本發明涉及生物醫藥領域，具體而言，涉及一種β-廣藿香烯的制備方法、藥物組合物及應用。
背景技術：
β-廣藿香烯，存在于廣藿香中的天然倍半萜成分之一，其分子式為c15h24，分子量為204.36。外觀為淡黃色油狀液體，不溶于水，易溶于乙醇、石油醚等常用有機溶劑。目前，研究者對廣藿香烯的研究非常少。發明人發現β-廣藿香烯可通過精餾-柱層析方法從廣藿香油提取分離得到，但廣藿香油的制備原料廣藿香藥材中β-廣藿香烯的含量因產地而異，且含量偏低，僅從廣藿香油中獲取β-廣藿香烯，不利用β-廣藿香烯的應用開展。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種β-廣藿香烯及其制備方法、藥物組合物及應用，其旨在改善現有的β-廣藿香烯不易制備的問題。
本發明提供一種技術方案：
一種β-廣藿香烯的制備方法，其包括：廣藿香醇與酸在有機溶劑中反應，用非極性溶劑萃取反應產物，然后將萃取液用色譜柱分離。
進一步地，上述廣藿香醇與酸在有機溶劑中反應，有機溶劑為乙醇或者甲醇。
進一步地，上述非極性溶劑為正己烷或石油醚。
進一步地，上述用色譜柱分離萃取液包括將萃取液用硅膠柱色譜分離，然后用中性氧化鋁柱色譜分離。
進一步地，上述硅膠柱的填料粒徑為200～300目；中性氧化鋁柱的填料粒徑為200～300目。
進一步地，用色譜柱分離萃取液，采用非極性物質洗脫。
進一步地，上述酸為鹽酸或者硫酸。本發明還提供一種技術方案：
一種β-廣藿香烯，其通過上述的β-廣藿香烯的制備方法制得。
本發明還提供一種技術方案：
一種藥物組合物，其有效成分包括上述的β-廣藿香烯。
進一步地，上述的藥物組合物還包括藥學上可接受的載體或輔料。
本發明還提供一種技術方案：
上述的藥物組合物在制備預防和/或治療急性胃潰瘍藥物中的應用。
本發明實施例提供的一種β-廣藿香烯的制備方法、藥物組合物及應用的有益效果是：
采用廣藿香醇與鹽酸發生脫水反應，得到β-廣藿香烯，該方法產率高達80％；且產物容易分離、得到的β-廣藿香烯純度高。以廣藿香醇為原料制備廣藿香烯，原料易得，減少制備過程中的程序，增加廣藿香烯的應用。
此外，將β-廣藿香烯應用于預防和/或治療急性胃潰瘍的藥物中，增加β-廣藿香烯新的用途，促進其產業、商業化。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。
圖1為本發明實施例1合成產物的質譜圖；
圖2為本發明實施例1合成產物的核磁共振氫譜圖；
圖3為本發明實施例1合成產物的核磁共振碳譜圖；
圖4為β-廣藿香烯對無水乙醇誘導大鼠胃潰瘍面積和抑制率的影響；
圖5為β-廣藿香烯對無水乙醇誘導大鼠急性胃黏膜損傷的病理學評分；
圖6示出了吲哚美辛誘導大鼠胃潰瘍面積和抑制率的影響；
圖7示出了β-廣藿香烯對吲哚美辛誘導大鼠急性胃黏膜損傷的病理學評分。
具體實施方式
β-廣藿香烯是一種奧類化合物。是一種特殊的倍半萜，具有5元環與7元環駢合而成的芳香骨架。其分子式為c15h24，分子量為204.36，結構式如下：
目前β-廣藿香烯可通過精餾-柱層析方法從廣藿香油提取分離得到。分離制備步驟如下：
加700.00g廣藿香油進入精餾塔塔底(壓力6kpa)，加熱升溫至釜溫達到135.0℃時，廣藿香油開始沸騰并出現回流，保持溫度和真空度穩定，使其全回流3h后，繼續加熱升溫。調整回流比，采集餾出物并分析餾分，收集不同溫度段的樣品。最后合并β-廣藿香烯含量達80％以上的餾分。
但是從廣藿香油中分離提取β-廣藿香烯，很難將β-廣藿香烯與廣藿香油中的其余組分分離。進一步地，由于廣藿香油從廣藿香中提取得到，原料廣藿香藥材中β-廣藿香烯的含量因產地而異，β-廣藿香烯在廣藿香中的含量較低，導致上述的方法制得的β-廣藿香烯產量低。
為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
下面對本發明實施例的β-廣藿香烯及其制備方法、藥物組合物及應用進行具體說明。
一種β-廣藿香烯的制備方法，其包括廣藿香醇與酸在有機溶劑中反應，用非極性溶劑萃取反應產物，然后將萃取液用色譜柱分離。
本發明采用合成法將廣藿香醇合成β-廣藿香烯，反應結構式及機理如下：
以酸作為催化劑，廣藿香醇發生脫水反應，得到β-廣藿香烯的產率較高，經發明人對實驗結果的檢測，β-廣藿香烯的產率高達80％。反應完全后采用非極性溶劑對反應產物萃取。在本發明較佳的實施例中，對反應產物進行多次萃取，將多次萃取的萃取液合并之后濃縮。濃縮后用色譜柱分離得到產物β-廣藿香烯。
進一步地，上述有機溶劑為乙醇或者甲醇。需要說明的是，在本發明的其他實施例中，廣藿香醇與酸溶液的反應也可在其他能夠溶解廣藿香醇的有機溶劑中，優選地，該有機溶劑為醇類。
進一步地，上述廣藿香醇與乙醇溶液的用量比為1～10mg/ml，具體地，廣藿香醇與乙醇溶液用量比為4-6mg/ml。
進一步地，上述酸溶液為鹽酸水溶液或者硫酸水溶液。優選地，上述鹽酸為稀鹽酸，進一步地，稀鹽酸的體積分數為10％；稀鹽酸的體積與廣藿香醇和乙醇總體積之比為：3:2。在本發明的其他實施例中，上述酸也可為乙酸、硼酸等其他酸。
進一步地，為了加快廣藿香醇與酸溶液的反應進程，在本發明較佳的實施例中，該反應的反應溫度為35℃-40℃、反應在轉速為120～220rpm的振蕩器中進行。
在本發明較佳的實施例中，上述非極性溶劑為正己烷或石油醚。在其他實施例中，上述非極性溶劑也可為環己烷、四氯化碳等極性較低的溶劑。
進一步地，上述色譜柱分離步驟包括將萃取液用硅膠柱色譜分離，然后用中性氧化鋁柱色譜分離。優選地，硅膠柱的填料粒徑為200～300目；中性氧化鋁柱的填料粒徑為200～300目。
承上所述，將萃取液用色譜柱分離過程中，采用非極性物質。進一步地，在本發明較佳的實施例中，洗脫液為正己烷。在其他實施例中，上述洗脫液也可為石油醚等其他非極性物質。
進一步地，在本發明較佳的實施例中，采用廣藿香醇合成β-廣藿香烯的具體操作步驟如下：
將裝有稀鹽酸的容器置于振蕩器上，在37℃，220rpm的條件下振蕩，向容器中加入廣藿香醇-乙醇溶液，廣藿香醇與乙醇的比例為10mg/ml；待反應完全后，用等體積的正己烷對反應產物萃取3次，合并萃取液，旋蒸濃縮得到混合物。
將混合物分別用300目的硅膠柱色譜和300目的中性氧化鋁柱色譜進行分離，采用正己烷洗脫，合并洗脫液，旋蒸濃縮。
本發明還提供一種技術方案：
一種β-廣藿香烯，其通過上述的β-廣藿香烯的制備方法制得。
發明人研究及實驗發現，β-廣藿香烯能夠治療急性胃潰瘍。β-廣藿香烯具有防治急性胃潰瘍的生物活性。
本發明還提供一種技術方案：
一種藥物組合物，其有效成分包括上述的β-廣藿香烯。
進一步地，可在上述的藥物中加入一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結合，制成可作為人用適當的施用形式或劑量形式。
本發明提供的藥物組合物可以為單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如鼻腔、皮下、肌肉、口服等。相應地，給藥劑型例如片劑、膠囊、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑等。可以是普通制劑、緩釋制劑、控釋制劑等。
在本發明較佳的實施例中，上述藥物組合物還包括藥學上可接受的載體或輔料。
為了將單位給藥劑型支撐片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子，稀釋劑與吸收劑；如淀粉、糊精、乳糖、蔗糖、硅酸鋁等。濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、明膠漿、甲基纖維素等。崩解劑，例如海藻酸鹽、瓊脂粉、碳酸氫鈉、十二烷基磺酸鈉等。
承上所述，為了將給藥單元制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑或混懸劑，可以采用本領域常用的所有稀釋劑，例如水、乙醇、1，3-丙二醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸等。此外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，以及常規的助溶劑、緩沖劑、ph調節劑等。
本發明實施例提供的藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預防或治療疾病的性質和嚴重程度，患者或者動物的性別、年齡、體重及個體反應。所用的具體的化合物，給藥途徑及給藥次數等。進一步地，上述劑量可以為單一劑量或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥。
本發明還提供一種技術方案：
上述的藥物組合物在制備預防和/或治療急性胃潰瘍藥物中的應用。
以下結合實施例對本發明的特征和性能作進一步的詳細描述。
實施例1
本實施例提供一種β-廣藿香烯，其主要由以下步驟制得：
將裝有稀鹽酸的容器置于振蕩器上，在37℃，120rpm的條件下振蕩，向容器中加入廣藿香醇-乙醇溶液，廣藿香醇與乙醇的比例為1mg/ml；稀鹽酸的體積分數為10％；稀鹽酸與廣藿香醇-乙醇溶液的體積之比為：3:2。待反應完全后，用等體積的正己烷對反應產物萃取2次，合并萃取液，旋蒸濃縮得到混合物。
將混合物分別用200目的硅膠柱色譜和200目的中性氧化鋁柱色譜進行分離，采用正己烷洗脫，合并洗脫液，旋蒸濃縮。
實施例2
本實施例提供一種β-廣藿香烯，其主要由以下步驟制得：
將裝有稀鹽酸的容器置于振蕩器上，在35℃，220rpm的條件下振蕩，向容器中加入廣藿香醇、甲醇溶液，廣藿香醇與甲醇的比例為6mg/ml；稀鹽酸的體積分數為8％；稀鹽酸與廣藿香醇-甲醇溶液的體積之比為：1:1。待反應完全后，用等體積的石油醚對反應產物萃取3次，合并萃取液，旋蒸濃縮得到混合物。
將混合物分別用300目的硅膠柱色譜和300目的中性氧化鋁柱色譜進行分離，采用正己烷洗脫，合并洗脫液，旋蒸濃縮。
實施例3
本實施例提供一種β-廣藿香烯，其主要由以下步驟制得：
廣藿香醇與鹽酸在甲醇溶液中反應，廣藿香醇與甲醇的比例為6mg/ml；鹽酸的濃度為10％，稀鹽酸與廣藿香醇-甲醇溶液的體積之比為：2:1。待反應完全后，石油醚對反應產物萃取，對萃取液采用300目的硅膠柱色譜和300目的中性氧化鋁柱色譜進行分離，采用正己烷洗脫，合并洗脫液后濃縮。
實施例4
本實施例提供一種藥物組合物，該藥物組合物包括實施例1得到的β-廣藿香烯。
具體地，取實施例1得到的β-廣藿香烯400g，加入乳糖480g、淀粉754g混合均勻，用7％的淀粉漿350g作為粘合劑，濕法制粒，烘干，加入硬脂酸鎂16g混勻，壓制成每片含β-廣藿香烯40mg的片劑，每片凈重0.2g。
實施例5
本實施例提供一種藥物組合物，該藥物組合物包括實施例1得到的β-廣藿香烯。
取實施例1得到的β-廣藿香烯200g，加入乳糖980g、淀粉1254g混合均勻，用7％的淀粉漿350g作為粘合劑，濕法制粒，烘干，加入硬脂酸鎂16g混勻，填充至1號膠囊制成10000粒，每粒膠囊內含β-廣藿香烯20mg，每片凈重0.3g。
實施例6
本實施例提供一種藥物組合物，該藥物組合物包括實施例1得到的β-廣藿香烯。
取實施例1得到的β-廣藿香烯300g，加入適量peg4000作為基質，適量液體石蠟為冷卻劑；滴制法制成含有每丸含β-廣藿香烯6mg的滴丸，每丸凈重30mg。
實施例7
稱取實施例1得到的β-廣藿香烯100g，加入到適量β-環糊精中制成包合物，加入適量乳糖、微晶纖維素、淀粉漿，混合均勻，逐漸加入乙醇和水，制成顆粒，進行分裝。規格為每包含β-廣藿香烯40mg的顆粒劑，每包凈重7g。
實施例8
稱取實施例1得到的β-廣藿香烯100g，加入增溶劑吐溫80，和一定比例的乙醇，充分攪勻；然后加入木糖醇作為矯味劑，溶解均勻，濾過澄清，將內容物裝入口服液玻璃瓶中，滅菌。規格為每瓶含β-廣藿香烯40mg的口服液，每瓶凈含量10ml。
試驗例1
對實施例1得到的產物(β-廣藿香烯)進行質譜、核磁共振檢測，檢測結果如圖1-圖3所示，圖1為產物的質譜圖；圖2為產物的核磁共振氫譜；圖3為產物的核磁共振碳譜。根據圖1-圖3的數據可知，得到的產物的結構以及分子量與β-廣藿香烯相同，說明本發明實施例1制得的產物為β-廣藿香烯；進一步說明本發明的制備方法制得的產物為β-廣藿香烯。
試驗例2
取spf級雄性sd大鼠，稱重，隨機分為正常組(intact)，模型組(vehicle)，蘭索拉唑組(lsz，200mg/kg)，β-廣藿香烯(β-pae)低、中、高劑量組(對應劑量為10，20，40mg/kg)，每組8只。分組后，標號，再稱量各大鼠體重，記錄并計算相應給藥體積(1ml/100g)。除正常組和模型組給予0.5％tween-80溶液，其他組均給予相應的藥物治療，每天灌胃給藥1次，連續給藥7天。于末次給藥后1小時，每只大鼠灌胃無水乙醇(0.5ml/100g)造成急性胃黏膜損傷，造模前大鼠需禁食24小時，自由飲水。灌胃無水乙醇1小時后，各大鼠安樂處死，取出全胃，沿胃大彎剪開胃壁，洗凈胃內容物，展開胃組織置于兩塊玻璃板之間固定以供拍照。用imagej圖形分析軟件(1.47v，nationalinstitutesofhealth，usa)測算潰瘍面積，并計算抑制率。抑制率(％)＝(模型組潰瘍面積－給藥組潰瘍面積)/模型組潰瘍面積×100％。于相同部位取0.5cm×0.5cm胃組織，固定于4％多聚甲醛溶液，常規制片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡(olympusbx53熒光顯微鏡)下觀察并拍照，由三位病理醫師采用獨立評分。
參照文獻進行胃黏膜炎癥及損傷程度的組織學病理評分并計算總分；其中，評分標準如表1所示。
表1大鼠胃黏膜炎癥及損傷程度的病理評分標準
各數據以均數±標準差(mean±sd)表示，應用graphpadprism7軟件制圖，spss20.0軟件進行統計學分析，各組間差異比較，采用單因素方差分析(one-wayanova)，方差齊時，組間兩兩多重比較采用lsd法。方差不齊時，組間兩兩多重比較采用dunnett’st3法。以p<0.05為標準，表示有顯著性差異。正常組與模型組的比較，采用獨立樣本t檢驗(student'sttest)。與正常組相比，#：p<0.05，##：p<0.01；與模型組相比，*：p<0.05，**：p<0.01。
β-廣藿香烯對無水乙醇誘導大鼠胃潰瘍面積和抑制率的影響如圖4所示；圖5為β-廣藿香烯對無水乙醇誘導大鼠急性胃黏膜損傷的病理學評分。
大鼠正常胃黏膜結構完整，黏膜表面胃小凹清晰可見，黏膜內腺體排列緊密規則，上皮未見脫落，腺體未見損傷，固有層未見出血及炎細胞浸潤。模型組胃粘膜損傷較深且面積較大，胃小凹結構破壞，出現水腫及炎性浸潤，大量上皮細胞變性，脫落、糜爛，腺體結構紊亂，有的缺失，固有層見中度出血(總評分為10.39±0.77)。蘭索拉唑組胃黏膜完整，上皮未見脫落，腺體未見損傷，固有層未見出血及炎細胞浸潤(總評分為6.56±0.62)。
通過圖4、圖5可知：β-廣藿香烯給藥組對上述病理損傷具有改善作用，其中β-廣藿香烯高劑量組(40mg/kg)作用較明顯，胃黏膜保持完整，上皮未見脫落，腺體未見損傷，固有層少見出血及炎細胞浸潤(總評分為5.61±0.71)，其他劑量均有不同程度的保護作用，中劑量組和低劑量組的總評分分別為6.39±1.00和6.94±0.93。
在正常組中幾乎沒有觀察到肉眼可見的損傷。與正常組相比，灌胃無水乙醇可顯著增加潰瘍面積，表明乙醇誘導的胃潰瘍模型成功建立。在蘭索拉唑的作用下，潰瘍面積顯著減少，平均為21.24±6.67mm2(抑制率為85.47％)。用不同劑量的β-廣藿香烯(10，20和40mg/kg)給藥后，潰瘍面積顯著降低，呈現劑量依賴性關系。此外，劑量為40mg/kg的β-廣藿香烯組潰瘍面積最小(11.48±2.80mm2)，抑制率最高(92.19％)。劑量為20和10mg/kg的β-廣藿香烯組中，潰瘍面積分別為15.76±4.13(抑制為89.35％)和17.27±6.66mm2(抑制率為88.22％)。
試驗例3
本試驗例研究β-廣藿香烯對吲哚美辛誘導的大鼠急性胃潰瘍模型的影響。
取spf級雄性sd大鼠，稱重，隨機分為正常組(intact)，模型組(vehicle)，蘭索拉唑組(lsz，200mg/kg)，β-廣藿香烯低、中、高劑量組(對應β-廣藿香量為10、20、40mg/kg)，每組8只。分組后，標號，再稱量各大鼠體重，記錄并計算相應給藥體積(1ml/100g)。除正常組和模型組給予0.5％tween-80溶液，其他組均給予相應的藥物治療，每天灌胃給藥1次，連續給藥7天。于末次給藥后30分鐘，每只大鼠灌胃吲哚美辛(1ml/100g)造成急性胃黏膜損傷，造模前大鼠需禁食24小時，自由飲水。灌胃吲哚美辛5小時后，各大鼠安樂處死，取出全胃，沿胃大彎剪開胃壁，洗凈胃內容物，展開胃組織置于兩塊玻璃板之間固定以供拍照。用imagej圖形分析軟件(1.47v，nationalinstitutesofhealth，usa)測算潰瘍面積，并計算抑制率。抑制率(％)＝(模型組潰瘍面積－給藥組潰瘍面積)/模型組潰瘍面積×100％。于相同部位取0.5cm×0.5cm胃組織，固定于4％多聚甲醛溶液，常規制片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡(olympusbx53熒光顯微鏡)下觀察并拍照，由三位病理醫師采用獨立評分。
參照文獻進行胃黏膜炎癥及損傷程度的組織學病理評分并計算總分；其中，評分標準如表1所示。
各數據以均數±標準差(mean±sd)表示，應用graphpadprism7軟件制圖，spss20.0軟件進行統計學分析，各組間差異比較，采用單因素方差分析(one-wayanova)，方差齊時，組間兩兩多重比較采用lsd法；方差不齊時，組間兩兩多重比較采用dunnett’st3法，以p<0.05為標準，表示有顯著性差異。正常組與模型組的比較，采用獨立樣本t檢驗(student'sttest)。與正常組相比：#：p<0.05，##：p<0.01；與模型組相比：*：p<0.05，**：p<0.01。
圖6示出了吲哚美辛誘導大鼠胃潰瘍面積和抑制率的影響；圖7示出了β-廣藿香烯對吲哚美辛誘導大鼠急性胃黏膜損傷的病理學評分。
從本試驗例的結果以及圖6、圖7可知：
在正常組中幾乎沒有觀察到肉眼可見的損傷。與正常組相比，灌胃吲哚美辛可顯著增加潰瘍面積，表明吲哚美辛誘導的胃潰瘍模型成功建立。在蘭索拉唑的作用下，潰瘍面積顯著減少，平均為6.39±0.91mm2，抑制率為84.29％。用不同劑量的β-廣藿香烯(10、20、40mg/kg)給藥后，潰瘍面積顯著降低，呈現劑量依賴性關系。此外，劑量為40mg/kg的β-廣藿香烯組潰瘍面積為8.03±0.86mm2，抑制率為80.24％。劑量為20和10mg/kg的β-廣藿香烯組中，潰瘍面積分別為10.13±0.86(抑制為75.09％)和18.74±0.71mm2(抑制率為53.85％)。
組織學觀察顯示，大鼠正常胃黏膜結構完整，黏膜表面胃小凹清晰可見，黏膜內腺體排列緊密規則，上皮未見脫落，腺體未見損傷，固有層未見出血及炎細胞浸潤；模型組胃粘膜損傷較深且面積較大，胃小凹結構破壞，出現水腫及炎性浸潤，大量上皮細胞變性，脫落、糜爛，腺體結構紊亂，有的缺失，固有層見中度出血(總評分為9.50±0.72)；蘭索拉唑組胃黏膜完整，上皮未見脫落，腺體未見損傷，固有層未見出血及炎細胞浸潤(總評分為5.56±0.58)；β-廣藿香烯給藥組對上述病理損傷具有改善作用，其中β-廣藿香烯高劑量組(40mg/kg)作用較明顯，胃黏膜保持完整，上皮未見脫落，腺體未見損傷，固有層少見出血及炎細胞浸潤(總評分為5.56±0.81)，其他劑量均有不同程度的保護作用，中劑量組和低劑量組的總評分分別為6.28±077和6.72±0.83。
試驗例4
本試驗例研究實施例4-實施例8提供的藥物組合對急性胃潰瘍模型大鼠的治療效果。
將實施例4-8提供的藥物組合物對急性胃潰瘍模型大鼠給藥后進行觀察，發現能夠治愈急性胃潰瘍模型大鼠。
以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。