本發明涉及肺癌超早期篩查檢測
技術領域：
，特別是一種以血漿游離dna為基礎的針對肺癌0期及i期的無創篩查技術。
背景技術：
：據全國腫瘤登記中心的最新的數據顯示，全國肺癌新發病例約73.3萬例，位居所有惡性腫瘤發病率的第一位(19.9％)；死亡病例約59.1萬，占全部惡性腫瘤死亡病例的第一位(26.5％)。在當前的醫療體系下，中晚期肺癌患者五年的生存率僅為10-20％，但對于早期肺癌病人的治療，通過手術切除的方法約有80-90％以上可以治愈。因此肺癌早篩意義重大，有效的早期篩查和干預治療可使肺癌的發生率下降60％，病死率下降80％。然而絕大多數的早期肺癌(尤其是0期和i期)患者無任何明顯的臨床癥狀。患者在初次診斷出肺癌時，85％為中晚期，早期診斷的比例僅約14％。早期肺癌沒有明顯的臨床癥狀，待出現相關臨床癥狀時已是肺癌的中晚期，只有約15.8％的患者生存期能達到五年以上，此時病人的臨床癥狀較為明顯，相關的體外輔助診斷已無太大意義。“防患于未然”是當前精準醫療及醫療大數據時代背景下的核心目標。肺癌的早期發現、早期診斷、早期治療是降低肺癌死亡人數的重要措施。然而當前肺癌的超早期診斷技術極具挑戰，有諸多技術難點尚未克服。目前對于肺癌早期篩查的方法有多種，比如低劑量ct診斷、組織細胞層面的肺癌診斷、基因層面的肺癌診斷等。但這些技術手段存在諸多弊端：低劑量ct檢測存在較多的假陽性，并且檢測成本高；組織層面的肺癌診斷在取樣方面會給患者帶來較大痛苦，且有可能導致癌細胞擴散或轉移；基因層面的腫瘤特異性分子標志物檢測可作為肺癌早期診斷的一種手段，但技術尚未成熟。液態活檢是一種極具臨床應用前景的無創檢測技術，可以通過采血來檢測血液中游離ctdna，而在腫瘤早期篩查的臨床應用中最重要的是尋找與早期肺癌相關性強的腫瘤標志物，通過基因檢測的技術手段實現早期發現腫瘤的目的。近幾年，多個臨床實驗結果表明，腫瘤發生過程中某些特定基因的甲基化程度可作為腫瘤診斷的一種分子標志，并且這種改變是腫瘤所特有的。dna甲基化發生在腫瘤的早期階段，因而能夠在腫瘤形成初期利用基因檢測手段提前發現，為之后的預防、治療、疾病監控以及預后提供一個直觀的潛在指標。在本發明中，我們采用檢測血液中的循環腫瘤dna(ctdna)中與早期肺癌相關基因的甲基化狀態判斷是否發生腫瘤。dna甲基化是表觀遺傳學水平基因表達、細胞發育和細胞分化等過程調控的重要方式。異常的dna甲基化在癌癥發生過程中有重要作用。dna甲基化主要發生在-c-磷酸-g-(cpg)位點。以肺癌組織或細胞為對象的甲基化研究均發現，shox2和ptger4基因cpg島的甲基化水平比正常組織或細胞明顯升高，即超甲基化現象。另外，有報道顯示，癌癥相關基因在不同時期的癌癥以及不同惡性程度的腫瘤中發生超甲基化的dna靶序列有差異，說明早期肺癌的發生具有一定的序列特異性。本專利涉及兩個肺癌相關的標志物：1、人矮小同源盒基因shox2(shortstaturehomebox2)是同源盒基因家族的一員，其表達于中胚層和外胚層，對骨骼、心臟和神經系統的發育起到重要的作用。有研究發現，96％的肺癌患者shox2發生高度甲基化，并且與基因拷貝數明顯相關。并且最新的研究表明，shox2基因的甲基化與肺癌密切相關，這也提示了shox2基因的甲基化可能成為肺癌的早期篩查指標。并且有相關研究表明在-800bp到-900bp、-1550bp到-1650bp和+2700bp到+2800bp等幾個位點shox2基因發生甲基化的概率較高。2、前列腺素e受體基因ptger4(prostaglandinereceptor4gene)甲基化程度與肺癌的發生密切相關，并且與shox2基因聯合檢測，能夠提高肺癌檢出率以及準確性。對于ptger4基因與肺癌發生密切相關的甲基化區域位于第二外顯子3’末端區域的部分序列。dna異常甲基化是人類腫瘤常見的改變。發生在啟動子區以及基因內部的cpg島異常甲基化是基因失活的最常見機制。目前檢測dna甲基化檢測方法有：甲基化特異性的pcr(methylation-specificpcr，msp)、亞硫酸氫鹽測序法(bisulfitesequencingpcr，bsp)、高分辨率熔解曲線法(highresolutionmelting，hrm)和高通量測序方法等。相對于其他的檢測方法而言，亞硫酸氫鹽測序法(bisulfitesequencingpcr，bsp)是dna甲基化檢測中的“金標準”，檢測較為精準，但其檢測靈敏度相對較低，且操作較繁瑣、成本高。高分辨率熔解曲線法(highresolutionmelting，hrm)在pcr擴增中通過觀察熔解曲線的變化來判斷dna是否發生甲基化，此類方法結果分析相對復雜。高通量測序檢測方法主要是涉及到的成本太高，不利于臨床上的推廣。隨著對腫瘤研究的深入，逐漸發現在癌癥的診斷和治療過程中組織活檢技術有一定的局限性。主要表現為：腫瘤具有異質性，對于癌細胞已經發生轉移的患者而言，僅僅取某個部位的腫瘤組織，并不能反映患者的整體情況，但對所有的腫瘤組織都取樣檢測又不切實際；某些患者自身的情況決定了他不適合做組織活檢；受到手術的擾動之后，有些腫瘤有加速轉移的風險；組織活檢的滯后性對患者的治療也是不利的。因此對于癌癥的診斷和檢測技術有更高的要求。液態活檢技術的出現，解決了上述的問題，也提前了癌癥的診斷時間。液態活檢是一種技術，更是一種臨床解決方案。在液態活檢的背景下可以有很多應用，包括臨床和面對消費者。當前基因檢測的靶點主要包括dna的突變、基因擴增、基因融合、缺失/插入等，這種是一種不可逆的變化。而dna的變化遠遠不止這些，一些表觀修飾會對基因功能產生影響，進而影響細胞功能和個體健康，如基因啟動子區的甲基化發生在多數情況下會抑制轉錄因子與啟動子的結合，激活或抑制基因的功能。拿一個常見的例子說明，很多人喜歡健身塑體，在肌肉的強化過程中，就包含了特定基因的甲基化動態變化過程。這種動態監測過程，不可能多次獲取組織，通過無創的液態活檢可以實現多次、實時的監控。我們會逐漸發現這種技術會在很多層面的應用。液態活檢的優勢就在于能通過非侵入性取樣降低活檢的危害，而且有效延長患者生存期，性價比高。相對組織較易獲得，且對患者無創。但血漿中腫瘤循環dna的量較少，且易發生降解。因此，檢測血漿中基因的甲基化難度相對較大，不僅需要得到高質量的腫瘤循環dna以及高質量的重亞硫酸鹽轉化后dna，而且需要將基因的甲基化高靈敏度、高準確度地檢測出來。因此，對于此類檢測試劑盒的開發需要具備兩個方面的要求：高特異性以及高靈敏度。技術實現要素：本發明的目的是提供一種針對肺癌早期檢測具有高靈敏度和特異性的組合物及其試劑盒，通過檢測肺癌高風險人群血液中游離dna的shox2基因和ptger4基因啟動區、基因編碼及非編碼區域中的3個目標位點甲基化情況來篩查早期肺癌患者，并輔助肺癌的早期診斷。對于甲基化特異性的pcr(methylation-specificpcr，msp)檢測方法，操作簡便、耗時較短，結果易于分析。為了實現上述目的，本發明提供的一種用于早期肺癌無創篩查的組合物，所述組合物包括分別用于檢測待檢樣品中與早期肺癌相關的甲基化區域的3個shox2基因的核酸序列、3個ptger4基因的核酸序列和1個內參基因的核酸序列，其中，針對shox2基因的3對甲基化特異性引物、針對ptger4基因的3對甲基化特異性引物和1對內參基因引物的序列如下：shox2基因1正向引物f：tgatgtttttttgtcggag，shox2基因1反向引物r：tcaaaacaaaaaaccgc；shox2基因2正向引物f：gtttgtatttttttcgat，shox2基因2反向引物r：cacgaataataaaacgaat；shox2基因3正向引物f：ttttttgggtagttaatatgg，shox2基因3反向引物r：ccaaataatctccgtcc；ptger4基因1正向引物f：tagttttgtcgcgttttagptger4基因1反向引物r：taaccatctaaatctcgacgptger4基因2正向引物f：gaggtagcggggtggtttptger4基因2反向引物r：acctcgctaaacaccgaacaaptger4基因3正向引物f：gttttcgggttattggtttptger4基因3反向引物r：accgacctattaaacacttt內參基因(β-actin)正向引物f：gtgatggaggaggtttag，內參基因(β-actin)反向引物r：aaattacaaaaaccacaa。優選地，所述組合物還包括shox2基因的3個甲基化位點對應的mgb探針、ptger4基因的3個甲基化位點對應的mgb探針以及內參基因對應的mgb探針，具體核苷酸序列如下：shox2基因1探針：fam-agcgacgttgcgt-mgb-bhq1；shox2基因2探針：fam-ttcggttcgtaggt-mgb-bhq1；shox2基因3探針：fam-tgcgatttcggtcg-mgb-bhq1；ptger4基因1探針：cy5-ttcggcgtcgtcg-mgb-bhq2ptger4基因2探針：cy5-gcggtcgcggtcg-mgb-bhq2ptger4基因3探針：cy5-cgtggcgatggttatcmgb-bhq2內參基因(β-actin)探針：vic-caccacccaacacacaat-mgb-bhq1；其中探針序列的5’端標記熒光報告基團，3’端標記淬滅基團。優選地，所述組合物還包括shox2基因的3個非甲基化目的基因對應的mgb探針和ptger4基因的3個非甲基化目的基因對應的mgb探針，具體核苷酸序列如下：shox2基因1簡并封閉引物：agygaygttgygt-cy3-spacer；shox2基因2簡并封閉引物：ttyggttygtaggt-cy3-spacer；shox2基因3簡并封閉引物：tgygatttyggtyg-cy3-spacer；ptger4基因1簡并封閉引物：ttyggygtygtyggagt-cy3-spacer；ptger4基因2簡并封閉引物：tygaggyggtygyggtyg-cy3-spacer；ptger4基因3簡并封閉引物：aygtggygatggttatyggg-cy3-spacer；其中探針序列的5’端標記熒光報告基團，3’端標記淬滅基團。用于早期肺癌無創篩查的甲基化檢測試劑盒，包括shox2基因的3對甲基化特異性引物和ptger4基因的3對甲基化特異性引物及1對內參基因引物、還包括shox2基因的3個甲基化位點對應的mgb探針和ptger4基因的3個甲基化位點對應的mgb探針以及內參基因對應的mgb探針，還包括shox2基因的3個非甲基化目的基因對應的mgb探針和ptger4基因的3個非甲基化目的基因對應的mgb探針。優選地，所述試劑盒包括pcr反應液、udg酶。優選地，所述pcr反應液包括dnataq聚合酶、dntps和mg2+、10×dna聚合酶buffer。優選地，其判讀方法為，所檢測shox2和ptger4基因至少兩個位點發生甲基化或者shox2和ptger4至少有一個位點同時發生甲基化，用于評估早期肺癌的發生。用于早期肺癌無創篩查的甲基化檢測試劑盒的樣本處理方法，包括：(1)提供樣本，所述樣本來源于健康人、肺癌高危人群以及早期肺癌患者的外周血或者分離得到的血漿；(2)由步驟(1)中血漿樣本進行游離dna的提取，進行dna質量監控，選取od260/280在1.8～2.0之間的dna；(3)由步驟(2)中得到的游離dna，進行重亞硫酸鹽轉化，使dna中未發生甲基化的5’胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而發生甲基化的5’胞嘧啶不發生改變，最后得到bis-dna；(4)由步驟(3)中得到的bis-dna為模板，使用權力要求1-3中任一項所述的用于早期肺癌無創篩查的組合物進行pcr擴增。優選地，步驟(4)中pcr擴增，優選地，pcr混合物包括75-150ngbis-dna模板和200-400nm引物，100-300nm探針，1utaq聚合酶，1-10mm的mgcl2等，所述pcr反應過程為：37℃下udg酶反應2min，95℃預變性3min；94℃變性15s，60℃退火延伸35s，45個循環。本發明提供的一種用于早期肺癌無創篩查的組合物及其應用,具有如下有益效果。本發明試劑盒檢測shox2和ptger4基因甲基化的位點不僅包括基因的啟動子區域，還包括基因的編碼區域和非編碼區，這樣進行多區域檢測有利于發現與早期肺癌高度相關的shox2基因和ptger4基因的靶序列，同時也能夠提高檢測的準確性及特異性，提高shox2和ptger4基因甲基化的檢出率。該試劑盒在分子水平上對于肺癌早期篩查具有很強針對性，具有檢測特異性好、靈敏度高和可靠性佳等優點，這樣對于早期可能的肺癌患者及早的進行預防以及采取相應的治療措施。本發明試劑盒主要采用taqman-mgb探針檢測的手段，通過探針與甲基化序列特異性結合，以及優化的反應體系，對shox2和ptger4基因甲基化位點精確檢測。對比于用pcr特異性引物進行檢測的方法，利用探針對甲基化位點進行識別，具有更高的靈敏度、精準性。并且在mgb探針的基礎上，引入簡并封閉引物技術。本發明采用這種技術進行相關基因的甲基化檢測，通過無創的液態活檢，操作簡便、易于判讀，對儀器的要求不高，并且整個pcr過程采用全封閉形式，避免了交叉污染的可能，使結果更加精準。試劑盒檢測的高靈敏性適用于肺癌的早期篩查。附圖說明圖1為實施例1的檢測結果。具體實施方式為了使本
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的人員更好地理解本發明方案，下面結合具體實施方式對本發明作進一步的詳細說明。實施例1：檢測i期肺癌患者血漿游離dna中shox2和ptger4基因的甲基化。試劑盒組分如下表：選取5個健康人的血漿樣本，以及已知病理信息為肺癌i期的5個腫瘤血漿樣本。1、對上述10例血漿樣本進行提取游離dna。2、游離dna提取完成，對提取好的dna進行重亞硫酸鹽轉化，未甲基化的胞嘧啶(c)轉變為尿嘧啶(u)，而甲基化的胞嘧啶(c)不變。得到純化好的bis-dna。3、配制pcr反應液：dna聚合酶、dntps、mg2+、10×dna聚合酶buffer、shox2和ptger4基因1引物探針、shox2和ptger4基因2引物探針、shox2和ptger4基因3引物探針、內參基因引物探針、shox2和ptger4基因1簡并封閉引物、shox2和ptger4基因2簡并封閉引物、shox2和ptger4基因3簡并封閉引物。4、pcr反應條件為：37℃udg酶反應2min；95℃預變性3min；94℃變性15s，60℃退火延伸35s，45個循環；5、pcr反應體系的配置dnapcr擴增mix:組分一人份加入量(μl)dna聚合酶0.25dntps2mg2+3-3.510×dna聚合酶buffer2.5udg酶0.1dutp0.01pcr擴增反應體系:組分一人份加入量(μl)dnapcr擴增mix12.5shox2基因1/2/3-f(10μm)0.5shox2基因1/2/3-r(10μm)0.5shox2基因1/2/3-fp(10μm)0.2ptger4基因1/2/3-f(10μm)0.5ptger4基因1/2/3-r(10μm)0.5ptger4基因1/2/3-fp(10μm)0.2shox2基因blocker1/2/3(20μm)0.2ptger4基因blocker1/2/3(20μm)0.2內參基因-f(10μm)0.3內參基因-r(10μm)0.3內參基因-fp(10μm)0.2純化水6.9模板2pcr擴增程序如下：第一擴增階段：37℃udg酶反應2min；第二擴增階段：95℃預變性3min；第三擴增階段：94℃變性15s，60℃退火延伸35s，45個循環；信號收集，第三階段60℃收集fam、vic以及cy5信號。6、檢測結果分析利用上述反應體系對10例樣本進行檢測，檢測結果如圖1所示。顯示本發明試劑盒能夠準確檢出5例肺癌i期陽性樣本，目的基因1/2/3ct值與內參基因ct值之差均小于8，說明shox2和ptger4基因發生甲基化。對剩下的5例陰性樣本沒有擴增曲線，目的基因1/2/3ct值與內參基因ct值之差均大于8，說明shox2和ptger4沒有發生甲基化。7、結果判讀分析(如表1)1)滿足內標通道有s型擴增曲線，且ct值≤32，shox2和ptger4基因通道無s型擴增曲線或ct值＞40，△ct值＞8，且則判定結果為陰性；2)滿足內標通道有s型擴增曲線，且ct值≤32，shox2或ptger4基因通道至少兩個甲基化區域檢測ct值≤40，△ct值≤8，則判定結果為陽性；3)滿足內標通道有s型擴增曲線，且ct值≤32，shox2和ptger4基因通道至少有一個甲基化區域同時滿足檢測ct值≤40，△ct值≤8，則判定結果為陽性；4)若內標通道無s型擴增曲線或ct值＞32，則判定結果無效，建議重新提取樣本進行檢測。表1結果判讀參考實施例2：收集來自上海肺科醫院的93例早期肺癌患者(0期27例，i期66例)的血漿樣本和來自山東齊魯醫院的100例正常人血漿樣本，對這193例血漿樣本進行shox2和ptger4基因甲基化的檢測，具體操作步驟如實施案例1所述。100例正常血漿樣本檢測結果中，95例樣本的目的基因1/2/3ct值與內參基因ct值之差均大于8，特異性達到95％；而對于93個早期肺癌血漿樣本，檢測出88例樣本結果目的基因1/2/3ct值與內參基因ct值之差均小于8，其敏感性達到95％，其中0期肺癌為89％，i期肺癌為97％。本文中應用了具體個例對發明構思進行了詳細闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的核心思想。應當指出，對于本
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的普通技術人員來說，在不脫離該發明構思的前提下，所做的任何顯而易見的修改、等同替換或其他改進，均應包含在本發明的保護范圍之內。sequencelisting<110>北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司<120>一種用于早期肺癌無創篩查的組合物及其應用<130>p20170065<160>27<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1tgatgtttttttgtcggag19<210>2<211>17<212>dna<213>人工序列<400>2tcaaaacaaaaaaccgc17<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3gtttgtatttttttcgat18<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4cacgaataataaaacgaat19<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5ttttttgggtagttaatatgg21<210>6<211>17<212>dna<213>人工序列<400>6ccaaataatctccgtcc17<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列<400>7tagttttgtcgcgttttag19<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8taaccatctaaatctcgacg20<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列<400>9gaggtagcggggtggttt18<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<400>10acctcgctaaacaccgaacaa21<210>11<211>19<212>dna<213>人工序列<400>11gttttcgggttattggttt19<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12accgacctattaaacacttt20<210>13<211>18<212>dna<213>人工序列<400>13gtgatggaggaggtttag18<210>14<211>18<212>dna<213>人工序列<400>14aaattacaaaaaccacaa18<210>15<211>13<212>dna<213>人工序列<400>15agcgacgttgcgt13<210>16<211>14<212>dna<213>人工序列<400>16ttcggttcgtaggt14<210>17<211>14<212>dna<213>人工序列<400>17tgcgatttcggtcg14<210>18<211>13<212>dna<213>人工序列<400>18ttcggcgtcgtcg13<210>19<211>13<212>dna<213>人工序列<400>19gcggtcgcggtcg13<210>20<211>16<212>dna<213>人工序列<400>20cgtggcgatggttatc16<210>21<211>18<212>dna<213>人工序列<400>21caccacccaacacacaat18<210>22<211>13<212>dna<213>人工序列<400>22agygaygttgygt13<210>23<211>14<212>dna<213>人工序列<400>23ttyggttygtaggt14<210>24<211>14<212>dna<213>人工序列<400>24tgygatttyggtyg14<210>25<211>17<212>dna<213>人工序列<400>25ttyggygtygtyggagt17<210>26<211>18<212>dna<213>人工序列<400>26tygaggyggtygyggtyg18<210>27<211>20<212>dna<213>人工序列<400>27aygtggygatggttatyggg20當前第1頁12