一種基因敲除選育纖維素酶高產菌株的方法
【專利摘要】本發明公開了一種基因敲除選育纖維素酶高產菌株的方法，屬于酶工程領域。本發明基因敲除選育纖維素酶高產菌株的方法為敲除纖維素酶生產菌株的淀粉酶基因。其中，一種纖維素酶高產菌株為敲除淀粉酶基因的黑曲霉，通過將重組片段淀粉酶基因的前半部分-潮霉素B抗性基因表達單元-淀粉酶基因的后半部分連接到pCAMBIA1300質粒上得到淀粉酶基因敲除質粒，再將該質粒轉化農桿菌，通過農桿介導轉化黑曲霉敲除淀粉酶基因。本發明利用基因敲除技術，敲掉黑曲霉的淀粉酶基因，敲出淀粉酶基因后，細胞負荷減少，從而有利于產生大量的纖維素酶，得到的纖維素酶高產菌株纖維素酶活性達到21U/g。
【專利說明】一種基因敲除選育纖維素酶高產菌株的方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬于酶工程領域，具體涉及一種基因敲除選育纖維素酶高產菌株的方法。【背景技術】
[0003]纖維素是地球上最豐富的可再生資源，地球上每年因光合作用產生的纖維素達到100億噸左右，利用纖維素生產生物能源，是緩解能源危機，實現人類可持續發展的關鍵。
[0004]纖維素利用的關鍵是把纖維素降解為可發酵性的糖類-葡萄糖。纖維素的降解需要外切酶、內切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中內切酶降解長片段的纖維素成為二聚體，是纖維素降解的關鍵步驟。用纖維素酶降解纖維素具有綠色，條件溫和，轉化率高的特點，但是纖維素酶較高的生產成本成為纖維素酶降解纖維素的瓶頸。
[0005]獲得高產纖維素酶的菌株，降低纖維素酶的生產成本成為纖維素酶工業化利用的必由之路。纖維素酶的生產菌株主要有黑曲霉和里氏木霉。黑曲霉由于其較高的安全性，被認為是生產纖維素酶最有應用前景的菌株之一，但是纖維素酶的酶活相對于工業化應用的需求而言優勢較低，構建高產纖維素酶的菌株，成為黑曲霉產生的纖維素酶工業化利用的途徑之一。構建纖維素酶高產菌株有用物理誘變、化學誘變、基因工程構建基因工程菌株等。用物理誘變和化學誘變的方法具有快捷有效的有點，但是誘變是一個隨機的過程，缺乏方向性。基因工程構建菌株就有可操控的方向性，已經成為構建高產菌株的主要手段。基因敲除，能打破已有的代謝網絡，代謝網絡的改變，有利于獲得更高產量的菌株。
[0006]黑曲霉在生產纖維素酶的同時，還會產生大量的其它酶類，這些酶類的翻譯和分泌對大量生產纖維素酶不利。因為這些酶類的翻譯和分泌一方面要消耗大量的營養物質，另外一方面其合成和分泌消耗細胞的大量能源，加重了細胞負荷。
【發明內容】
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[0007]本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種基因敲除選育纖維素酶高產菌株的方法。本發明的目的還在于提供一種纖維素酶高產菌株。
[0008]本發明的目的通過下述技術方案實現:
一種基因敲除選育纖維素酶高產菌株的方法，為敲除纖維素酶生產菌株的淀粉酶基因。
[0009]所述的纖維素酶生產菌株優選為黑曲霉和里氏木霉。
[0010]一種纖維素酶高產菌株，為敲除淀粉酶基因的黑曲霉。
[0011]優選的，所述的敲除淀粉酶基因的黑曲霉通過包含如下步驟的方法制備得到:
(1)合成淀粉酶基因的前半部分-潮霉素B抗性基因表達單元-淀粉酶基因的后半部分的重組片段；將該重組片段連接到PCAMBIA1300質粒上得到淀粉酶基因敲除質粒；
(2)用淀粉酶基因敲除質粒轉化農桿菌；(3)將含有淀粉酶基因敲除質粒的農桿菌和黑曲霉混合培養，通過潮霉素B抗性篩選得到敲除淀粉酶基因的黑曲霉。
[0012]更優選的，步驟(1)為:合成如SEQ ID N0.1所示的重組片段(淀粉酶基因的前半部分-潮霉素B抗性基因表達單元-淀粉酶基因的后半部分)，用NcoI酶切JfpCAMBIA1300質粒用NcoI酶切；將酶切后的重組片段和質粒通過DNA連接酶連接，并轉化DH5 α得到淀粉酶基因敲除質粒pCAMBIA1300-gh。
[0013]本發明相對于現有技術具有如下優點和效果:
本發明利用基因敲除技術，敲掉黑曲霉的淀粉酶基因，敲出淀粉酶基因后，細胞負荷減少，從而有利于產生大量的纖維素酶。
[0014]本發明通過基因工程的基因敲除技術得到纖維素酶活性達到21 U/g的高產菌株，酶活提高了近2倍。
【具體實施方式】
[0015]下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0016]實施例1
A、淀粉酶基因敲除質粒的構建
(I)重組片段的合成
重組片段由淀粉酶基因的前半部分(SEQ ID N0.2)，潮霉素B抗性基因表達單元(SEQID N0.3)，淀粉酶基因的后半部分(SEQ ID N0.4)組成，合成的重組片段(SEQ ID N0.1)用NcoI 酶液 2 μ L (TakaRa 購買)，30 °C酶切 16 h。
[0017](2) PCAMBIA1300 提取及酶`切
含有PCAMBIA1300質粒的大腸桿菌E.coli DH5 α于37 1:振蕩培養12 h。取1.5 mL菌體于EP管，以4000 rpm離心3 min,棄上清液。加0.1 mL溶液1( 1%葡萄糖,50 mM EDTApH 8.0,25 mM Tris-HCl pH 8.0)充分混合。加入 0.2 mL 溶液 11(0.2 mM NaOH, 1% SDS),輕輕翻轉混勻，置于冰浴5 min。加入0.15 mL預冷溶液III (5 mo I/L KAc, pH4.8)，輕輕翻轉混勻，冰浴5 min。以10000 rpm離心20 min，取上清液于另一新EP管。加入等體積的異戊醇，混勻后靜置10 min。再以10000 rpm離心20 min，棄上清。用70%乙醇0.5 mL洗滌一次，抽干所有液體。待沉淀干燥后，溶于0.05 mL TE緩沖液中。
[0018]提取的pCAMBIA1300 質粒 50 μ L 加入 NcoI 酶液 2 μ L (TakaRa 購買)，30 °〇酶切16 h，酶切后65 °C水浴10 min。
[0019](3)連接
酶切的合成片段100 μ L和酶切的質粒20 μ L用5 μ L Τ4 DNA ligase (TakaRa購買)16 °C連接24 h。
[0020]B、感受態細胞制備
(I)將E.coli DH5a置于LB培養基上，在37 °C下過夜培養。
[0021](2)高溫滅菌大的離心瓶(250_500mL)以備第二天搖瓶用。
[0022](3)準備幾瓶滅菌水(總量約1.5升)，保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細胞用。
[0023](4)轉移0.2-1 mL過夜培養物至裝有20 mL LB (或其他營養豐富的培養基)的100 mL搖瓶。[0024](5)37 °〇下劇烈振蕩培養6小時。
[0025](6)監控0.D.600值(培養I小時后每半小時測定一次)。
[0026](7)當0.D.600值達到0.5-1.0時，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻15分鐘。
[0027](8)細胞在4 V 5000g下離心15分鐘，棄上清液。
[0028](9)用滅菌的冰水重懸浮細胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞于少量體積中(幾毫升)，然后加水稀釋至離心管的2/3體積。
[0029]( 10)照上面步驟重復離心，小心棄去上清液。
[0030]( 11)照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細胞。
[0031](12)離心，棄上清液。
[0032](13)用20 mL滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細胞。
[0033](14)照上面步驟離心，小心棄去上清液(沉淀可能會很松散)。
[0034](15)用10%甘油重懸浮細胞至最終體積為2-3 mL。
[0035](16)將細胞按150 μ L等份裝入微量離心管，于-80 °C保存。
[0036]C、轉化大腸桿菌
(I)在冰上解凍B步驟制得的感受態細胞。
[0037](2)每100 UL感受態細胞添加10 μ L連接的質粒，冰上培育約5分鐘。
`[0038](3)轉移DNA/細胞混合物至冷卻后的2 mm電穿孔容器中。
[0039](4)加載電轉化儀，準備好300 yL LB培養基。
[0040](5)對電穿孔容器進行脈沖(200歐姆，25 μ Fd, 2.5千伏)(檢查時間常數，應該在3以上)。
[0041](6)立即添加300 μ L的LB至電穿孔容器中。
[0042](7)37 °C下培養細胞40分鐘至I小時以復原。
[0043](8)轉移細胞至含有卡那霉素(100 Pg/mL)選擇培養基上培養。長出為含有質粒pCAMBIA1300-gh 的轉化子。
[0044]D、淀粉酶基因敲除質粒的提取
C步驟得到的轉化子37 1:振蕩培養12 h。取1.5 mL菌體于EP管，以4000 rpm離心3 min，棄上清液。加 0.1 mL 溶液 I (1% 葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0,25 mM Tris-HCl pH
8.0)充分混合。加入0.2 mL溶液II (0.2 mM NaOH, 1% SDS)，輕輕翻轉混勻，置于冰浴5min。加入0.15 mL預冷溶液III (5 mol/L KAc, pH4.8),輕輕翻轉混勻,冰浴5 min。以10000 rpm離心20 min，取上清液于另一新EP管。加入等體積的異戊醇，混勻后靜置10min。再以10000 rpm離心20 min,棄上清。用70%乙醇0.5 mL洗漆一次,抽干所有液體。待沉淀干燥后，溶于0.05 mL TE緩沖液中。
[0045]E、轉化農桿菌
農桿菌感受態的制備:液體保存的農桿菌涂布于LB培養基上，28 °C培養，等到單菌落長出后，挑取單菌落，接種于5 mL的液體培養基，28 0C >150 r/m培養24 h，按照1:10的接種比例接種于5 mL新鮮的液體培養基中，28 0C >150 r/m培養24 h。培養的菌體冰浴40min, 5000 r/m 離心 5 min,用 10 mL 的 0.02 mol/L CaCl2 菌體重懸菌體。再次 5000 r/m 離心5 min,菌體懸浮于I mL的0.02 mol/L CaCl2溶液,放置于冰上保藏。
[0046]取提取的質粒pCAMBIA1300_gh I μ L與40 μ L的農桿菌感受態懸液混合，輕輕搖動混合5 min后，在液氮上迅速冰凍5 min，37 °C水浴5 min。加入1 mL液體LB培養 基，28 1：輕輕震蕩4 h。菌體5000 r/m離心5 min，棄去上清液，加入LB培養基50 yL，震 蕩重新懸浮液體。液體涂布于含有100呢/mL卡那霉素的LB平板上，長出的菌落接種于含 有100 Pg/mL卡那霉素的LB液體培養基中28 °C、150 r/m培養24 h。
[0047]F、農桿介導轉化黑曲霉敲除淀粉酶基因
黑曲霉（從ATCC購買，菌株編號ATCC10582，Aspergillus niger)接種于PDA培養基 斜面上，37 °C培養72 h，用滅菌的蒸餾水沖洗下孢子，孢子用蒸餾水稀釋到108個孢子/ mL。孢子與等體積的含有質粒pCAMBIA1300-gh的農桿菌混合均勻，加入乙酰丁香酮至200 umol/L,30 1：避光培養24 h。然后把孢子涂布在平板上（200 g 土豆用1 L自來水煮沸 30min，紗布過濾，濾液中加入20 g葡萄糖、20 g可溶性淀粉、20 g瓊脂、200 y mol頭孢噻 肟、200 mg潮霉素B)，30 °C培養到長出菌落。菌落周圍無透明圈的為基因敲除的菌株，篩 選得到不產淀粉酶的菌株，酶活達到21.0 U/g。出發菌株在相同條件下的酶活為10.7 U/ g°
[0048]纖維素酶酶活測定：以濾紙為底物，在50 °C進行酶降解反應。在25 mL試管中加 A 10 mL pH 5. 0的0. 05 M朽1檬酸緩沖液，加入濾紙條2 g( 1 cmX5 cm),加入發酵液離心 后上清液2 mL，在水浴鍋中50 °C保溫30 min，然后用沸水煮沸5 min。用DNS法測定還原 糖的含量。酶活定義為：每分鐘釋放出1 Mmol還原糖所需要的酶量。
[0049]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種基因敲除選育纖維素酶高產菌株的方法，其特征在于:敲除纖維素酶生產菌株的淀粉酶基因。
2.根據權利要求1所述的基因敲除選育纖維素酶高產菌株的方法，其特征在于:所述的纖維素酶生產菌株為黑曲霉和里氏木霉。
3.—種纖維素酶高產菌株，其特征在于:為敲除淀粉酶基因的黑曲霉。
4.權利要求3所述的纖維素酶高產菌株的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)合成淀粉酶基因的前半部分-潮霉素B抗性基因表達單元-淀粉酶基因的后半部分的重組片段；將該重組片段連接到PCAMBIA1300質粒上得到淀粉酶基因敲除質粒； (2)用淀粉酶基因敲除質粒轉化農桿菌； (3)將含有淀粉酶基因敲除質粒的農桿菌和黑曲霉混合培養，通過潮霉素B抗性篩選得到敲除淀粉酶基因的黑曲霉。
5.根據權利要求4所述的纖維素酶高產菌株的制備方法，其特征在于步驟(1)為:合成如SEQ ID N0.1所示的重組片段，用NcoI酶切；將pCAMBIA1300質粒用NcoI酶切；將酶切后的重組片段和質粒通過DNA連接酶連接，并轉化DH5 α得到淀粉酶基因敲除質粒pCAMBIA1300-gh。
【文檔編號】C12N9/26GK103865949SQ201410084774
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月10日 優先權日:2014年3月10日
【發明者】薛棟升 申請人:湖北工業大學