一種表達豬溶菌酶基因的乳酸克魯維酵母及表達方法與流程

本發明涉及一種表達豬溶菌酶基因的乳酸克魯維酵母及表達方法。
背景技術：
：溶菌酶(lysozyme)又稱n-乙酰胞壁質聚糖水解酶，專一的破壞細菌細胞壁中肽聚糖的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，從而使細胞壁破裂而溶解細菌。溶菌酶是一種蛋白質類的抗菌酶，它不同于抗生素，在殺死致病菌的同時不易產生耐藥性，因此正逐步發展成為新型的抗生素替代品。乳酸克魯維酵母是一種優秀的畜禽用益生菌，可分泌多種消化酶類，促進動物腸道健康，同時乳酸克魯維酵母營養要求極其簡單、生長旺盛、生物量大、生長溫度適應范圍廣、分泌蛋白能力強,不產生內毒素，是一種安全級的微生物。同時超強的分泌能力使得乳酸克魯維酵母已成功地應用于多種蛋白的表達，相比其它酵母，乳酸克魯維酵母擁有諸多優點，如良好的大規模發酵特性、超強的整合表達能力等,其做為表達系統已顯示出巨大的潛力。技術實現要素：本發明其目的就在于提供一種表達豬溶菌酶基因的乳酸克魯維酵母及表達方法，具有工藝簡單、易操作的特點。為實現上述目的而采取的技術方案是，一種表達豬溶菌酶基因的乳酸克魯維酵母，所述乳酸克魯維酵母為gg779。一種表達豬溶菌酶基因的乳酸克魯維酵母的表達方法，包括以下步驟：（1）以乳酸克魯維酵母密碼子偏好性優化并合成豬溶菌酶基因，基因兩端同時引入ncoi與ecori兩個限制性內切酶位點；（2）使用ncoi與ecori同時對該基因與乳酸克魯維酵母質粒pklac2進行雙酶切；（3）回收酶切產物，4℃連接過夜，轉化到大腸桿菌jm109感受態細胞中；（4）pcr擴增鑒定疑似陽性轉化子并測序，同時提取疑似陽性轉化子的質粒進行雙酶切鑒定，得到正確的重組質粒；（5）提取重組質粒lys-pklac2并使用sacii酶切線性化，線性化的重組質粒轉化乳酸克魯維酵母gg779,經pcr擴增鑒定，獲得重組乳酸克魯維酵母lys-pklac2-gg779。有益效果與現有技術相比本發明具有以下優點。本發明與現有技術相比具有工藝簡單、易操作的特點。附圖說明以下結合附圖對本發明作進一步詳述。圖1為豬溶菌酶基因與pklac2質粒連接的陽性克隆子電泳圖（引物lys-f和lys-r，產物約420bp）；圖2為乳酸克魯維酵母gg779表達lys蛋白的westernbolt圖（蛋白大小在15kd左右）；圖3為pklac2質粒圖譜；圖4為pklac2質粒的多克隆位點圖譜。具體實施方式一種表達豬溶菌酶基因的乳酸克魯維酵母，所述乳酸克魯維酵母為gg779。包含權利要求1所述豬溶菌酶基基因的質粒，所述質粒為乳酸克魯維酵母質粒pklac2。所述豬溶菌酶基因是按乳酸克魯維酵母密碼子偏好性優化并合成的。一種表達豬溶菌酶基因的乳酸克魯維酵母的表達方法，如圖1-4所示，包括以下步驟：（1）以乳酸克魯維酵母密碼子偏好性優化并合成豬溶菌酶基因，基因兩端同時引入ncoi與ecori兩個限制性內切酶位點；（2）使用ncoi與ecori同時對該基因與乳酸克魯維酵母質粒pklac2進行雙酶切；（3）回收酶切產物，4℃連接過夜，轉化到大腸桿菌jm109感受態細胞中；（4）pcr擴增鑒定疑似陽性轉化子并測序，同時提取疑似陽性轉化子的質粒進行雙酶切鑒定，得到正確的重組質粒；（5）提取重組質粒lys-pklac2并使用sacii酶切線性化，線性化的重組質粒轉化乳酸克魯維酵母gg779,經pcr擴增鑒定，獲得重組乳酸克魯維酵母lys-pklac2-gg779。實施例1豬溶菌酶基因合成ncbi上發表的豬源溶菌酶序列（accession：p12069），去掉上游18氨基酸信號肽即為所需表達的成熟肽序列（序列表中序列1），在序列上游添加6個組氨酸的核苷酸序列，以便于后期純化重組蛋白，通過乳酸克魯維酵母的密碼子偏好性表進行密碼子優化，并在其上下游分別設計ncoi與ecori兩個限制性內切酶位點及其保護性堿基，對優化好的序列進行人工合成。序列如序列表中序列2所示。序列1kvydrcefarilkksgmdgyrgvslanwvclakwesnfntkatnynpgsqstdygifqinsrywcndgktpkavnachisckvlldddlsqdiecakrvvrdpqgikawvawkahcqnkdvsqyirgckl序列2catgccatggcatcatcatcatcatcataaggtttacgatagatgtgaattcgctagaattttgaagaagtctggtatggatggttacagaggtgtttctttggctaactgggtttgtttggctaaatgggaatctaatttcaacactaaagctactaactacaacccaggttctcaatctactgattacggtatttttcaaatcaactctagatactggtgtaacgatggtaaaactccaaaagctgttaatgcttgtcatatttcttgtaaggttttgttggatgatgatttgtctcaagatattgaatgtgctaaaagagttgttagagatccacaaggtattaaggcttgggttgcttggaaagctcattgtcaaaacaaggatgtttctcaatacattagaggttgtaaattggaattcgc實施例2重組質粒lys-pklac2的構建1、lys基因和pklac2質粒的雙酶切反應用ncoi與ecori分別對豬溶菌酶基因和pklac2質粒雙酶切，酶切反應體系為：ncoi2ul，ecori2ul，豬溶菌酶基因/pklac2質粒40ul，bsa1ul，10×hbuffer5ul，共50ul，于37℃溫箱反應3h。2、lys基因和pklac2質粒的連接反應酶切反應結束后，加入10ul的6×loadingbuffer，使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分別跑膠，分別回收豬溶菌酶基因和pklac2質粒的酶切片段進行連接反應，連接體系為：基因7ul，質粒10ul，t4dna連接酶1ul，10×buffer2ul，總體積20ul，4℃連接反應過夜。3、連接產物轉化jm109大腸桿菌感受態細胞3.1取出-80℃凍存的大腸桿菌jm109感受態細胞（100ul裝），握于手心中15sec快速融化后置于冰上；3.2吸取10ul連接產物輕輕加至大腸桿菌jm109感受態細胞底部，冰浴30min；3.342℃水浴熱擊90sec，迅速放置冰上1-2min；3.4加入lb液體培養基900ul，置于37℃搖床培養120rpm緩慢復蘇40min；3.5復蘇的轉化產物涂于含氨芐西林100ug/ml的lb固體平板上，37℃培養18h。4、轉化子菌落pcr鑒定使用lys-f和lys-r引物對轉化子進行菌落pcr擴增鑒定,引物序列為：lys-f：ccatggcatcatcatcatcatcataag；lys-r：gaattccaatttacaacctctaatgtapcr體系如下：lys-f5ul，lys-r5ul，dntp5ul，10×buffer5ul，transt-taq酶1ul，轉化子菌液1ul，ddh2o28ul，總體積50ulpcr擴增程序為：預變性，95℃，5min；變性，95℃，30sec；退火，55℃，30sec；延伸，72℃，1min；總延伸，72℃，5min。其中，變性，退火，延伸，30cycle。擴增完成后加入10ul6×loadingbuffer，0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，疑似陽性轉化子有420bp的目的條帶；將疑似陽性轉化子的pcr原液送北京奧科生物工程有限公司測序，測序結果與目的基因序列比對一致。實施例3重組乳酸克魯維酵母lys-pklac2-gg779的構建1、重組質粒lys-pklac2轉化乳酸克魯維酵母gg779使用sacii對重組質粒lys-pklac2進行酶切線性化，酶切反應體系為：sacii2ul，lys-pklac2重組質粒34ul，10×hbuffer4ul，共40ul。于37℃溫箱反應3h，酶切完成后，回收線性化質粒，轉化乳酸克魯維酵母gg779感受態細胞，乳酸克魯維酵母gg779感受態細胞過程及轉化步驟如下：1.1于ypd平板上劃線分離乳酸克魯維酵母gg799，30℃培養48-64h；1.2挑取乳酸克魯維酵母gg799單菌落接種于50mlypd液體培養基，250rpm30℃過夜培養種子液；1.3取50ul過夜培養的種子液，接種于100mlypd液體培養基，250rpm，30℃培養至od600=0.8-1.0；1.44℃4000rpm離心5min，收集菌體，用預冷的無菌水25ml緩慢重懸；1.54℃4000rpm離心5min，收集菌體，加1ml100mm的氯化鋰，轉入1.5mlep管中，12000rpm離心30sec；1.6用400ul100mm氯化鋰緩慢重懸菌體，50ul/管分裝；1.7取一管新鮮制備的感受態細胞，依次加入50%peg3350240ul、1m氯化鋰36ul、2mg/ml單鏈鮭魚精dna25ul、10ug/50ul線性化質粒，劇烈渦旋；1.830℃培養30min，再于42℃培養20min；1.94℃4000rpm收集菌體，用1mlypd液體培養基緩慢重懸菌體，30℃120rpm4h；1.104℃4000rpm收集菌體，用1ml無菌水緩慢重懸，涂布于添加5mm乙酰胺的ycb平板，30℃靜置3-5天。2、pcr擴增鑒定轉化子使用酵母基因組提取試劑盒提取疑似陽性轉化子的基因組，以該基因組為模板進行pcr擴增鑒定，pcr反應體系和擴增體系與jm109轉化子鑒定相同，從而獲得重組乳酸克魯維酵母lys-pklac2-gg779。實施例4重組乳酸克魯維酵母lys-pklac2-gg779的表達于ypd平板上劃線分離重組乳酸克魯維酵母lys-pklac2-gg779，30℃培養48-64h，挑取乳酸克魯維酵母gg799單菌落接種于10mlypd液體培養基，250rpm30℃過夜培養種子液，取5ml過夜培養的種子液，接種于500mlypg液體培養基（1%酵母提取物；2%蛋白胨；2%半乳糖），250rpm，30℃培養48h，5000rpm離心10min，所得上清液即為溶菌酶酶液。實施例5重組豬溶菌酶的純化1、飽和硫酸銨沉淀培養基上清中的豬溶菌酶培養完成的菌液最大轉速離心30min，棄菌體沉淀，將等體積的飽和硫酸銨溶液（4.1mol/l，25℃）邊攪拌邊慢慢加入，加完放磁力攪拌器上4℃攪拌過夜，使蛋白充分沉淀。10000rpm4℃離心30min，棄上清保留沉淀，將沉淀溶于少量（10-20ml）pbs-0.2g/l疊氮鈉中，使沉淀溶解，再使用透析袋4℃透析48h，每隔6小時更換透析緩沖液，以徹底去除硫酸銨。2、豬溶菌酶蛋白鎳柱純化相關試劑如下：母液1：29.22g氯化鈉，2.42gtris-base，ddh2o定溶至1l，調節ph=8.0。母液2：6.06gtris-base，ddh2o定溶至1l，調節ph=8.0。bindingbuffer：0.1702g咪唑，溶于500ml母液1。elutionbuffer：17.02g咪唑，溶于500ml母液1。washingbuffer:2.3828g咪唑，溶于500ml母液2。先用bindingbuffer平衡鎳離子親和層析柱，然后將待純化的樣品上樣于鎳柱，結合30min左右，收集留出液flowthrough，用washingbuffer洗3個柱體積，收集washthrongh，最后用elutionbuffer洗脫蛋白，收集eluent.將bindingbuffer，washthrongh，eluent。將鎳柱收集的蛋白用milipore壓力超濾濃縮裝置通過30kda超濾膜截留濃縮至10ml左右，將樣品通過gelfiltrationbuffer平衡過的superdex200分子篩進行分離。實施例6豬溶菌酶的sds-page驗證1、相關試劑的配制1.1、tris-hcl緩沖液(1mol/l,ph8.8)、tris-hcl緩沖液(0.5mol/l,ph6.8)購于北京諾博萊德科技有限公司1.2、sds-page分離膠（15%）成分體積（ml）ddh2o4.630%丙烯酰胺101.5mtris-hcl（ph=8.8）510%sds0.210%過硫酸銨0.2temed0.008總體積20成分體積（ml）ddh2o4.130%丙烯酰胺1.01.0mtris-hcl（ph=6.8）0.7510%sds0.0610%過硫酸銨0.06temed0.006總體積61.3sds-page濃縮1.4、sds-page電泳緩沖液（tris-glycine）：9.4g甘氨酸、1.51gtris-base、0.5gsds，ddh2o定容至500ml；1.5、考馬斯亮藍染色液：稱取1.0g考馬斯亮藍r-250，加入50ml冰醋酸、25ml無水乙醇和425mlddh2o，攪拌溶解后過濾；1.6、考馬斯亮藍脫色液：50ml冰醋酸、25ml無水乙醇，用ddh2o定容至500ml；1.51×tris-glycine電泳緩沖液（0.5l）：1.51gtris粉末、9.4g甘氨酸、0.5gsds、ddh2o定容至0.5l；2、純化豬溶菌酶的sds-page驗證將純化的豬溶菌酶中添加sds-pageloadingbuffer，沸水浴15min，以蛋白質標準分子量為參考，在分離膠為15%的sds-page蛋白膠上電泳；按以下步驟操作：2.1、清洗bio-rad玻璃板，干燥后安裝，按上配方配制分離膠，1mm膠板中加入2ml分離膠液體，至梳齒下1.5cm，覆蓋少量ddh2o，待凝固后倒掉覆蓋的ddh2o，用濾紙吸凈殘留的ddh2o；2.2、同樣的方法按上配方配制濃縮膠，灌制于分離膠之上，立即插入1mm膠梳，室溫下凝固；2.3、待濃縮膠制備完成，拔下膠梳，立即將膠板固定于電泳裝置上，電泳槽內加入電泳緩沖液，排盡凝膠底部玻璃板間的氣泡；2.4、每孔加樣20μl,接通電源，設定電壓80v/cm，待染料進入濃縮膠后，調節電壓至120v/cm，至溴酚蘭染料距膠底部2cm處停止電泳；2.5、取下凝膠，考馬斯亮藍染色液中染色過夜；2.6、過夜染色完成后，使用考馬斯亮藍脫色液進行脫色，每30分鐘換脫色液，直到看到清晰的條帶為止，結果如圖2所示。實施例7重組豬溶菌酶酶活的測定磷酸鹽緩沖液：磷酸二氫鈉10.4g，磷酸氫二鈉7.86g，乙二胺四乙酸二鈉0.37g，加ddh2o定容至1000ml，ph6.2底物懸浮液的制備：稱取溶酶小球菌20mg，加磷酸鹽緩沖液1ml,于研缽內研磨3分鐘，再加磷酸鹽緩沖液，使總體積約為50ml，使懸浮液于25℃時，在450nm的波長處測得的吸收度為0.70±0.05。精密量取25℃的底物懸浮液3ml，置1cm比色池中，在450nm的波長處測定吸收度，作為零秒的讀數a<[0]>，然后精密量取25℃的純化的重組溶菌酶0.15ml,加到上述比色池中，迅速混勻，用秒表計時,至60秒時再測定吸收度a；同時精密量取磷酸鹽緩沖液0.15ml，同法操作，做為空白試驗，測得零秒的讀數a'<[0]>及60秒的讀數a'。在室溫25℃、ph值6.2時，在波長450nm處，每分鐘引起吸收度下降0.001為一個酶活力單位。按下式計算：（a<[0]>－a）－（a'<[0]>－a'）效價單位數(u/ml)＝───────────────10<6>v式中v為所測純化重組溶菌酶的體積（ml）經測定，1l乳酸克魯維酵母培養基表達上清，經純化后獲得20ml重組溶菌酶，其活性為500u/ml。當前第1頁12