本發明屬于微生物發酵工程領域，具體涉及一種γ-聚谷氨酸產生菌和一種使用同步糖化、過濾與發酵工藝。
背景技術：
：γ-聚谷氨酸(英文名稱γ-polyglutamicacid，簡稱γ-pga)是由l-谷氨酸或d-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基間的酰胺鍵結合而成，具有吸水性、水溶性、帶負電荷、無毒、可生物降解、可食用等性質，是一種優良的環保型高分子材料，因此γ-聚谷氨酸及其衍生物已被廣泛應用于藥物載體、水處理絮凝劑、農業保水保肥劑、食品化妝品添加劑等多個領域。傳統工藝中，γ-聚谷氨酸主要是通過微生物發酵方法制備，葡萄糖、甘油和檸檬酸是發酵生產γ-聚谷氨酸的主要碳源，但是這些碳源營養物質均來源于人類食物，如糧食、土豆、甘蔗等，這樣不僅導致γ-聚谷氨酸的成本較高，而且大規模的生產還會加劇人類食物的短缺。因此，伴隨著γ-聚谷氨酸需求量快速增長，尋求可替代的經濟型碳源材料進行γ-聚谷氨酸的生產具有重要意義。木質纖維素是自然界最為豐富的碳水化合物資源，目前其已成功應用于生產多種生物能源和高附加值化學產品，如生物乙醇、乳酸、丁二醇、谷氨酸等。近年來，以木質纖維素為原材料發酵生產γ-聚谷氨酸的研究已被陸續報道。如英文雜志《journalofchemicaltechnologyandbiotechnology》(2013，89(4):616–622)公開了一篇名稱為“anovelapproachforpoly-γ-glutamicacidproductionusingxyloseandcorncobfibreshydrolysateinbacillussubtillishb-1”的期刊論文，該論文指出以玉米芯水解液為主要碳源，使用枯草芽孢桿菌hb-1進行γ-聚谷氨酸發酵；英文雜志《bioresourcetechnology》(2015，193(2015):370–376)公開了一篇名稱為“highlyefficientricestrawutilizationforpoly-(c-glutamicacid)productionbybacillussubtilisnx-2”的期刊論文，該論文公開的技術是通過兩步水解法將稻草水解，水解液經濃縮脫毒后使用枯草芽孢桿菌nx-2進行γ-聚谷氨酸發酵。但是，這些現有技術均是通過分段水解與發酵相結合的方式進行γ-聚谷氨酸的生產制備，不僅工藝復雜，而且能耗大，另外，這些現有技術均是批次發酵，即每一次發酵都需要重新培養一級甚至多級種子，亦即上一次發酵的細菌不會再循環利用，這樣發酵方式不僅生產周期長，而且發酵過程中原料和設備的投入也會相應地增加。由此可見，目前以木質纖維素為主要原料發酵生產γ-聚谷氨酸的方法還不適合γ-聚谷氨酸的大規模工業化生產。ishola等人于2013年提出將同步糖化、過濾與發酵法(簡稱ssff)應用于發酵生產乙醇的工藝中，整個工藝在兩個反應器中進行，即將預處理的木質纖維素材料在水解反應器中進行酶水解，經過膜過濾，含糖的濾出液持續泵入發酵罐中進行微生物發酵。與傳統的分步糖化發酵法(簡稱shf)相比，ssff法不僅工藝簡單，產物的生產效率高，而且采用ssff法時細胞與固態的纖維素材料處于分離狀態，發酵菌體容易回收，從而可以實現連續批次發酵生產。現有技術中γ-pga發酵多采用游離細胞發酵，而與游離細胞相比，固定化細胞具有方便回收、可重復多次使用、批次生產間隔時間短等優點，因此，申請人認為將ssff法和固定化細胞發酵相結合可以有效的解決現階段使用木質纖維素生產γ-聚谷氨酸所存在的工藝復雜、能耗大、發酵的菌體不能循環利用等問題，對以木質纖維素為原料發酵γ-聚谷氨酸的規模化具有重大意義。技術實現要素：本發明的首要目的是提供一種高產γ-聚谷氨酸的芽孢桿菌(bacillussp.)jx-12，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)的保藏號為cgmccno.13716，保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101，保藏日期為2017年3月16日。本發明所提供的芽孢桿菌(bacillussp.)jx-12，是從大醬樣品中篩選得到的芽孢桿菌。所述菌株jx-12的形態特征為：在lb培養基中營養細胞為0.7～0.9×2.0～3.0μm大小的桿菌，革蘭氏染色為陽性，37℃培養3～5天形成芽孢，芽孢大小0.4～0.6×0.8～1.5μm，為長圓形或圓柱形。菌株jx-12的菌落形態特征為：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基平板培養：30～40℃培養1天可大量生長，菌落表面凸起，光滑無褶皺，菌落透明，邊緣呈規則圓形，菌落粘性大，挑起有絲狀。e型發酵培養基瓊脂平板培養：30～40℃培養1d可大量生長，菌落表面凸起、中心凹陷，表面不光滑有褶皺，菌落白色半透明，邊緣不規則，菌落表面有液滴，菌落粘性大，挑起有拉絲狀。菌株jx-12的生理生化性質如下表1所示：表1.jx-12菌部分生理生化特性表1的“+”表示反應為陽性，“-”表示反應為陰性。分子生物學鑒定：提取菌株全基因組dna，pcr擴增16srdna片段，測序，測序結果在ncbi中進行比對，比對結果顯示該菌株為芽孢桿菌(bacillussp.)。本發明的另一個目的是提供高產γ-聚谷氨酸的菌株在生產γ-聚谷氨酸中的應用，是一種新型的以木質纖維素為主要原料的γ-聚谷氨酸生產方法，能夠同時實現同步糖化水解發酵和連續批次發酵。為實現上述發明目的，本發明所采用的技術方案是：生產γ-聚谷氨酸的步驟如下：1)、種子培養：將菌株jx-12接種于無菌的活化培養基斜面，在30-37℃條件下培養24-48小時活化，將已活化的菌種接種于無菌的種子培養基，在30-37℃、150-250rpm的條件下搖瓶培養24-48小時，即得種子液。所述的活化培養基配方為：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl5g，瓊脂18～20g，ph6.8～7.4，補水至1000ml。所述的種子培養基配方為：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl5g，ph7.0～7.4，補水至1000ml。2)、固定化細胞制備：將種子液離心，棄上清液，用無菌的0.9％生理鹽水沖洗3-4次，用無菌水將菌體懸浮，并稀釋至濃度為105-107cfu/ml，將菌懸液與載體材料混合均勻，交聯固化形成顆粒，用無菌水清洗固化顆粒3-4次，轉移至0.9％的生理鹽水中，于4℃冰箱保存備用。3)、木質纖維素材料預處理：取木質纖維素材料，用自來水清洗，然后粉碎、過40目篩、預處理、脫毒，之后在60-90℃下干燥至恒重，常溫保存備用。所述木質纖維素材料為玉米秸稈、玉米芯、小麥秸稈、水稻秸稈、高粱秸稈、油菜秸稈、甘蔗渣、木屑中的一種或多種混合。所述預處理為稀酸預處理、稀堿預處理、離子液預處理、蒸汽爆破預處理、氨纖維膨爆預處理、生物預處理中的一種，所述脫毒為水洗脫毒、過堿化處理、活性炭吸附、生物脫毒中的一種。4)、同步糖化、過濾與發酵：第一、預水解：將預處理的木質纖維素材料加入水解反應器中，用蒸餾水稀釋至固體含量5％-12％，加入纖維素酶10-35fpu/(g底物)，加入消泡劑，在50-55℃下攪拌100-200rpm，通過2m的naoh和2m的hcl維持水解反應體系ph為4.5-5.5，在與發酵罐整合同步發酵前預水解24-48h。第二、發酵罐滅菌：發酵罐中加入不含主要碳源的發酵培養基，所述培養基的配方為：檸檬酸5g，谷氨酸20g，硫酸銨10g，k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，fecl3·6h2o0.02g，mnso4·h2o0.1g，cacl20.2g，補水至1000ml；加入消泡劑，使用蒸汽將發酵罐及培養基121℃滅菌20-40min，冷卻待用。第三、同步糖化、過濾與發酵：預水解后，將固定化的γ-聚谷氨酸菌株接種到培養基中，進行同步糖化、過濾與發酵。使用蠕動泵將水解反應器中木質纖維素-酶混合物泵入錯流膜過濾裝置中，流速為5-30l/min，滯留物泵回水解反應器，含糖的濾出液以0.5-35ml/min的流速泵入發酵罐，供菌體發酵使用。同時發酵罐中液體以與濾出液相同的流速泵入水解反應器中，維持體系的平衡。發酵罐中攪拌速度為400-600rpm，通氣量為1-1.5vvm，溫度為30-37℃，ph通過自動流加2mnaoh維持在5.5-7.0；發酵72-96h。第四、連續批次發酵：發酵72-96h后，取出發酵罐中的發酵液，將固定化的γ-聚谷氨酸留在發酵罐中，加入已滅菌的不含主要碳源的培養基，水解反應器中補充木質纖維素材料和酶，繼續進行同步糖化、過濾與發酵48-72h，重復該操作，進行連續發酵。優選的：所述的固定化細胞制備過程中采用的載體材料為海藻酸鈉、海藻酸鈣、聚乙烯醇、卡拉膠、聚氨酯泡沫、活性炭、陶瓷顆粒等的一種或多種。優選的：所述同步糖化、過濾與發酵采用的設備包括水解反應器、錯流膜過濾裝置和通氣攪拌式發酵罐，所述水解反應器和通氣攪拌式發酵罐中設置攪拌組件；所述水解反應器通過第一連接管道與錯流膜過濾裝置的進液口連通，所述錯流膜過濾裝置的出液口通過第二連接管道與通氣攪拌式發酵罐連通，所述通氣攪拌式發酵罐通過第三連接管道與水解反應器連通；所述錯流膜過濾裝置上設置回收管，所述回收管通入水解反應器中；所述連接管道和回收管上均設置蠕動泵。優選的：所述的錯流膜過濾裝置中超濾膜材料為聚砜、聚砜酰胺、聚酰胺、磺化聚砜、聚丙烯腈、聚氯乙烯、偏聚氯乙烯、聚醚砜或聚醚酮或無機陶瓷膜的一種，膜的孔徑為0.22-0.45μm，有效面積0.025-0.25m2。本發明具有以下有益效果：1、生產成本低。本發明采用木質纖維材料為碳源生產γ-聚谷氨酸，顯著降低了γ-聚谷氨酸的生產成本，使農業生產中的秸稈等固態廢棄物得到高效利用，達到了農業的可持續發展。2、工藝簡單，生產效率高。本發明采用同步糖化、過濾和發酵工藝，實現了木質纖維素材料水解和γ-聚谷氨酸發酵同步進行，與現有技術中分步水解與發酵的方法相比，大大簡化了生產工藝。且水解過程中生產的糖及時被菌體消耗，避免了纖維素水解酶的產物抑制，提高了生產效率。同時，本發明將木質素水解反應和γ-聚谷氨酸發酵分別置于不同反應器中，與現有技術相比，水解反應與菌體發酵均是在其最適環境中進行的，進一步提高了生產效率，增加了木質纖維素的利用率。3、能夠連續批次發酵。本發明采用的固定化細胞進行γ-聚谷氨酸發酵，與現有的游離細胞發酵相比，發酵液和菌體更容易分離，實現了菌體的重復利用。在一次發酵完成后，分離出發酵液并重新加入培養基就可進行下一次發酵，節約了不同批次間種子培養的成本，縮短了發酵時間，進一步提高了γ-聚谷氨酸的生產效率。對以木質纖維素為碳源生產γ-聚谷氨酸的工業放大具有重要意義。此外，本發明采用的錯流膜過濾裝置中濾膜孔徑為0.22-0.45μm，具有除菌的效果。這樣不需要在水解反應器中采取無菌操作，就可以使泵入發酵罐的含糖濾出液為無菌液體，進一步簡化了工藝，也減少了能耗。附圖說明圖1為本發明同步糖化、過濾與發酵采用設備的結構示意圖。具體實施方式如圖1所示的同步糖化、過濾與發酵采用的設備，包括水解反應器1、錯流膜過濾裝置2和通氣攪拌式發酵罐3，所述水解反應器1和通氣攪拌式發酵罐3中設置攪拌組件。這里的攪拌組件可以通過多種結構實現其攪拌功能，例如所述攪拌組件是一根由電機驅動的攪拌軸，所述攪拌軸的末端固定有攪拌葉，或者所述攪拌組件包括一個磁力攪拌器和多個攪拌子，所述磁力攪拌器位于水解反應器1和通氣攪拌式發酵罐3的底部，攪拌子位于水解反應器1和通氣攪拌式發酵罐3內部，在磁力作用下完成攪拌。如圖1所示，所述水解反應器1通過第一連接管道與錯流膜過濾裝置2的進液口連通，所述第一連接管道的作用是將水解后的混合物由水解反應器1向錯流膜過濾裝置2輸送。所述錯流膜過濾裝置2的出液口通過第二連接管道與通氣攪拌式發酵罐3連通，所述第二連接管的作用是由錯流膜過濾裝置2向通氣攪拌式發酵罐3輸送含糖濾出液。所述通氣攪拌式發酵罐3通過第三連接管道與水解反應器1連通，所述第三連接管道的作用是由通氣攪拌式發酵罐3向水解反應器1輸送發酵液。所述錯流膜過濾裝置2上設置回收管，所述回收管通入水解反應器1中，回收管的作用是由錯流膜過濾裝置2向水解反應器1輸送未通過過濾裝置的滯留物。所述連接管道和回收管上均設置蠕動泵5，所述蠕動泵5為各個管道的輸送提供動力。進一步的，所述的錯流膜過濾裝置2中超濾膜材料為聚砜、聚砜酰胺、聚酰胺、磺化聚砜、聚丙烯腈、聚氯乙烯、偏聚氯乙烯、聚醚砜或聚醚酮或無機陶瓷膜的一種，膜的孔徑為0.22-0.45μm，有效面積0.025-0.25m2。這樣的膜孔徑具有除菌的效果，可省去在水解反應器中采取無菌操作，使泵入發酵罐的含糖濾出液為無菌液體，進一步簡化了工藝，也減少了能耗。本發明同步糖化、過濾與發酵采用的設備在使用時，先將木質纖維素加入水解反應器1中進行預處理，并向通氣攪拌式發酵罐3中加入不含主要碳源的發酵培養基。將固定化的菌株jx-12接種到培養基中，然后打開各個管道上的蠕動泵5，使水解反應器1中的混合物通過第一連接管道進入錯流膜過濾裝置2中，通過錯流膜過濾裝置2的濾出液經第二連接管道進入通氣攪拌式發酵罐3中，滯留物經回收管回到水解反應器1中。同時，通氣攪拌式發酵罐3中的發酵液通過第三連接管道進入水解反應器1中，形成完整的循環，維持體系平衡。下面具體提供優選的實施例，以使本領域技術人員更加清楚本發明的技術方案和效果，但本發明的實施方式不限于此。實施例一以玉米秸稈為主要原料生產γ-聚谷氨酸：1)、種子培養：將低溫凍存的解淀粉芽孢桿菌jx-12接種于無菌的活化培養基斜面，活化培養基配方為：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl5g，瓊脂19g，ph7.0～7.4，補水至1000ml，在121℃滅菌30min。在37℃條件下培養24小時活化，將已活化的菌種接種于無菌的種子培養基，種子培養基配方為：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl5g，ph7.0～7.4，補水至1000ml，在121℃滅菌30min。在30℃、200rpm的條件下搖瓶培養24小時，即得種子液。2)、固定化細胞制備：將種子液在5000rpm、4℃條件下離心20min，棄上清液，用無菌的0.9％生理鹽水沖洗3次，用無菌水將菌體懸浮，并稀釋至濃度為106cfu/ml。取3％海藻酸鈉溶液200ml，與50ml上述細胞懸液混合，使用滴管將混合溶液逐滴加入無菌的50g/l的cacl2溶液中，即可形成3-5mm固定化凝膠顆粒，30min后棄cacl2溶液，使用無菌水清洗凝膠顆粒4次，加入無菌的0.9％的生理鹽水，4℃保存備用。3)、木質纖維素材料預處理：將玉米秸稈用自來水清洗，干燥后粉碎、過40目篩，加入2.0％的h2so4溶液，至固體含量為10％，121℃蒸煮3h,迅速冷卻，使用自來水清洗4次，直至洗出的液體為中性，60℃干燥至恒重。4)、同步糖化、過濾與發酵：第一、預水解：將500g預處理的玉米秸稈粉加入水解反應器1中，加入5l蒸餾水、纖維素酶20fpu/(g底物)、5ml消泡劑，在50℃、150rpm下攪拌24h，體系ph維持在4.5-5.5。第二、發酵罐滅菌：向5l通氣攪拌式發酵罐3中加入3l不含主要碳源的發酵培養基，發酵培養基的配方為：檸檬酸15g，谷氨酸60g，硫酸銨30g，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，fecl3·6h2o0.06g，mnso4·h2o0.3g，cacl20.6g，補水至3l；加入6ml消泡劑，使用蒸汽將發酵罐及培養基121℃滅菌30min，冷卻待用。第三、同步糖化、過濾與發酵：預水解后，將150g固定化的菌株jx-12接種到3l培養基中，打開各個管道上的蠕動泵，將水解反應器1與通氣攪拌式發酵罐3連接在一起。使水解反應器1中木質纖維素-酶混合物泵入錯流膜過濾裝置2中，錯流膜過濾裝置2中設置孔徑0.22μm的陶瓷膜，有效面積為0.25㎡，流速為30l/min，滯留物泵回水解反應器1，含糖的濾出液以35ml/min的流速泵入通氣攪拌式發酵罐3。同時通氣攪拌式發酵罐3中液體以35ml/min的流速泵入水解反應器1中，維持體系的平衡。發酵罐中攪拌速度為400rpm，通氣量為12vvm，溫度為30℃，ph通過自動流加2mnaoh維持在7.0,發酵96h。取發酵液，過濾除菌，加入3倍體積的乙醇，離心提純γ-聚谷氨酸，110℃真空酸水解24h,衍生后，通過高效液相色譜測定γ-聚谷氨酸產量。第四、連續批次發酵：發酵96h后，取出通氣攪拌式發酵罐3中的發酵液，將固定化的γ-聚谷氨酸留在通氣攪拌式發酵罐3中，加入3l已滅菌的不含主要碳源的培養基，水解反應器1中補充200g經過預處理的玉米秸稈和4000fpu的纖維素酶，繼續進行同步糖化、過濾與發酵72h，如此重復三個批次，測定每批次中γ-聚谷氨酸產量。檢測結果如下表2所示：。表2.以玉米秸稈為主要原料同步糖化、過濾與發酵連續批次生產γ-聚谷氨酸產量批次γ-聚谷氨酸產量(g/l)115.4218.8319.2418.5實施例二以玉米秸稈為主要原料生產γ-聚谷氨酸：1)、種子培養：將低溫凍存的解淀粉芽孢桿菌jx-12接種于無菌的活化培養基斜面，活化培養基配方為：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl5g，瓊脂19g，ph7.0～7.4，補水至1000ml，在121℃滅菌30min。在37℃條件下培養24小時活化，將已活化的菌種接種于無菌的種子培養基，種子培養基配方為：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl5g，ph7.0～7.4，補水至1000ml，在121℃滅菌30min。在30℃、200rpm的條件下搖瓶培養24小時，即得種子液。2)、固定化細胞制備：將種子液在5000rpm、4℃條件下離心20min，棄上清液，用無菌的0.9％生理鹽水沖洗3次，用無菌水將菌體懸浮，并稀釋至濃度為106cfu/ml。將聚氨酯泡沫裁剪成1cm3左右的小塊，取400ml10％聚乙烯醇溶液，與80ml上述菌懸液混合，將100粒聚氨酯泡沫浸入聚乙烯醇菌株混合溶液，待混合溶液充分浸入泡沫的縫隙中后，將帶有菌液的聚氨酯泡沫轉移到飽和硼酸溶液中，于4℃冰箱中交聯固化20h，用無菌水洗滌4次，將固定化細胞顆粒浸在0.9％的生理鹽水，4℃冰箱中保存待用。3)、木質纖維素材料預處理：將玉米秸稈用自來水清洗，干燥后粉碎、過40目篩，加入2.0％的h2so4溶液，至固體含量為10％，121℃蒸煮3h,迅速冷卻，使用自來水清洗4次，直至洗出的液體為中性，60℃干燥至恒重。4)、同步糖化、過濾與發酵：第一、預水解：將500g預處理的玉米秸稈粉加入水解反應器1中，加入5l蒸餾水、纖維素酶20fpu/(g底物)、5ml消泡劑，在50℃、150rpm下攪拌24h，體系ph維持在4.5-5.5。第二、發酵罐滅菌：向5l通氣攪拌式發酵罐3中加入3l不含主要碳源的發酵培養基，發酵培養基的配方為：檸檬酸15g，谷氨酸60g，硫酸銨30g，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，fecl3·6h2o0.06g，mnso4·h2o0.3g，cacl20.6g，補水至3l；加入6ml消泡劑，使用蒸汽將發酵罐及培養基121℃滅菌30min，冷卻待用。第三、同步糖化、過濾與發酵：預水解后，將60粒聚乙烯醇-聚氨酯固定化的菌株jx-12接種到3l培養基中，打開各個管道上的蠕動泵，將水解反應器1與通氣攪拌式發酵罐3連接在一起。使水解反應器1中木質纖維素-酶混合物泵入錯流膜過濾裝置2中，錯流膜過濾裝置2中設置孔徑0.22μm的陶瓷膜，有效面積為0.25㎡，流速為30l/min，滯留物泵回水解反應器1，含糖的濾出液以35ml/min的流速泵入通氣攪拌式發酵罐3。同時通氣攪拌式發酵罐3中液體以35ml/min的流速泵入水解反應器1中，維持體系的平衡。發酵罐中攪拌速度為400rpm，通氣量為12vvm，溫度為30℃，ph通過自動流加2mnaoh維持在7.0,發酵96h。取發酵液，過濾除菌，加入3倍體積的乙醇，離心提純γ-聚谷氨酸，110℃真空酸水解24h,衍生后，通過高效液相色譜測定γ-聚谷氨酸產量。第四、連續批次發酵：發酵96h后，取出通氣攪拌式發酵罐3中的發酵液，將固定化的γ-聚谷氨酸留在通氣攪拌式發酵罐3中，加入3l已滅菌的不含主要碳源的培養基，水解反應器1中補充200g經過預處理的玉米秸稈和4000fpu的纖維素酶，繼續進行同步糖化、過濾與發酵72h，如此重復三個批次，測定每批次中γ-聚谷氨酸產量。檢測結果如下表3所示：。表3.以玉米秸稈為主要原料使用聚乙烯醇和聚氨酯泡沫固定化細胞同步糖化、過濾與發酵連續批次生產γ-聚谷氨酸產量批次γ-聚谷氨酸產量(g/l)121.3223.5320.4421.7核苷酸或氨基酸序列表sequencelisting<110>中國科學院成都生物研究所<120>高產γ-pga菌株及應用其生產γ-pga的方法<160>1<210>1<211>1495<212>dna<213>芽孢桿菌(bacillussp.)<400>1cctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgg60gagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgta120agactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggt180tcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctag240ttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggc300cacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccg360caatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaa420agctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacct480aaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcg540ttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaag600cccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggaga660gtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaag720gcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggatta780gataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgcccc840ttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaa900ctcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaa960cgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtcccct1020tcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttggg1080ttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactct1140aaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgcccc1200ttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgag1260gttaagccaatcccacaaatctgtt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