外受精胚胎的生產

cocs體外培養22～24h后，用含有0.1％透明質酸酶的tcm199消化2～3min去除顆粒細胞，挑選具有第一極體且胞質均勻的卵母細胞進行體外受精；將牛冷凍細管精液于37℃水浴解凍后，用7ml洗精液、500g離心兩次，每次5min，精子沉淀用受精液調整精子密度為5×10⁶個/ml；吸取20μl精液加入含有20枚卵母細胞的80μl受精液小滴中(精子終密度為1×10⁶個/ml)，于38.5℃、5％co2、飽和濕度的培養箱中受精18-20h；將受精后的卵母細胞移入含有褪黑素的牛體外受精胚胎培養液的培養小滴中培養，間隔48h半量換液，受精卵體外培養7d后發育到囊胚階段。

其中，所述洗精液為含有2.5mm咖啡因的bo液；所述受精液配方：bo液+20mg/mlbsa+20μg/ml肝素鈉+100iu/ml青霉素鉀+100μg/ml鏈霉素；所述含有褪黑素的牛體外受精胚胎培養液配方：cr1a培養液+10％fbs+10^-11～10^-7m褪黑素。

3)囊胚的接種

提前0.5h將培養小滴更換為含有褪黑素的干細胞培養液，然后將培養7d的囊胚接種到飼養層上；置于培養箱內，在38.5℃、5％co2和飽和濕度的條件下培養，隔天半量更換培養液，待貼壁后可全量換液。

其中，使用的飼養層為經10μg·ml^-1絲裂霉素c處理2～3h的第2代小鼠胎兒成纖維細胞；所述含有褪黑素的干細胞培養液配方：2i/lif培養液+10^-11～10^-7m褪黑素。

4)胚胎內細胞團icm的分離與傳代培養

囊胚培養7～10d后用機械分離法進行第1次傳代，具體用注射器的針頭(優選1ml注射器的針頭)將icm形成的細胞團塊挑出，并分離成較小的細胞團塊，轉移至新的含有褪黑素的干細胞培養液中；每隔5～7d進行傳代，傳至第10代。

5)進行ap染色，并在顯微鏡下觀察牛類胚胎干細胞陽性克隆數。

本發明通過在牛體外受精胚胎培養液、escs培養液中全程添加10^-9mmt，采用全胚接種結合機械傳代法將牛類escs體外傳至第10代。mt處理組第10代類escs克隆形成效率和ap染色陽性率(7.05個/囊胚，90.20％)顯著高于對照組(3.52個/囊胚，70.59％)，mt處理組牛類escs中oct4、nanog、sox2的陽性率(93.33％，97.06％，91.18％)要顯著高于對照組(70.97％，71.88％，74.19％)；mt處理組牛類escs中oct4、nanog和sox2甲基化位點甲基化水平(8.00％，10.48％，2.08％)要顯著低于對照組(20.00％，19.05％，9.86％)，而mt處理組牛類escs中oct4、nanog、sox2基因mrna水平要顯著性高于對照組(p<0.05)。

本發明具有操作簡單，成本低等優點，能有效提高牛類escs形成效率及陽性克隆比例，對于促進牛escs的研究進展，具有重要的理論和實際意義。

附圖說明

圖1為本發明較佳實施例中牛體外受精囊胚接種體外培養獲得的第10代牛類escs顯微鏡下觀察結果；其中，a～f分別為接種后3天的囊胚，接種后4天擴展中的細胞克隆，接種后7天擴展中的細胞克隆，接種后14天的第1代細胞克隆，接種后39天的第5代細胞克隆，接種后80天的第10代細胞克隆。

圖2為本發明較佳實施例中牛第10代escs的ap染色結果。

圖3為本發明較佳實施例中牛第10代escsoct4、nanog、sox2染色圖。

圖4為本發明較佳實施例中mt對牛第10代類escsoct4、nanog和sox2mrna水平的影響。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。

實施例1提高牛類胚胎干細胞形成效率及陽性克隆比例的方法

1、卵母細胞的收集和體外成熟

從牛卵巢(采自河北大廠)上采集直徑2-8mm卵泡中卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte-complexes，cocs)，選擇含有3層及以上顆粒細胞cocs用成熟液(tcm199+10μg·ml^-1fsh+10μg·ml^-1·lh·+10μg·ml^-1e2+10％fbs)洗滌3遍后，按50枚cocs/每孔/500μl成熟培養液放入預平衡2h的四孔板中，于二氧化碳培養箱38.5℃、5％co2和飽和濕度培養。

2、體外受精胚胎的生產

牛體外受精生產胚胎參照nedambale等(2004)的方法，略有改動。cocs體外培養22～24h后，用0.1％透明質酸酶tcm199消化2～3min去除顆粒細胞，挑選具有第一極體且胞質均勻的卵母細胞進行體外受精。奶牛冷凍細管精液(牛號:11101930，北京市奶牛中心)于37℃水浴解凍后，用7ml洗精液(bo液+2.5mmcaffeine)、500g離心兩次，每次5min，精子沉淀用受精液(bo液+20mg/mlbsa+20μg/ml肝素鈉+100iu/ml青霉素鉀+100μg/ml鏈霉素)調整精子密度為5×10⁶個/ml。吸取20μl精液加入含有20枚卵母細胞的80μl受精液小滴中(精子終密度為1×10⁶個/ml)，38.5℃、5％co2、飽和濕度二氧化碳培養箱中受精18-20h。將受精后的卵母細胞移入100μl牛體外受精胚胎培養液(cr1a+10％fbs+10^-9m褪黑素)培養小滴中培養，間隔48h半量換液，受精卵體外培養7d后統計發育到囊胚階段。

3、囊胚的接種

飼養層為經10μg·ml^-1絲裂霉素c處理2～3h的第2代小鼠胎兒成纖維細胞。提前0.5h將培養小滴更換為含有10^-9mmt的escs培養液(2i/lif)，然后將培養7d的ivf囊胚接種到飼養層上。置于培養箱(38.5℃、5％co2、飽和濕度)中培養，隔天半量更換培養液，待貼壁后可全量換液。

4、icm的分離與傳代培養

接種7～10d后用機械分離法進行第1次傳代，方法是用1ml注射器的針頭將icm形成的細胞團塊挑出，并分離為較小的細胞團塊，轉移至新的飼養層上培養。然后每隔5～7d進行傳代，傳至第10代。

5、ap染色

利用es細胞鑒定試劑盒(millipore,usa﹠canada)進行ap染色。第10代牛類escs采用4％多聚甲醛固定1～2min；棄固定液，1×rinsebuffer沖洗；染色劑(fastredvioletsolution：naphthol：water＝2:1:1)在室溫、黑暗環境下培養icm克隆15min；棄染色劑，1×rinsebuffer沖洗；加入1×pbs后在顯微鏡下觀察陽性克隆數。

6、mt對牛類escs中oct4、sox2、nanog基因甲基化水平和mrna表達水平的影響

(1)甲基化檢測：將mt組、對照組第10代牛類escs，提取dna進行亞硫酸鹽處理，檢測oct4(nm_174580.2)、sox2(nm_001105463.2)、nanog(nm_001025344.1)基因甲基化水平。根據millaretal.(2002)的方法，對提取的dna采用亞硫酸鹽處理。根據oct4、sox2、nanog外顯子區域設計pcr引物(表1)，pcr產物克隆至pmd18-t載體后轉入top10細胞。采用abiprism-77測序儀對每個pcr產物的15個克隆進行測序，進而統計甲基化位點的甲基化情況。

表1oct4、nanog、sox2外顯子區域pcr擴增引物

(2)mrna表達水平檢測：采集mt組、對照組牛類escs進行qrt-pcr，檢測oct4、sox2、nanog基因mrna表達水平。采用purelinktmrnamicro試劑盒(invitrogen)來提取rna，具體方法參照操作手冊。提取出rna后進行逆轉錄。然后進行熒光定量pcr擴增(引物見表2)，用β-actin作內參基因。

pcr反應體系為25μl：17.3μl超純水+2.5μl10×buffer+2.0μl鎂離子(25mmol·l^-1)+0.2μldntps(25mmol·l^-1)+0.5μl上游引物(10μmol·l^-1)+0.5μlsybr(20x)+0.5μl下游引物(10μmol·l^-1)+0.3μltaq酶(5u·μl^-1)+1.2μl模板(除模板外，均為invitrogen公司產品)。

pcr反應條件為：95℃預變性2min；95℃變性10s，60℃退火30s，45個循環。每個樣品重復3次，熒光定量結果采用2^-δδct(schmittgen和livak,2008)法進行分析。

表2oct4、nanog、sox2mrna檢測引物

7、實驗設計

實驗分為兩組，(1)mt組：牛受精卵體外培養液(cr1a+10％fbs)及干細胞培養液(2i/lif)中均添加10^-7m、10^-9m、10^-11mmt；(2)對照組：牛受精卵體外培養液(cr1a+10％fbs)及干細胞培養液(2i/lif)中均不添加mt。比較兩組牛類escs在克隆形成效率、ap和表面標記(oct4、nanog、sox2)陽性率、多能性基因(oct4、nanog、sox2)甲基化及其mrna表達水平的影響。

8、數據統計

采用sas軟件對實驗數據進行分析，百分數比較時經反正旋轉化后采用方差分析，結果以平均數依標準差表示，p<0.05為差異顯著性標準。各處理組至少重復3次以上。

9、實驗結果

(1)mt對牛類escs形成效率的影響

牛體外受精囊胚接種及接種后牛類escs傳代情況見圖1和表3。如表3所示，10^-9mmt處理組第10代類escs克隆形成效率(7.05個/囊胚)顯著高于對照組(3.52個/囊胚)、10^-7mmt處理組(5.07個/囊胚)、10^-11mmt處理組(5.48個/囊胚；p<0.05)。

表3mt對牛類escs形成效率的影響

^a,b,c：不同的上標表示縱列上數值差異顯著(p<0.05)，以下表格同。

(2)mt對牛類escsap染色結果的影響

對牛第10代類escs進行ap染色，陽性克隆呈紫紅色(圖2)。如表4所示，在牛受精卵、escs培養液中添加10^-9mmt，能夠顯著提高第10代類escs中ap染色陽性率(90.20％)顯著高于10^-7mmt處理組(79.73％)、10^-11mmt處理組(78.48％)和對照組(70.59％；p<0.05)。

表4mt對牛第10代類escsap染色結果的影響

(3)mt對牛類escsoct4、nanog、sox2染色結果的影響

牛第10代類escsoct4、nanog、sox2染色圖如圖3和表5所示。如表5所示，10^-9mmt處理組牛類escs中oct4、nanog、sox2的陽性率(93.33％、97.06％、91.18％)要顯著高于對照組(70.97％、71.88％、74.19％)、10^-7mmt處理組(80.65％、87.88％、81.25％)、10^-11mmt處理組(82.76％、88.57％、84.38％；p<0.05)。

表5mt對牛第10代類escsoct4、nanog、sox2染色結果的影響

(4)mt對牛類escs中oct4、nanog和sox2基因甲基化及mrna表達水平的影響

如表6所示，10^-9mmt處理組牛類escs中oct4、nanog和sox2甲基化位點甲基化水平(8.00％、10.48％、2.08％)要顯著低于對照組(20.00％、19.05％、9.86％)、10^-7mmt處理組(12.97％、14.76％、7.22％)、10^-11mmt處理組(13.94％、15.24％、5.56％；p<0.05)。

如圖4所示，10^-9mmt處理組牛類escs中oct4、nanog、sox2基因mrna水平要顯著性高于對照組、10^-7mmt和10^-11mmt處理組(p<0.05)。

表6mt對牛類oct4、nanog和sox2甲基化位點甲基化水平的影響

由以上實驗結果可以得出，與對照組相比，在牛受精卵培養液、干細胞培養液中添加10^-9mmt，能夠顯著性提高牛類escs形成效率及ap和表面標記(oct4、nanog、sox2)染色陽性率，并能夠降低oct4、nanog、sox2基因甲基化水平及提高其mrna表達水平。該研究成果將極大促進牛escs的研究進展。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之做一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。

序列表

<110>中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所

<120>一種提高牛類胚胎干細胞形成效率及陽性克隆比例的方法

<130>khp171113423.3

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<170>patentinversion3.3

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