專利名稱：一種提高阿維拉霉素發酵產量的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用不同營養因子添加到阿維拉霉素發酵培養基并提高其產量的方法。阿維拉霉素屬于正糖霉素族的寡糖類抗生素，由綠色產綠鏈霉菌(Mi^ptomyces viridochromogenes)發酵產生的二氯異扁枝衣酸酯，是一種新型獸用消化促進劑和代謝調節劑。阿維拉霉素最先由美國禮來公司研制開發，在歐盟、日本、巴西、泰國等世界主要養殖業國家，均被廣泛應用于畜禽飼料中，效果顯著，是歐盟國家允許使用的獸用抗生素之一。盡管阿維拉霉素產品已在我國已上市，但由于阿維拉霉素生物合成與代謝調控的復雜， 在高單位的阿維拉霉素菌種選育及工藝研究上沒有取得實質性突破，目前仍處于開發階段。阿維拉霉素是以糖為骨架的低聚糖抗生素，其結構由末端的雙氯晚霉素酸分子 (殘基A)連接一個七糖鏈組成，分子結構如下。阿維拉霉素有多個活性組分，其中以阿維拉霉素A為主要組分。在阿維拉霉素生物合成中，其合成單元主要來源與糖代謝、磷酸戊糖等途徑的單糖衍生物，但對于氨基酸、 以及富含不同氨基酸的有機氮源對阿維拉霉素生產菌的生長及產物合成的影響，還缺乏深入研究。氨基酸不僅能作為外源游離氨基酸被微生物直接吸收，以滿足蛋白質等物質的生物合成，同時氨基酸還可以影響微生物初級代謝和次級代謝的代謝流分布情況。本實驗對不同氨基酸、以及富含氨基酸的有機氮源進行篩選，獲得一批明顯促進阿維拉霉素合成的營養因子，可用于添加到發酵培養基中提高阿維拉霉素發酵產量。
發明內容
本發明針對現有技術存在的不足，提出一種應用不同氨基酸或富含不同氨基酸的有機氮源添加在發酵培養基中提高阿維拉霉素發酵產量的方法。用于實現本發明目的的具體技術解決方案如下
本發明使用的菌種為綠色產色鏈霉菌(^&印如耶⑶^ viridochromogenes Tii-57或 Streptomyces viridochromogenes NRRL2860)。本發明使用的發酵培養基成分為(g/L):葡萄糖20，玉米淀粉40，豆油5，NaCl
背景技術：
LCaCO3 5, NaNO3 5，CaCl2 10，MgSO4 0. 04，CuSO4 0. 03, (NH4)2SO4 2，加自來水至 1L，消后 pH 控制在7.(Γ7.2，滅菌溫度115 121°C，滅菌時間30 min。在發酵初始培養基中添加質量濃度為0. 051%的氨基酸或富含氨基酸的有機氮源。發酵工藝采用搖瓶發酵工藝，500mL搖瓶裝液量50 mL,搖床轉速180140 r/min，接種量為5 15%，培養溫度為^ 30°C。其中氨基酸選自脯氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺的一種或多種組合，富含氨基酸的有機氮源為魚粉、大豆蛋白胨、黃豆粉、麥芽浸粉的一種或多種組合。發酵培養6-10天后，取發酵液5ml，加丙酮5_20ml超聲10_30min (19KHz, 200W, 5min)，離心，0. 44μ m濾膜過濾，用C18柱，以乙腈0.洲磷酸二氫銨溶液(用磷酸調節pH值為3) =51 49為流動相，波長為214nm檢測阿維拉霉素產物A組分的產量。本發明所具有的優點
本發明結合阿維拉霉素生物合成代謝調控的特點，從氮調控的角度，篩選得到與阿維拉霉素合成有關的氨基酸以及富含氨基酸的有機氮源，在初始培養基中添加一定濃度的氨基酸或有機氮源，可以大幅度提高阿維拉霉素的發酵水平。本發明具有目的明確、發酵成本低等優點，可以應用于阿維拉霉素的發酵生產，以及用于大規模工業化生產。
具體實施例方式實施例1 發酵培養基成分為葡萄糖20g，玉米淀粉40g，豆油5g ,NaCl lg, CaCO3 5g，NaNO3 5g，CaCl2 10g，MgSO4 0. 04g，CuSO4 0. 03g, (NH4)2SO4 2g，加自來水至 1L，消后 pH 控制在7. 0 7· 2，滅菌溫度115 121 °C，滅菌時間30 min。在發酵培養基中添加質量濃度為0. 1%的脯氨酸。發酵工藝采用搖瓶發酵工藝， 500mL搖瓶裝液量50 mL,搖床轉速220 r/min，以“&卬如歷凡然viridochromogenes NRRL 2860培養種子液，接種量為10%，培養溫度為30°C。發酵培養8天后，取發酵液5ml，加丙酮IOml超聲15 min (19KHz, 200W, 5min), 離心，0. 44 4!11濾膜過濾，用(18柱，以乙腈0.洲磷酸二氫銨溶液(用磷酸調節pH值為3) =51 49為流動相，波長為214nm檢測阿維拉霉素產物A組分的產量達到0. 97g/l，阿維拉霉素A組分發酵產量比對照組提高了 4. 79%。實施例2 發酵培養基成分為葡萄糖20g，玉米淀粉40g，豆油5 g,NaCl lg, CaCO3 5g，NaNO3 5g，CaCl2 10g，MgSO4 0. 04g，CuSO4 0. 03g, (NH4)2SO4 2g，加自來水至 1L，消后 pH 控制在7. 0 7· 2，滅菌溫度115 121 °C，滅菌時間30 min。滅菌時間30 min，在發酵初始培養基中添加質量濃度為0.1%的苯丙氨酸。發酵工藝采用搖瓶發酵工藝，500mL搖瓶裝液量50 mL,搖床轉速220 r/min，以 viridochromogenes NRRI^860培養種子液，接種量為10%，培養溫度為30°C。發酵培養9天后，取發酵液5ml，加丙酮20ml超聲30 min (19KHz, 200W, 5min), 離心，0. 44 4!11濾膜過濾，用(18柱，以乙腈0.洲磷酸二氫銨溶液(用磷酸調節pH值為3) =51 49為流動相，波長為214nm檢測阿維拉霉素產物A組分的產量達到1. 03 g/Ι，阿維拉霉素A組分發酵產量比對照組提高了 10. 95%。實施例3 發酵培養基成分為葡萄糖20g，玉米淀粉40g，豆油5g ,NaCl lg, CaCO3 5g，NaNO3 5g，CaCl2 10g，MgSO4 0. 04g，CuSO4 0. 03g, (NH4)2SO4 2g，加自來水至 1L，消后 pH 控制在7. 0 7· 2，滅菌溫度115 121 °C，滅菌時間30 min。
在發酵初始培養基中添加質量濃度為0. 1%的谷氨酰胺。發酵工藝采用搖瓶發酵工藝，500mL搖瓶裝液量 50 mL,搖床轉速 220 r/min,以viridochromogenes NRRL2860培養種子液，接種量為10%，培養溫度為30°C。發酵培養8天后，取發酵液5ml，加丙酮15 ml超聲20 min (19KHz, 200W, 5min)，離心，0. 44 μ m濾膜過濾，用C18柱，以乙腈0. 2%磷酸二氫銨溶液(用磷酸調節pH值為3)=51 :49為流動相，波長為214nm檢測阿維拉霉素產物A組分的產量達到0.95 g/Ι，阿維拉霉素A組分發酵產量比對照組提高了 2.58 %。實施例4:發酵培養基成分為葡萄糖20g，玉米淀粉40g，豆油5g ,NaCl lg, CaCO3 5g，NaNO3 5g，CaCl2 10g，MgSO4 0. 04g，CuSO4 0. 03g, (NH4)2SO4 2g，加自來水至 1L，消后 pH 控制在7. 0 7· 2，滅菌溫度115 121 °C，滅菌時間30 min。在發酵初始培養基中添加質量濃度為1. 5%的黃豆餅粉。發酵工藝采用搖瓶發酵工藝，500mL搖瓶裝液量 50 mL,搖床轉速 220 r/min,以viridochromogenes NRRL觀60培養種子液，接種量為10%，培養溫度為30°C。發酵培養7天后，取發酵液5ml，加丙酮10 ml超聲15 min (19KHz, 200W, 5min)，離心，0. 44 μ m濾膜過濾，用C18柱，以乙腈0. 2%磷酸二氫銨溶液(用磷酸調節pH值為3)=51 :49為流動相，波長為214nm檢測阿維拉霉素產物A組分的產量達到0.5 g/Ι，阿維拉霉素A組分發酵產量比對照組提高了 26. 87%。實施例5 發酵培養基成分為葡萄糖20g，玉米淀粉40g，豆油5g ,NaCl lg, CaCO3 5g，NaNO3 5g，CaCl2 10g，MgSO4 0. 04g，CuSO4 0. 03g, (NH4)2SO4 2g，加自來水至 1L，消后 pH 控制在7. 0 7· 2，滅菌溫度115 121 °C，滅菌時間30 min。在發酵初始培養基中添加質量濃度為1.5%的大豆蛋白胨。發酵工藝采用搖瓶發酵工藝，500mL搖瓶裝液量50 mL, 搖床轉速220 r/min,以Sti^ptomyces viridochromogenes NRRI^860培養種子液，接種量為10%，培養溫度為30°C。發酵培養8天后，取發酵液5ml，加丙酮20ml超聲20 min (19KHz, 200W, 5min)， 離心，0. 44 μ m濾膜過濾，用C18柱，以乙腈0. 2%磷酸二氫銨溶液(用磷酸調節pH值為3) =51 :49為流動相，波長為214nm檢測阿維拉霉素產物A組分的產量達到0.41 g/Ι，阿維拉霉素A組分發酵產量比對照組提高了 49. 66%。實施例6 發酵培養基成分為葡萄糖20g，玉米淀粉40g，豆油5g ,NaCl lg, CaCO3 5g，NaNO3 5g，CaCl2 10g，MgSO4 0. 04g，CuSO4 0. 03g, (NH4)2SO4 2g，加自來水至 1L，消后 pH 控制在7. 0 7· 2，滅菌溫度115 121 °C，滅菌時間30 min。在發酵初始培養基中添加質量濃度為1. 5%的麥芽浸粉。發酵工藝采用搖瓶發酵工藝，500mL搖瓶裝液量 50 mL,搖床轉速 220 r/min,以viridochromogenes NRRL觀60培養種子液，接種量為10%，培養溫度為30°C。發酵培養8天后，取發酵液5ml，加丙酮10 ml超聲10 min (19KHz, 200W, 5min)，離心，0. 44 μ m濾膜過濾，用C18柱，以乙腈0. 2%磷酸二氫銨溶液(用磷酸調節pH值為3)=51 :49為流動相，波長為214nm檢測阿維拉霉素產物A組分的產量達到0.38 g/Ι，阿維拉霉素A組分發酵產量比對照組提高了 38. 29%0實施例7 發酵培養基成分為葡萄糖20g，玉米淀粉40g，豆油5g ,NaCl lg, CaCO3 5g，NaNO3 5g，CaCl2 10g，MgSO4 0. 04g，CuSO4 0. 03g, (NH4)2SO4 2g，加自來水至 1L，消后 pH
5控制在7. 0 7· 2，滅菌溫度115 121 °C，滅菌時間30 min。在發酵初始培養基中添加質量濃度為0. 5%的大豆蛋白胨和1%的麥芽浸粉。發酵工藝采用搖瓶發酵工藝，500mL搖瓶裝液量50 mL,搖床轉速220 r/min，以 viridochromogenes Tii-57 (制備見參考文獻(Journal of Bacteriology, 1997, 179 (20) 6271-6278)培養種子液，接種量為10%，培養溫度為30°C。發酵培養7天后，取發酵液5ml，加丙酮15 ml超聲15 min (19KHz, 200W, 5min)，離心，0. 44 μ m濾膜過濾，用C18柱，以乙腈0. 2%磷酸二氫銨溶液(用磷酸調節pH值為3)=51 :49為流動相，波長為214nm檢測阿維拉霉素產物A組分的產量達到O.Mg/Ι，阿維拉霉素A組分發酵產量比對照組提高了 50%。
權利要求
1.一種提高阿維拉霉素發酵產量的方法，其特征在于所述方法使用的菌種為綠色產Streptomyces viridochromogenes Tii-57 ^Streptomyces viridochromogenes NRRL2860;所述方法使用的發酵培養基成分為g/L:葡萄糖20，玉米淀粉40，豆油5 ,NaCl LCaCO3 5, NaNO3 5，CaCl2 10，MgSO4 0. 04，CuSO4 0. 03, (NH4)2SO4 2，加自來水至 1L，消后 pH 控制在7.CT7.2，滅菌溫度115 121°C，滅菌時間30 min ；在所述發酵培養基中添加質量濃度為0. 05 2%的氨基酸或富含氨基酸的有機氮源；發酵工藝采用搖瓶發酵工藝，500mL搖瓶裝液量50 mL,搖床轉速180 240 r/min，接種量為5 15%，培養溫度為28 30°C。
2.根據權利要求1所述的提高阿維拉霉素發酵產量的方法，其特征在于所述方法中的氨基酸選自脯氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺的一種或多種組合。
3.根據權利要求1所述的提高阿維拉霉素發酵產量的方法，其特征在于所述方法中富含氨基酸的有機氮源為魚粉、大豆蛋白胨、黃豆粉、麥芽浸粉的一種或多種組合。
全文摘要
本發明提出一種提高阿維拉霉素發酵產量的方法，其菌種為綠色產綠鏈霉菌StreptomycesviridochromogenesTü-57或StreptomycesviridochromogenesNRRL2860。其使用的發酵培養基成分為g/L葡萄糖20，玉米淀粉40，豆油5，NaCl1，CaCO35，NaNO35，CaCl210，MgSO40.04，CuSO40.03，(NH4)2SO42，加自來水至1L，消后pH控制在7.0~7.2，滅菌溫度115~121℃，滅菌時間30min；在發酵培養基中添加質量濃度為0.05~2%的氨基酸或富含氨基酸的有機氮源；發酵工藝采用搖瓶發酵工藝，500mL搖瓶裝液量50mL，搖床轉速180~240r/min，接種量為5~15%，培養溫度為28~30℃。本發明從氮調控的角度，篩選得到與阿維拉霉素合成有關的氨基酸以及富含氨基酸的有機氮源，在初始培養基中添加一定濃度的氨基酸或有機氮源，可以大幅度提高阿維拉霉素的發酵水平。
文檔編號C12P19/60GK102321709SQ20111026942
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月13日 優先權日2011年9月13日
發明者劉芳, 李曉榮, 鄒祥 申請人:西南大學