生殖腺來源的側群干細胞的制作方法

本申請要求2014年6月30日遞交的美國臨時專利申請No.62/019，172的權益，該申請的全部公開內容通過引用并入本文中。

領域

本文公開了用于促進組織再生和疾病治療的組合物，所述組合物包含生殖腺來源干細胞側群細胞的基本同質群體。

背景

干細胞已顯示出重新填充(repopulate)和修復組織、器官和/或器官系統。再生醫學感興趣的是使用成體或出生后的干細胞側群細胞用于基于細胞的療法。

概述

本文公開了用于組織再生中的組合物，所述組合物包含生殖腺來源干細胞側群細胞的基本同質群體。

在某些實施方式中，提供這樣的組合物，其包含經分離的生殖腺來源干細胞側群(GDSC-SP)細胞的基本同質群體和至少一種藥學上可接受的賦形劑。在其它實施方式中，GDSC-SP細胞的基本同質群體中至少約85％的細胞表達細胞表面標志物SSEA4、ABCG2、CD117、CD34、BCRP1、SCA1、CD90、CD49f、VASA、GPR-125中的所有，并且不表達CD45和譜系標志物。在其它實施方式中，所述組合物還包含至少一種生物活性劑，例如生長因子、抗排斥劑、抗炎劑、抗感染劑(例如抗生素和抗病毒劑)、鎮痛劑和/或鎮痛劑組合、平喘劑、抗驚厥劑、抗抑郁劑、抗糖尿病劑、抗腫瘤劑、抗癌劑、抗精神病劑、抗氧化劑、免疫抑制劑、維生素、礦物質、或者用于心血管疾病的藥劑例如抗再狹窄化合物和/或抗凝化合物。在其它實施方式中，所述生物活性劑是免疫抑制劑。

本文還公開了促進有此需要的對象中的組織再生的方法，所述方法包括：向所述對象中的治療位點施用組織再生有效量的GDSC-SP細胞的基本同質群體，從而在所述治療位點誘導組織再生，其中GDSC-SP細胞的基本同質群體中至少約85％的細胞表達細胞表面標志物SSEA4、ABCG2、CD117、CD34、BCRP1、SCA1、CD90、CD49f、VASA、GPR-125中的所有，并且不表達CD45和譜系標志物。在其它實施方式中，所述組合物包含GDSC-SP細胞的基本同質群體和藥學上可接受的賦形劑。在其它實施方式中，GDSC-SP細胞的基本同質群體對于對象而言是自體的或異體的。

在其它實施方式中，組織再生是創傷位點的皮膚再生、心肌再生、軟骨和腱再生、骨再生、神經組織再生、血和血管再生，或者組織再生使創傷位點的疤痕形成減至最少。

在某些實施方式中，組織再生有效量的GDSC-SP細胞的基本同質群體為每天每個治療位置約0.5x10⁶個細胞/10mm治療位點。在其它實施方式中，施用步驟包括至少一種選自局部應用、皮內注射、靜脈內注射和皮下注射的方法。

在其它實施方式中，在臨床級培養基中培養擴增GDSC-SP細胞的基本同質群體，以形成基本同質的GDSC-SP細胞系，所述培養基包含生長促進因子和補充物，包括但不限于FGF、GDNF、EGF、LIF、IGF、PDGF、EPO、GM-CSF、富血小板血漿(PRP)和人血清。

在其它實施方式中，所述方法還包括使GDSC-SP細胞的基本同質群體分化成與需要再生的組織相同組織類型的細胞。

在其它實施方式中，所述組合物還包含至少一種生物活性劑，例如生長因子、抗排斥劑、抗炎劑、抗感染劑(例如抗生素和抗病毒劑)、鎮痛劑和/或鎮痛劑組合、平喘劑、抗驚厥劑、抗抑郁劑、抗糖尿病劑、抗腫瘤劑、抗癌劑、抗精神病劑、抗氧化劑、免疫抑制劑、維生素、礦物質、或者用于心血管疾病的藥劑例如抗再狹窄化合物和/或抗凝化合物。在一些實施方式中，所述生物活性劑包括生長因子。在其它實施方式中，所述生物活性劑包括免疫抑制劑。還在其它實施方式中，通過包括全身施用或在組織再生位點局部施用的途徑施用所述生物活性劑。

附圖簡介

圖1描繪了人類雄性生殖干細胞中的側群體(SP)。幾次傳代后，培養的人類雄性生殖細胞系干細胞含有40％SSEA4和小SP細胞群體(通過ABCG2抗體檢測)。圖1A-未染色的對照；圖1B-同種型對照；圖1C-Alexa-488-抗-ABCG2和PE-抗-SSEA。

圖2描繪了雌性生殖干細胞中的SP。幾次傳代后，培養的鼠雌性生殖干細胞含有50％SP細胞(通過Hoechst染色檢測)(圖2B)，其中使用異搏定對照(圖2A)。

詳細說明

本公開提供了用于組織再生和疾病治療的來自個體的生殖腺來源干細胞側群(GDSC-SP)細胞的基本同質群體。

在本文中使用時，術語“哺乳動物”涵蓋任何哺乳動物，例如需要這種治療或預防的哺乳動物。哺乳動物的實例包括但不限于奶牛、馬、綿羊、豬、貓、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴等，更優選地是人。

出于從人胚胎細胞開發細胞系的道德和倫理考慮，對干細胞的替代性來源的研究正在進行中。已在許多組織類型中發現了成體干細胞的替代性來源，所述組織類型包括臍帶血、間質組織、皮膚、腦、骨髓、脂肪組織、羊膜組織和生殖腺。

來自整個組織的大部分干細胞制品是由干細胞和非干細胞組成的細胞混合物。非干細胞群體通常要豐富得多。分離干細胞的程序變得更加普遍，并提供經純化的干細胞部分。大部分分離程序包括使用抗體、核染料或磁珠。然而，特別感興趣的是干細胞的亞群：干細胞側群細胞。

已在哺乳動物生殖腺中鑒定并表征了生殖干細胞的不同亞群(見共同待決的US 2010/0285577)。本文描述了不同的生殖腺來源干細胞群體：生殖腺來源干細胞側群。

生殖腺來源干細胞側群(GDSC-SP)是在生殖腺組織中發現的細胞群體，其是多能的且適合用于組織再生應用中。

在流式細胞術中，側群(SP)是基于所應用的標志物而不同于主群體的細胞亞群。按照定義，側群中的細胞具有有區別的生物特征(例如，它們可展示干細胞樣的特征)，但這種區別的確切性質取決于鑒定側群時所使用的標志物。側群已在癌癥中被鑒定出，其可以是外排化療藥物的細胞，從而解釋癌癥對化療的耐受性。在睪丸干細胞中，多于40％的SP(被定義為顯示出較高DNA-結合染料Hoechst 33342外排的細胞)是未分化的精原細胞，而其它分化的部分僅占0.2％。涉及Hoechst 33342外排的分子是ATP-結合盒(ABC)家族的成員，例如MDR1(P-糖蛋白)和ABCG2。

可基于感興趣的活細胞對Hoechst 33342 DNA染料的被動吸收和Hoechst 33342外排從而鑒定側群細胞。干細胞和早期祖細胞能夠經由ABC轉運體泵出Hoechst，從而允許觀察到在光譜的藍色和紅色區域均具有Hoechst低熒光的細胞群體。加入碘化丙啶(PI)以排除死細胞，并利用同一個檢測器收集碘化丙啶的亮紅色熒光作為Hoechst紅色熒光。ABC泵可被藥物(例如異搏定或利血平)特異性抑制，且在與Hoechst一起孵育之前用這些藥物之一處理的樣品可顯示出SP表型丟失并可被用作對照以確認SP鑒定。SP表型取決于Hoechst濃度、孵育時間和溫度穩定性。這些條件可因細胞類型而異。

術語“生殖腺來源干細胞”指的是在出生后哺乳動物中發現的生殖腺細胞群體，其是多能的并具有分化成各種細胞類型的潛能。生殖腺SP、生殖腺來源SP和GDSC-SP細胞均指相同的GDSC亞群，它們具有下述表型：對于標志物ABCG2(ATP-結合盒亞家族G成員2；CDw338；BRCP1)、SCA1、CD90、CD49f、SSEA4、VASA和CPR125中的所有為陽性，并且對于CD45和譜系標志物為陰性。GDSC-SP還具有CD117和CD34的低表達。對于鼠細胞，譜系被定義為標志物CD3e、CD11c、CD45R/B220、Ly-76、Ly-6G和Ly-6C；對于人細胞，譜系被定義為標志物CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b和血型糖蛋白A。譜系陰性細胞不表達任何譜系標志物。生殖腺細胞可獲自雄性來源和雌性來源。在一種實施方式中，GDSC-SP細胞是睪丸來源干細胞側群細胞。在另一種實施方式中，GDSC-SP細胞是卵巢來源干細胞側群細胞。

在本文中使用時，術語“基本同質”指的是經分離的GDSC-SP群體，其被純化以使得該群體中至少85％的細胞表達標志物ABCG2(ATP-結合盒亞家族G成員2；CDw338；BRCP1)、SCA1、CD90、CD49f、SSEA4、VASA和CPR125中的所有，并且對于CD45和譜系標志物為陰性。在其它實施方式中，經分離的GDSC-SP的基本同質群體中至少約90％、至少約92％、至少約95％、或至少97％的細胞具有期望的表型。

GDSC-SP細胞特別適用于組織再生。此外，生殖腺SP細胞可分化成成骨細胞、成軟骨細胞、心原性細胞、神經原性細胞和脂肪形成細胞。生殖腺來源干細胞的大批(bulk)分離可分化成多種間葉細胞譜系。生殖腺來源SP細胞可以是具有高度可塑性的生殖腺前體細胞，并且保持靜止直至某種信號刺激它們成為響應細胞凋亡、細胞損傷，或者用于組織穩態的特定譜系。

從小鼠睪丸組織分離并分類培養、保持未分化的生殖腺來源SP細胞處于靜止狀態，在體外保持高水平可塑性并具有在體外分化成不同細胞類型的能力。

在其它實施方式中，可通過用低水平激光刺激使靜止狀態的GDSC-SP細胞由靜止狀態受刺激，從而導致CDSC-SP增殖。示例性的低水平激光有A1GaAs激光。例如，激光可以是脈沖激光，例如US 20100/265493中所述的脈沖可調諧激光(例如克爾透鏡自鎖模(KLM)鈦藍寶石(Ti：S)激光)，US 20100/265493關于脈沖可調諧激光所公開的所有內容均通過引用并入本文中。在另一種實施方式中，激光可以是標定激光。用于標定脈沖激光的各個參數(例如，脈沖率、脈沖能量等)的方法和等式可以與關于在眼部手術中使用所描述的那些類似，并針對在治療本文所述的器官中使用進行調整。例如US 2011/0267446、US 2007/0213697、US 2011/0028956中描述了這種方法，所有這些文獻關于標定激光所公開的所有內容均通過引用并入本文中。低水平激光在例如US 2003/0144712、US 2003/0212442、US 2004/0220513、US 2004/0260367、US 2004/0153130和US 2010/0016783中被進一步描述，所有這些文獻關于低水平激光所公開的所有內容均通過引用并入本文中。可用于本文所述方法中的激光(包括連續波激光)的附加描述可例如在US 2012/0302879、US 2013/0211388、US 2013/0184693和US 2013/0102880中找到，所有這些文獻關于激光(包括連續波激光)所公開的所有內容均通過引用并入本文中。

在另外的實施方式中，可用于本文所公開方法中的激光包括在紅外(IR)光譜或近紅外(NIR)光譜中的波長，例如波長為約600-1100nm，包括約600-700nm、650-750nm、700-800nm、750-850nm、800-900nm、850-950nm、900-1000nm、950-1050nm、1000-1100nm、650-1050nm、700-1000nm或750-950nm的范圍，或者包括約600nm、620nm、625nm、650nm、675nm、700nm、725nm、750nm、775nm、780nm、785nm、790nm、800nm、810nm、820nm、825nm、850nm、875nm、900nm、925nm、950nm、975nm、1000nm、1025nm、1050nm、1075nm或1100nm。

在其它實施方式中，激光包括約1-500mW的功率輸出，包括約1-5mW、1-10mW、1-15mW、1-20mW、1-25mW、1-30mW、1-35mW、1-40mW、1-45mW、1-50mW、1-75mW、1-100mW、5-10mW、10-15mW、15-20mW、20-25mW、25-30mW、30-35mW、35-40mW、40-45mW、45-50mW、5-45mW、10-40mW、15-35mW、20-30mW、50-150mW、100-200mW、150-250mW、200-300mW、250-350mW、300-400mW、350-450mW、400-500mW、50-450mW、100-300mW的范圍，或者包括約3mW、約5mW、約10mW、約15mW、約20mW、約25mW、約30mW、約35mW、約40mW、約45mW、約50mW、約60mW、約70mW、約80mW、約90mW、約100mW、約150mW、約200mW、約250mW、約300mW、約350mW、約400mW、約450mW或約500mW。

在其它實施方式中，激光發射約4mm²或約0.1256cm²的波束面積。在另一實施方式中，激光可發射約0.1-10mm²的波束面積，包括約0.5-9.5mm²、1-9mm²、2-8mm²、3-7mm²、4-6mm²、1—7mm²、2-6mm²、3-5mm²、0.1-1mm²、1—2mm²、2-3mm²、3-4mm²、4-5mm²、5-6mm²、6-7mm²、8-9mm²、9-10mm²的范圍，或者約0.1mm²、0.5mm²、1mm²、1.5mm²、2mm²、2.5mm²、3mm²、3.5mm²、4mm²、4.5mm²、5mm²、5.5mm²、6mm²、6.5mm²、7mm²、7.5mm²、8mm²、8.5mm²、9mm²、10mm²或更多。

在其它實施方式中，應用能量約1-120秒，包括約1-5、1-10、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、35-40、45-50、50-55、55-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110或110-120秒的范圍，或者約1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，100、105、110、115或120秒。

在其它實施方式中，激光的功率密度(輻照度)為約1mW-5W/cm²，包括約1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-75、1-100、1-150、1-200、1-250、1-300、1-350、1-400、1-450、1-500、1-600、1-700、1-800、1-900、1-1000、1-2000、1-3000、1-4000、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000或4000-5000mW/cm²的范圍，或者約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000或5000mW/cm²。

在一些實施方式中，通過以下方法從生殖腺組織分離GDSC-SP細胞，所述方法包括：從哺乳動物獲得生殖腺組織，形成生殖腺細胞的細胞懸浮物，用Hoechst 33342染料對生殖腺細胞進行染色和從經Hoechst染色的生殖腺細胞中分離細胞側群。在其它實施方式中，可以通過與細胞表面標志物(包括但不限于SSEA4和ABCG2)綴合的磁珠分離GDSC-SP。

在其它實施方式中，GDSC-SP細胞的尺寸小于4μm。在其它實施方式中，GDSC-SP細胞的尺寸小于3μm或者小于2μm。在另外的實施方式中，GDSC-SP細胞的尺寸為約0.5-4μm、約0.5-3μm、約0.5-2μm、約1-3μm或約1-2μm。在某些實施方式中，基于Hoechst外排和尺寸二者分離GDSC-SP細胞。

此外，GDSC-SP細胞在被引入異體對象時可展示出免疫赦免。GDSC-SP不激活T細胞并且不會刺激T細胞增殖，從而不觸發免疫系統。因此，可以建立GDSC-SP的庫、細胞系或者其它可再生來源，以允許其作為用于治療疾病的“現成”組合物使用。在另一實施方式中，GDSC-SP可發揮免疫抑制作用和免疫調節作用。細胞或器官移植期間共輸注GDSC-SP細胞可通過抑制宿主對移植細胞的免疫應答從而降低免疫排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD)的可能性。

在其它實施方式中，GDSC-SP發揮血管生成作用和抗炎作用，以使得GDSC-SP細胞的注射導致在注射位點降低的炎癥、新的血管形成和改善的血液供給。

本公開還提供用于組織再生的GDSC-SP細胞。在一種實施方式中，GDSC-SP細胞對于接受對象而言是自體的。在其它方式中，GDSC-SP細胞對于接受對象而言是異體的。

因此，在某些實施方式中，提供使用異體的GDSC-SP細胞的基本同質群體(例如通過組織再生)治療疾病的方法。

在一種實施方式中，GDSC-SP細胞的基本同質群體被用于皮膚組織再生和/或創傷愈合。在一種非限制性實例中，在期望的治療位置或位點附近或者之內注射每天每個治療位置約0.5x10⁶到約5.0x10⁶個GDSC-SP個細胞/10mm治療位點。GDSC-SP細胞通過增加血管化、增加到損傷位點的細胞遷移、減少疤痕形成量和增加組織再生，從而幫助組織再生。GDSC-SP細胞還減少創傷愈合時間，從而減低了感染的可能性。此外，本文所公開的某些實施方式幫助具有慢性病(例如糖尿病)的患者的傷口愈合。

GDSC-SP細胞的基本同質群體提供組織再生以治療急性創傷和慢性創傷。急性創傷是在30天(或者在糖尿病患者中為60天)內迅速愈合的那些創傷。可以用本發明治療的急性創傷的非限制性實例包括擦傷、撕脫傷、挫傷、擠壓傷、割傷、撕裂傷、飛彈傷和刺傷。慢性創傷包括但不限于糖尿病皮膚潰瘍、褥瘡、外科創傷、脊髓損傷、燒傷、化學品所致創傷和歸因于血管疾病的創傷。

本發明的GDSC-SP細胞的基本同質群體和組合物的優點為：它們通過相似組織再生而非疤痕形成促進組織愈合。

在一種實施方式中提供這樣的方法，其中使GDSC-SP細胞的基本同質群體分化，然后用于組織再生。在一種非限制性實例中，為了使心肌梗塞后的心臟組織組織再生，可以使GDSC-SP分化成心原性前體細胞或心肌細胞，然后將細胞移植到治療位點。在另一種實施方式中，可以使GDSC-SP細胞分化成神經元并用于神經退行性疾病(包括帕金森病和阿爾茨海默病)、感覺神經元和聽覺神經元的修復。

在另一種實施方式中，GDSC-SP細胞的基本同質群體可用于軟骨細胞分化、骨細胞分化、軟骨修復、骨修復和骨關節炎。

本公開還包括組合物，所述組合物包含在合適載體中的GDSC-SP細胞的基本同質群體。在一種實施方式中，組合物還包含生物活性劑。在其它實施方式中，含GDSC-SP細胞的基本同質群體的組合物與一種或多種生物活性劑一起共同施用。“共同施用”表示：在施用上述治療組合物之前、同時(例如聯合同一制劑或者單獨制劑中的生物活性劑)或者之后施用。

在本文中使用時，措辭“生物活性劑”指的是有生物活性或生物相關性的任何有機劑、無機劑或活劑(living agent)。例如，生物活性劑可以是蛋白質、多肽、多糖(例如肝素)、寡糖、單糖或二糖、有機化合物、有機金屬化合物、或者無機化合物。它可以包括活的或衰老的細胞、細菌、病毒或其部分。它可以包括生物活性分子例如激素、生長因子、產生生長因子的病毒、生長因子抑制劑、生長因子受體、抗炎劑、抗代謝物、整合素阻斷劑、或者完整或部分功能性的有義(insense)基因或反義基因。它還可以包括攜帶生物相關或生物活性材料的人造顆粒或材料。一個實例是包含核的納米顆粒，其中核上有藥物和包衣。

生物活性劑還可以包括藥物，例如可對生物體有治療效果的化學或生物化合物。非限制性實例包括但不限于，生長因子、抗排斥劑、抗炎劑、抗感染劑(例如抗生素和抗病毒劑)、鎮痛劑和鎮痛劑組合、平喘劑、抗驚厥劑、抗抑郁劑、抗糖尿病劑、抗腫瘤劑、抗癌劑、抗精神病劑、抗氧化劑、免疫抑制劑、維生素和礦物質、以及用于心血管疾病的藥劑例如抗再狹窄化合物和/或抗凝化合物。

生物活性劑還可以包括在于體內代謝、分解(例如切割分子組分)或者以其它方式加工和修飾之后展示出相關生物活性的前體材料。這些可包括這樣的前體材料，它們在所述修飾之前，可被視為是相對生物學惰性的，或者對于與有待治療的醫療狀況有關的特定結果而言是無效的。

可以制造任何前述實例的組合、共混物或其它制品，且它們仍然被視為在本文旨在含義內的生物活性劑。涉及生物活性劑的本公開的方面可包括前述實例中的任何或所有。

在一種實施方式中，生物活性劑是生長因子。生長因子是促進移植的GDSC-SP細胞的增殖、分化和功能性的任何劑。合適生長因子的非限制性實例包括白血病抑制因子(LIF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞源生長因子(FGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF)、和血管內皮生長因子(VEGF)、人生長激素、血小板源生長因子(PDGF)、白介素、細胞因子及其組合。

在一種實施方式中，生物活性劑是免疫抑制劑。免疫抑制劑是防止、延遲期望的免疫應答(例如排斥移植的細胞、組織或器官)的發生或者降低所述期望免疫應答的強度的任何劑。某些免疫抑制劑抑制下述細胞介導的免疫應答，所述細胞介導的免疫應答針對被免疫系統鑒定為異物的細胞。免疫抑制劑的實例包括但不限于環孢菌素、環磷酰胺、強的松、地塞米松、氨甲喋呤、硫唑嘌呤、霉酚酸酯、薩力多胺、FK-506、全身性類固醇，以及大范圍抗體、受體激動劑、受體拮抗劑、以及本領域技術人員已知的其它此類劑。

在本文中使用時，“免疫抑制”指的是(例如通過施用本文所限定的“免疫抑制劑”)防止免疫應答以使得檢測不到本文所限定的“免疫應答”。在本文中使用時，“防止”免疫應答表示檢測不到免疫應答。根據本文所限定和本領域公知的方法來檢測免疫應答(例如移植排斥或抗體產生)。

“免疫抑制”還表示：與尚未接受免疫抑制劑的移植接受者或者已經用本文所限定的非“免疫盲化(immunologically blinded)”或“免疫豁免”的材料移植的移植接受者中的任何一個相比，免疫應答發生延遲。免疫應答發生延遲可以是短延遲，例如1小時-10天，即1小時、2天、5天或10天。免疫應答發生延遲也可以是長延遲，例如10天-10年(例如，30天、60天、90天、180天、1年、2年、5年或10年)。

“免疫抑制”還表示免疫應答強度降低。免疫應答強度可降低至：其比尚未接受免疫抑制劑的移植接受者或者已經用非自體材料移植的移植接受者中的任何一個的免疫應答強度低5-100％、優選地25-100％、最優選地75-100％。可以通過測定移植材料被排斥時的時間點來測量免疫應答強度。例如，包括在移植后的第1天移植材料被排斥的免疫應答的強度，比包括在移植后的第30天移植材料被排斥的免疫應答的強度更大。還可以通過測定能夠與移植材料結合的特定抗體的量來測量免疫應答強度，其中抗體產生水平與免疫應答強度直接相關。替代性地，可以通過測定檢測到能夠與移植材料結合的特定抗體的時間點來測量免疫應答強度。

各種策略和劑可用于免疫抑制。例如，一般可利用劑例如FK-506、或環孢菌素或其它免疫抑制劑來抑制淋巴細胞的增殖和活性。另一種可能的策略是施用抗體(例如抗-GAD65單克隆抗體)或者另外的化合物，其遮蔽移植細胞上的表面抗原，從而使得該細胞對宿主的免疫系統實際不可見。

在另一種實施方式中，GDSC-SP細胞的基本同質群體與高壓氧療法一起施用以治療慢性創傷。

在一種實施方式中，GDSC-SP細胞的基本同質群體與皮膚移植物一起施用以幫助移植過程和組織再生。

GDSC-SP細胞的基本同質群體或者由其分化的細胞可被移植入接受者中，在此細胞將增殖和分化以形成新的細胞和組織，從而提供通常由該組織提供的生理過程。在本文中使用時，術語“移植的”指的是單獨的轉移細胞或者嵌入支持基質中的細胞。在本文中使用時，術語“組織”指的是執行特定功能時聯合的類似特化細胞的聚集體。組織旨在涵蓋所有類型的生物組織，包括硬組織和軟組織二者。軟組織指的是連接、支持或圍繞身體的其它結構和器官的組織。軟組織包括肌肉、腱(使肌肉與骨相連的纖維帶)、纖維組織、脂肪、血管、神經和滑膜組織(關節周圍的組織)。硬組織包括結締組織(例如，堅硬形式例如骨組織或骨)以及其它肌肉組織或骨骼組織。

在另一種實施方式中，GDSC-SP細胞的基本同質群體與藥學上可接受的載體或賦形劑一起施用。本文所述的藥學上可接受的賦形劑(例如，運載體、佐劑、載體或稀釋劑)為本領域技術人員所公知且公眾易于獲得。優選地，藥學上可接受的載體或賦形劑是在使用條件下無有害副作用或毒性的一類和對于治療組合物而言為化學惰性的一類。

賦形劑或載體的選擇部分取決于特定的治療組合物、以及用于施用所述組合物的特定方法。因此，存在多種合適的治療組合物制劑。本文所述制劑僅僅是示例性的而絕非限制性的。

藥學上可接受的載體往往是水性pH緩沖溶液。藥學上可接受的載體的實例包括但不限于鹽水，溶劑，分散介質，細胞培養介質，水性緩沖液(例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸)；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽平衡離子，例如鈉；和/或非離子型表面活性劑，例如TWEEN^TM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS^TM。

本公開還提供可用于實施治療方法的組合物。主題組合物包含混合的藥學上可接受的賦形劑(載體)或介質和GDSC-SP細胞的基本同質群體(包括來源于此的組織)，所述GDSC-SP細胞的基本同質群體是單獨的或者與一種或多種生物活性劑組合，并且其強度對于通過各種方法施用至經歷細胞或組織缺損或缺陷的患者是有效的。

另一實施方式提供用于方法中的組合物，所述組合物包含或者基于GDSC-SP細胞的基本同質群體，包括細胞的譜系未定(lineage-uncommitted)群體、細胞的譜系確定(lineage-committed)群體或來源于此的組織，以及藥學上可接受的載體或介質。還包括這樣的組合物，其包含作用于或者調節GDSC-SP細胞和/或來源于此的組織的生物活性劑，以及藥學上可接受的載體或介質。

基于細胞或者組織的組合物的制備在本領域是公知的。可在藥學上可接受的介質中配制這種組合物。細胞可以處于溶液中或者嵌在基質中。具有生物活性劑(例如，生長因子)作為活性成分的組合物的制備在本領域是公知的。活性治療成分經常與藥學上可接受并且與活性成分相容的賦形劑或介質混合。此外，如果期望，組合物可含有少量增強活性成分效力的輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑。

生物活性劑可以作為經中和的藥學上可接受鹽的形式被配制到組合物中。藥學上可接受鹽包括(與多肽或抗體分子的游離氨基形成的)酸加成鹽，其與無機酸(例如，鹽酸或磷酸)或有機酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。由游離羧基形成的鹽也可來源于無機堿(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)或有機堿(例如，異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等)。

通過與劑型相容的方式，以治療有效量施用組合物。施用量取決于例如待治療的對象和虛弱(debilitation)、對象器官的容納能力、接納組合物的細胞和免疫系統、以及細胞或組織療法的性質等。需要施用的組合物的精確量取決于執業者的判斷并且對于每個個體都是獨特的。但組合物的合適劑量可在每天每個治療位置約0.05-100.0x10⁶個基本同質GDSC-SP細胞/10mm治療位點的范圍內，優選地在每天每個治療位置約0.10-50.0x10⁶個基本同質GDSC-SP細胞/10mm治療位點的范圍內，更優選地在每天每個治療位置約0.5-5.0x10⁶個基本同質GDSC-SP細胞/10mm治療位點的范圍內，并取決于施用途徑和治療位置的尺寸。最初施用和隨后施用的合適方案也是可變的，但可包括最初施用接著通過隨后注射或其它施用間隔1小時或更多小時或1天施用重復劑量。

對于特定目的，本領域技術人員可容易地確定合適的細胞濃度。示例性的劑量在每天每個治療位置約0.05-100.0x10⁶個細胞的范圍內。在非限制性實例中，在治療位點附近或者之內皮內注射每天每個治療位置約0.5x10⁶個基本同質GDSC-SP細胞/10mm治療位點。

在其它實施方式中，當需要組織再生時，在創傷或損傷出現后的任何時間點，向哺乳動物的治療位點施用GDSC-SP細胞的基本同質群體。治療組合物的精確施用日程取決于執業者的判斷，且每個個體的創傷或損傷的類型和程度都是獨特的。

本文所公開的GDSC-SP的基本同質群體、由其分化的細胞可通過注射到對象的靶位點而被施用，優選地通過遞送裝置(例如管，例如導管)進行。在一種實施方式中，管另外包含針，例如注射器，通過其可將細胞引入對象的期望位置。向對象施用細胞的具體、非限制性實例還可包括通過皮下注射、肌內注射或靜脈內注射施用。如果施用是靜脈內施用，則可以制備細胞的可注射懸浮液并通過持續滴注施用或推注(bolus)施用。

細胞還可以以不同形式被插入遞送裝置(例如，注射器)中。例如，細胞可以懸浮在這種遞送裝置中所含的溶液中。在本文中使用時，術語“溶液”包括細胞在其中能保持存活的藥學上可接受的載體或稀釋劑。這些載體和稀釋劑的使用是本領域公知的。溶液優選地是無菌的并且具有一定程度的流動性以至于其以可容易注射形式存在。優選地，溶液在制備和貯藏條件下是穩定的，并通過使用例如苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等而保持抗微生物(例如，細菌和真菌)的污染作用。可如下制備溶液：將本文所述的GDSC-SP細胞的基本同質群體或分化的細胞摻入藥學上可接受的載體或稀釋劑和(根據需要)上述列舉的其它成分中，然后進行過濾除菌。

細胞可以全身施用(例如，靜脈內施用)或局部施用(例如，在手術期間在可視化條件下直接施用，或者在超聲波心動圖指導下直接施用到心肌缺損)。對于這類注射，細胞可以處于可注射的懸浮液制品中或者處于生物相容性介質中，所述生物相容性介質呈液體形式時是可注射的并且在受損組織位點變成半固體。可以使用常規心臟內注射器或可控制的內窺鏡遞送裝置，只要針腔或孔具有足夠的直徑(例如，30號(gauge)或更大)以至于剪切力不會損傷被遞送的細胞即可。

可以通過允許細胞被移植到預期組織位點并重建或再生功能缺陷區域的任何方式施用細胞。

基本同質的GDSC-SP細胞可摻入或嵌入其中的支持基質包括這樣的基質，其具有生物相容性、接受者相容性并降解成對接受者無害的產物。這些基質在活體內為GDSC-SP細胞和分化的細胞提供支持和保護。

天然的和/或合成的可生物降解基質是這種基質的實例。天然的可生物降解基質包括血漿凝塊(例如源自哺乳動物)、膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白基質。用于細胞移植基質的合適合成材料必須具有生物相容性以排除遷移和免疫學并發癥，并且能夠支持廣泛的細胞生長和分化的細胞功能。其還必須是可恢復原狀的，從而允許完全天然的組織替代。基質可被配置成各種形狀并且可具有足夠強度以防止移植后坍塌。最近的研究表明：由聚乙醇酸制成的可生物降解聚酯聚合物滿足所有這些標準，如Vacanti，等J.Ped.Surg.23∶3-9(1988)；Cima，等Biotechnol.Bioeng.38∶145(1991)；Vacanti，等Plast.Reconstr.Surg.88∶753-9(1991)所述。其它合成的可生物降解支持基質包括合成聚合物，例如聚酸酐、聚正酯和聚乳酸。合成聚合物的其它實例以及將細胞摻入或嵌入這些基質中的方法在本領域中也是已知的。參見例如美國專利Nos.4,298,002和5,308,701。

可通過用以下化合物包被聚合物來增強細胞與聚合物的附著，所述化合物例如基底膜組分、瓊脂、瓊脂糖、明膠、阿拉伯樹膠、I型膠原、II型膠原、III型膠原、IV型膠原、V型膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、葡糖氨基葡聚糖、其混合物，和細胞培養領域的技術人員已知的其它材料。用于基質中的所有聚合物必須滿足為細胞以及隨后的生長和增殖提供充分支持所必需的機械參數和生化參數。

可生物降解聚合物基質的一個優點是：血管生成化合物和其它生物活性化合物可直接摻入支持基質中，以使得它們在體內隨著支持基質降解而緩慢釋放。由于細胞-聚合物結構是血管化的且該結構降解，所以胎盤干細胞可根據其固有特性分化。以下物質可摻入基質中或者與基質結合提供：因子，包括營養物、生長因子、分化誘導物或去分化誘導物(即，導致已分化細胞喪失分化特性并獲得例如增殖和更普遍功能的特性)、分泌產物、免疫調節劑、炎癥抑制劑、退化因子、增強或允許淋巴網絡或神經纖維向內生長的生物活性劑、透明質酸、和購自供應商例如Collaborative Research，Sigma Chemical Co.的藥物(其是本領域技術人員已知的并且是市售的，同時帶有關于多少量構成有效量的說明書)、血管生長因子例如血管表皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)以及結合肝素的表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。類似地，可以合成含有肽例如附著肽RGD(Arg-Gly-Asp)的聚合物以用于形成基質(參見，例如美國專利Nos.4,988,621、4,792,525、5,965,997、4,879,237和4,789,734)。

在另一實例中，可將細胞移植到凝膠基質(例如來自Upjohn Company的Gelfoam)中，所述凝膠基質聚合形成干細胞或已分化細胞可在其中生長的底物。已經開發了多種包封技術(Lacy等，Science 254∶1782-84(1991)；Sullivan等，Science 252∶718-712(1991)；WO 91/10470；WO 91/10425；美國專利No.5,837,234；美國專利No.5,011,472；美國專利No.4,892,538)。在涉及直接物理觸及受損組織和/或器官的開放式手術程序中，未分化干細胞或已分化干細胞遞送制品的全部所述形式都是可行的選擇。可間斷地重復移植這些細胞，直至獲得期望的治療效果。

在示例性實施方式中，包含有效量的GDSC-SP細胞的基本同質群體的治療組合物可用于治療患血管疾病的對象。在本文中使用時，“血管疾病”指的是人血管系統的疾病。實例包括外周動脈疾病、腹主動脈瘤、頸動脈疾病和靜脈疾病。GDSC-SP細胞可用來產生血管內皮細胞，所述血管內皮細胞可用于重構組織或替代對象中的疤痕組織的方法中。血管內皮細胞也可以被用于修復血管損傷。

實施例

實施例1

分離鼠雄性生殖腺干細胞

將新生小鼠幼畜(出生后2-5天)或成體小鼠的睪丸從身體中無菌移除。除去睪丸包膜并將生精小管懸浮在酶溶液中，所述酶溶液由磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的1mg/mL膠原酶1A和10單位/mL DNA酶組成。在水浴中在37℃下消化睪丸直至所有小管被消化。利用胎牛血清(FBS)使反應終止。移除上層的酶-FBS溶液，然后將細胞重懸在培養基中并保持在冰上直至使用。

實施例2

分離鼠雌性生殖腺干細胞

在微解剖顯微鏡下解剖40-60只2-5日齡幼畜的小鼠卵巢，并用于細胞分離。首先將卵巢收集在含有冷D-PBS(補充有4mM EDTA)的培養皿中。然后使用5ml移液器將卵巢轉移到50ml錐形管中。離心和洗滌之后，移除D-PBS洗滌溶液，然后將卵巢重懸在膠原酶(1mg/ml)和DNA酶-I(20單位/ml)中，并放置在37℃水浴中。每隔10分鐘，通過移液器物理破壞正在消化的卵巢組織，并在孵育結束時(30分鐘)加入5ml FBS以中和酶。使產生的細胞懸浮物穿過40μm過濾器以除去組織碎片，并通過以400xG離心10分鐘來收集經分離的細胞。移除上層的酶-FBS溶液，然后將細胞重懸在培養基中并保持在冰上直至使用。

實施例3

分離靈長目雄性生殖腺干細胞

該研究使用人睪丸，所述人睪丸以來自患非梗阻性無精子癥的患者的睪丸活檢物形式或者在睪丸切除術之后收集的剩余睪丸組織的形式收集。所有組織均是捐贈的并得到患者的知情同意。在收集的24小時內將組織轉移到4℃的PBS-抗生素中。處理人睪丸組織的程序與下文關于靈長類動物所公開的程序相似。

手術移除3-7歲齡的被實施安樂死的獼猴的睪丸；然后將其放置在補充有青霉素/鏈霉素(分別來自Cellgro和Invitrogen)的PBS中并在冰上運輸過夜。手術移除睪丸包膜之后，移除活檢樣品用于組織學和分子分析。將剩余的生精小管組織切得極碎并用膠原酶A(1mg/ml)(Roche)和DNA酶(10U/mL)(Invitrogen)在往復式37℃水浴中消化15分鐘。膠原酶消化后，未消化的組織在單位重力下沉淀，然后移除上清液中的細胞。使未消化的組織在往復式37℃水浴中的酶混合物中進一步消化20分鐘，所述酶混合物由DMEM中的1.5mg/mL膠原酶A、1.5mg/mL V型透明質酸酶(Sigma)、0.5mg/mL胰蛋白酶(Worthington Biochemical Corporation)和10單位/mL DNA酶組成。使已消化的組織和未消化的組織穿過70μm過濾器進入FBS中以使酶失活。以400Xg離心10分鐘之后，將細胞小球重懸在DMEM+10％FBS中并放置在5％CO₂/95％空氣的濕潤恒溫箱中的經包覆的15cm組織培養皿中。

實施例4

鑒定生殖腺來源干細胞側群細胞

對于GDSC-SP分析，將在實施例1—3中分離的生殖腺細胞以1x10⁶個細胞/mL的濃度懸浮在含10％FBS的DMEM中。將細胞與終濃度為2.5μg/mL的Hoechst 33342(Sigma)一起孵育。在37℃水浴中每隔20分鐘輕輕攪動細胞持續共90分鐘。孵育之后，通過離心使細胞形成小球，然后保持在冰上直至流式分選。為了證明Hoechst外排抑制，除了Hoechst染色之外，還將細胞與終濃度為2.5μg/mL的異搏定(Sigma)一起孵育持續同樣的孵育期。

分選在Cytopeia InFlux細胞分選儀(Seattle，WA)上進行。用355nm20mW UV激光(Lightwave Electronics，Mountain View，CA)激發經Hoechst染色的細胞，將Hoechst藍光發射和紅光發射用560nm二向色鏡分開，并分別使用460/50帶通濾波器和670/40帶通濾波器收集。用488nm200mW激光(Coherent，Santa Clara，CA)激發異硫氰基熒光素(FITC)和藻紅蛋白(PE)，并分別使用530/40帶通濾波器和580/30帶通濾波器收集發射光。用638nm25mW激光(Coherent)激發別藻藍蛋白(APC)，并使用670/40帶通濾波器收集發射光。

對于抗體染色，將細胞離心，然后濃縮到500mL Hoechst染色緩沖液中并保持在冰上。利用抗小鼠Sca-1-PE、CD90-APC、CD117-APC、CD34-FITC和用于譜系測定的抗體(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)對細胞進行染色。譜系試劑盒含有抗小鼠CD3e、CD11c、CD45R/B220、Ly-76、Ly-6G和Ly-6C，它們均綴合到APC上。其它標志物包括SSEA4、CD49f和ABCG2/BCRP1。對細胞染色30分鐘，然后在冷Hoechst染色緩沖液中洗滌一次并保持在冰上直至流式分析。

在生殖腺組織中觀察到了Hoechst 33342外排的保守現象。為了鑒定側群細胞，使所有散點事件均包含在散點圖的第一門中。在散點圖上，為通過Hoechst染色鑒定的生殖腺來源干細胞SP細胞反向設門(backgate)。經消化的生殖腺組織在散點圖上顯示出三個主要的細胞群。生殖腺來源干細胞SP細胞存在于與低側向散射(SSC)以及低至中正向散射(FSC)有關的區域中。生殖腺來源干細胞SP細胞具有低SSC，這表示他們比主要的細胞群要小。

許多組織中的SP表型是由ABC轉運體超家族的膜結合蛋白轉運體引起的。為了判斷ABC轉運體活性是否導致GDSC-SP細胞中的SP表型，將異搏定加入細胞懸浮物中至終濃度為25μg/mL。加入異搏定減少了Hoechst染料外排，從而暗示SP表型歸因于ABC轉運體。

針對許多類型側群細胞所共有的表面標志物，對生殖腺來源干細胞SP細胞染色。所有標志物均為利用流式細胞術研究的直接綴合抗體。負對照是未染色的生殖腺細胞。陽性染色被定義為熒光強度高于95％負對照。落在30％-80％范圍內的不強烈的染色被視為低水平至中等水平的染色。

被嚴格調節控制的成體干細胞在其生命周期中主要是靜止的。用碘化丙啶對新分選的生殖腺側群細胞進行染色以評估其細胞周期狀態。數據表明：側群細胞和主群細胞均主要是靜止的，其中少于0.5％的細胞處于生長期。對于用Hoechst 33342以更大強度染色的其它細胞也是如此。

生殖腺來源干細胞SP細胞是外排Hoechst 33342染料并且富含干細胞的細胞。然而，并非所有GDSC-SP細胞都表達干細胞標志物。GDSC-SP細胞群含有尚未成為任何譜系的細胞。

實施例5

使GDSC-SP細胞分化

分選后，將GDSC-SP細胞用補充有10％FBS的DMEM洗滌一次，然后在小鼠胚胎成纖維細胞STO細胞的飼養層上培養。將STO飼養細胞涂布在包覆有0.1％(wt/v01)明膠的皿上，然后用濃度為10μg/ml的絲裂霉素C(Sigma)在37℃下處理2.5小時，接著用PBS洗滌3次。將分選的GDSC-SP細胞涂布在經絲裂霉素C處理的STO飼養細胞上，并每天更換細胞培養基。

在另一實施方式中，在不含飼養物/不含異種補充物的臨床級培養條件下，使用用于粘合培養的合適基質或者在懸浮的生物反應器中培養GDSC-SP細胞。

為了檢驗GDSC-SP細胞的功能性性能，使它們分化成不同細胞類型。對于骨生成、脂肪形成和神經形成，涂布50000個傳代4次的培養的GDSC-SP細胞。對于軟骨形成，涂布80000個傳代4次的培養的GDSC-SP細胞。

脂肪形成

根據制造商的說明書使50000個細胞在脂肪形成誘導和維持培養基(Cambrex，Walkersville，MD)中生長。簡而言之，將細胞涂布到6cm皿中含10％FBS的DMEM中并允許附著。將細胞轉移到脂肪形成誘導培養基中持續3天，然后更換為脂肪形成維持培養基并持續3天。在脂肪形成培養基中培養GDSC-SP細胞3整天直至脂肪泡生成。脂肪泡顯現的最早時間為7-10天。一定百分比的GDSC-SP細胞生成脂肪泡。隨著細胞變大，最顯著的形態變化是脂肪泡的外觀。

然后對在脂肪形成培養基中培養的細胞進行染色以觀察脂肪形成變化。將細胞在PBS中洗滌2次，然后在4℃下在4％多聚甲醛中過夜固定。將板在70％乙醇中洗滌3次，然后在室溫下與油紅O染色染料一起孵育5分鐘。將板在70％乙醇中洗滌3次，并用dH₂O洗滌2次以除去過量染料。加入蘇木精5分鐘以使細胞核可視化。將板用dH₂O洗滌2次。用油紅O染色使具有油滴的細胞顯示為深紅色。對照皿沒有油紅染色。

軟骨形成

根據制造商的說明書使80000個細胞在軟骨形成誘導培養基(Cambrex)中生長。簡而言之，在100μL含10％FBS的DMEM中使細胞顆粒化成為微團，并允許其緊緊附著到涂布在6cm皿中心的微團中。利用軟骨形成誘導培養基培養細胞，所述培養基每兩天更換一次。在軟骨形成培養基中時，早在5天時便開始形態變化。細胞擴大且微團變得密實得多。在7-8天時，微團凝聚成可見的小球并向上脫離培養皿。

此時，利用阿爾新藍試劑對細胞進行染色以檢測蛋白糖基化。將細胞在PBS中洗滌2次，然后在4℃下在4％多聚甲醛中過夜固定。將細胞與0.1NHCl中的1％(w/v)阿爾新藍一起孵育。在室溫下孵育板1小時。將板用0.1N HCl洗滌3次以除去過量染料。整個微團染上深藍色且周圍細胞的細胞質也染上藍色。對照皿幾乎沒有至沒有染色。

骨生成

根據制造商的說明書使50000個細胞在骨生成誘導培養基(Cambrex)中生長。簡而言之，將細胞涂布到6cm皿中含10％FBS的DMEM中，并允許附著。利用骨生成誘導培養基培養細胞，所述培養基每兩天更換一次。培養10-14天之后，開始顯示骨生成形態變化。經歷骨生成時，生殖腺SP細胞變大并變成立方形。

培養21天之后，用von Kossa試劑對骨原細胞進行染色以鑒定表示早期骨生成的鈣化沉積。將細胞在PBS中洗滌2次，然后在4℃下在4％多聚甲醛中過夜固定。將板在dH₂O中洗滌2次。添加5％硝酸銀(w/v)并使板暴露于UV光45-60分鐘。將板在dH₂O中洗滌直至除去所有硝酸銀。用2％硫代硫酸鈉對板進行復染色持續5分鐘。接近90％的細胞染上von Kossa。

神經形成

使50000個細胞在含20％FBS并補充有1mM β-巰基乙醇的DMEM中生長共3天。每天更換培養基。早在培養后2天便可看到神經形成的形態跡象。神經元樣樹狀突出物開始發展且細胞體開始具有錐狀形態，這是神經元特有的形狀。培養3天后，針對巢蛋白對細胞進行染色。將細胞在PBS中洗滌2次，然后在4℃下在4％多聚甲醛中過夜固定。用PBS封閉緩沖液(1xPBS+10％FBS)中稀釋的Fc封閉物(BD Pharmingen)封閉板30分鐘。將細胞在PBS-T洗滌緩沖液(1x PBS+0.1％Triton X-100)中洗滌3次并在PBS-T中進一步孵育30分鐘。將小鼠抗-巢蛋白(IgG1)(Chemicon，Temecula，CA)在1x PBS-T+2％FBS中稀釋至最終稀釋度為1∶200，然后伴隨著等速旋轉孵育1小時。將板在PBS-T中洗滌2次。將在PBS-T+2％FBS中以1∶200稀釋的抗小鼠免疫球蛋白PE(BD Pharmingen)孵育30分鐘以用于可視化。約70％已分化的GDSC-SP細胞表達巢蛋白。

心臟發生

使50000個細胞在含10％FBS并補充有5-氮雜胞苷(Sigma)至終濃度為9mM的DMEM中生長。在心臟發生誘導培養基中培養細胞3天，然后將培養基改變為含10％FBS的DMEM，并針對心臟標志物肌鈣蛋白對細胞進行染色。將細胞在PBS中洗滌2次，然后在4℃下在4％多聚甲醛中過夜固定。用含10％FBS的1x PBS中稀釋的Fc封閉物(BD Pharmingen)封閉板15分鐘。將細胞在PBS-T洗滌緩沖液(1x PBS+0.1％Triton X-100)中洗滌2次并在PBS-T中進一步孵育30分鐘。將小鼠抗肌鈣蛋白1(IgG2a)(Chemicon)在1x PBS-T+2％FBS中稀釋至最終稀釋度為1∶200，然后伴隨著等速旋轉孵育1小時。將板在PBS-T洗滌2次。將在PBS-T+2％FBS中以1∶200稀釋的抗-小鼠Ig PE(BD Pharmingen)孵育30分鐘以用于可視化。

實施例6

在小鼠中利用GDSC-SP細胞誘導創傷愈合

在NOD/Scid小鼠(每組3只動物)的背部開約10cm的切口并保持創傷打開。在一組小鼠中，在損傷后約1分鐘時，將50000個GDSC-SP細胞注射在損傷位點。第二組小鼠不接受細胞移植(對照組)。在損傷后2周時，取損傷位點的組織切片以評價創傷愈合和組織再生的程度。

損傷后14天，來自對照小鼠的組織切片展示出創傷誘導的皮膚結構破壞和疤痕組織形成。來自植入GDSC-SP細胞的小鼠的組織切片展示出恢復正常皮膚組織的創傷愈合，且沒有疤痕組織的證據。

除另指出外，在所有情況下，說明書和權利要求中所使用的所有表示成分數量、性質(例如分子量)、反應條件等的數值均應理解成受術語“約”修飾。因此，除非有相反的說明，說明書和所附權利要求中列出的數值參數均為近似值，其可根據本發明想要獲得的期望性質而改變。在最低程度上，且并不旨在將等同原則的應用限制于權利要求保護的范圍，至少應該根據所報告數字的有效數位和通過慣常的四舍五入法來理解每一個數字參數。盡管陳述本發明的寬廣范圍的數值范圍和參數是近似值，但在具體實施例中所述數值被盡可能精確地報告。然而，任何數值都固有地包含了必然來自于在它們各自的測試測量中出現的標準偏差的某些誤差。

描述本發明的內容時，不使用數量詞時(尤其在權利要求書的上下文中)應解釋為涵蓋單數和復數，除非另外指明或者與上下文明顯矛盾。本文中數值范圍的列舉僅意欲作為分別指每個落入所述范圍內的單獨值的簡略表達方法。除非本文另有說明，每個單獨的值均如其在本文中被單獨地引用一樣包含在本說明書中。除非在本文中另外指明或同上下文明顯抵觸，否則本文所述的所有方法均可以任何適當的順序進行。本文中所提供的任何和所有實例或示例性語句(如″例如")的使用僅意欲用來更好地闡述本發明，而非對本發明原本要求保護的范圍進行限制。說明書中的任何語言均不應被解釋為指示任何未要求保護的要素對于本發明的實施而言是必須的。

本文公開的本發明的替代要素或實施方式的分組不應理解為限制性的。各個組組員可以單獨地或者以與所述組的其它組員或者本文內的其它要素任意組合被指代且要求保護。應當預期，組的一個或更多個組員可以由于方便和/或專利性的原因包含在組中或從組中刪除。當出現任何這類包含或刪除時，認為說明書包含所改寫的組，從而滿足用于所附權利要求中的所有馬庫什組的書面描述。

本文描述了本發明的優選實施方式，包括本發明的發明人已知的實現本發明的最佳模式。當然，本領域普通技術人員閱讀上述說明書后會明白這些優選實施方式的變型。發明人預期熟練的技術人員可適當地采用此類變型，并且發明人意欲使得本發明以與本文具體描述不同的方式被實施。因此，本發明在適用法律允許的條件下包括所附權利要求中所提及主題的所有修改形式和等效形式。此外，除非在本文中另外指明或同上下文明顯抵觸，否則本發明涵蓋上述要素在其所有可能變型中的任意組合。

此外，本說明書通篇引用了許多專利和印刷出版物。每個上面所引用的參考文獻和印刷出版物被分別以引用方式整體并入本文中。

最后，應理解本文所公開的本發明的實施方式僅用于闡述本發明的原則。其它可用的修改也在本發明的范圍內。因此，通過示例而非限制方式，可根據本文的教導利用本發明的替代實施方式。因此，本發明并不限于如精確所示和所述的實施方式。