利用galT基因缺失菌株通過發酵生產L?氨基酸的方法與流程

本發明屬于生物工程
技術領域：
，特別涉及一種通過發酵生產l-氨基酸的方法。
背景技術：
：在工業上，目前l-氨基酸的生產方法主要為生物發酵法，即通過具有l-氨基酸生產能力的各種微生物的發酵來生產l-氨基酸，因此具有l-氨基酸生產能力菌株的獲得是l氨基酸生產方法的核心。目前獲得l氨基酸生產菌株的方法主要有兩種，一種是通過對野生型微生物(野生型菌株)進行誘變的方法，使其具有營養缺陷，并使其對某些代謝物產生拮抗作用，從而獲得優良的工業生產菌株。近年來隨著基因工程技術的發展，重組dna技術已經開始普遍應用于微生物代謝工程改造方面，使其成為另外一種重要的獲得l-氨基酸生產菌株的方法。比如，通過提高目標產品合成途徑中關鍵酶的表達，來達到提高微生物l-氨基酸生產能力(cn1305002a)；再比如，通過提高目標產品的分泌蛋白的表達，來達到提高微生物l-氨基酸生產能力(cn1260393a)；或者，通過降低某些基因的表達，來達到提高微生物l-氨基酸生產能力(cn1607246a)；在或者，通過敲除某些基因，使其失活，來達到提高微生物l-氨基酸生產能力(cn1466630a)。galt的表達產物是半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶，催化udp-葡萄糖和半乳糖-1-磷酸(半乳糖-1-磷酸)為udp-半乳糖和葡萄糖-1-磷酸，在半乳糖和葡萄糖轉化中起到重要的作用。目前，對其主要研究集中在酶結構和性質方面的分析，對于其對于l-氨基酸合成還沒有相關的報道。技術實現要素：本發明的目的是提供一種利用galt基因缺失菌株通過發酵生產l-氨基酸的方法，以提高l-氨基酸產量和轉化率。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：一種利用galt基因缺失菌株通過發酵生產l-氨基酸的方法，通過在培養基中培養屬于腸桿菌科，并具有l-氨基酸生產能力的細菌，該細菌于培養前進行修飾，使得galt基因缺失，并從細菌的培養基或細胞收集l-氨基酸，來生產l-氨基酸。進一步的，采用galt基因缺失的菌株atcc21151δgalt，通過發酵的方法生產得到l-蘇氨酸。所述galt基因缺失的菌株atcc21151δgalt通過下述方法構建得到：制備菌株atcc21151的感受態細胞；利用質粒pkd46進行轉化，獲得atcc21151/pkd46菌株；然后，利用基因片段galtknock1轉化atcc21151/pkd46菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物galt1-f/galt1-r進行驗證，驗證正確的菌株命名為atcc21151δgalt::sacbcm；最后，利用基因片段galtknock2轉化atcc21151δgalt::sacbcm菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物galt2-f/galt2-r進行驗證，驗證正確的菌株命名為atcc21151δgalt，至此l-蘇氨酸生產所用的galt基因缺失的菌株atcc21151δgalt構建完畢。進一步的，采用galt基因缺失的菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δgalt，通過發酵的方法生產得到l-賴氨酸。所述galt基因缺失的菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δgalt通過下述方法構建得到：首先，制備菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*的感受態細胞；利用質粒pkd46進行轉化，獲得mg1655/pwsk-lysc*-dapa*(pkd46)菌株；然后，利用基因片段galtknock2轉化mg1655/pwsk-lysc*-dapa*(pkd46)菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物galt2-f/galt2-r進行驗證，驗證正確的菌株命名為mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δgalt::sacbcm；最后，利用基因片段galtknock2轉化mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δgalt::sacbcm菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物galt2-f/galt2-r進行驗證，驗證正確的菌株命名為mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δgalt，至此l-賴氨酸生產所用的galt基因缺失的菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δgalt構建完畢。所述菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*通過下述方法構建得到：利用多片段重組的方法構建以低拷貝質粒pwsk29為出發載體，包含dapa基因表達框和lysc基因表達框的質粒pwsk-lysc-dapa；以質粒pwsk-lysc-dapa為基礎構建dapa和lysc突變體過表達質粒，得到質粒pwsk-lysc*-dapa*；將質粒pwsk-lysc*-dapa*電轉化至大腸桿菌mg1655；獲得的菌株命名為mg1655/pwsk-lysc*-dapa*。有益效果：本發明提供的方法，采用galt基因缺失的大腸桿菌菌株，通過發酵的方法生產得到l-氨基酸，并通過一些列的試驗驗證，galt基因的缺失，其功能或者其相關序列的缺失，對于l-氨基酸發酵有利，有助于氨基酸產量和轉化率的的提升。附圖說明圖1為基因片段galtknock1的構建過程示意圖；圖2為基因片段galtknock2的構建過程示意圖；圖3為基因質粒pwsk-lysc-dapa的構建過程示意圖。具體實施方式本發明實施例所用的l-蘇氨酸生產菌株為大腸桿菌atcc21151，來源于美國典型微生物菌株菌種保藏中心(atcc)。本發明實施例所用的l-賴氨酸生產菌株為大腸桿菌mg1655(atcc47076)，來源于美國典型微生物菌株菌種保藏中心(atcc)。dna聚合酶購自北京全式金公司的fastpfu；限制性內切酶及dna連接酶等均購自fermentas公司；酵母粉和蛋白胨購自英國oxoid公司產品；瓊脂粉和抗生素購自北京索來寶；葡萄糖、硫酸銨等常用化學試劑均購自國藥。質粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒均購自上海生工，多片段重組試劑盒(multisonestepcloningkit)購自南京諾唯贊生物科技有限公司，相關操作均嚴格按照說明書執行；xl-ⅱ定點突變試劑盒購自天津博鑫生物科技有限公司，相關操作均嚴格按照說明書執行；質粒構建測序驗證和基因缺失測序工作由華大基因完成；dh5α感受態細胞購自北京全式金公司。lb培養基成分：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l，固體培養基中添加2％的瓊脂粉。抗生素濃度為：氨芐青霉素100ug/ml，卡那霉素30ug/ml，氯霉素15ug/ml。l-蘇氨酸和l-賴氨酸檢測方法：通過安捷倫液相儀，利用zorbaxeclipseaaa(氨基酸分析)色譜柱對發酵液中的l-賴氨酸和l-蘇氨酸進行分析，相關操作均嚴格按照說明書執行。葡萄糖分析方法采用山東科學院生產的sba-40d生物傳感分析儀進行檢測。實施例1galt敲除片段的構建大腸桿菌基因敲除采用經典的red重組方法，因此需要有進行重組的基因片段。相關基因片段構建方法如下：首先，根據ncbi公布的大腸桿菌mg1655的基因組序列設計引物galtup1-f/galtup1-r和galtdown1-f/galtdown1-r，見表1，以大腸桿菌mg1655基因組為模板pcr擴增得到galt基因上下游個600-700bp的同源臂基因片段，序列如序列表中seqidno.19及seqidno.20所示，pcr擴增參數為98℃2min；98℃20s，63℃20s，72℃1min，循環30次，72℃延伸10min；根據質粒ploi4162基因序列，設計引物sacbcm-f/sacbcm-r，見表1，以質粒ploi4162為模板，pcr擴增氯霉素(cm)和蔗糖致死基因(sacb)基因序列，pcr擴增參數為98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃2min，循環30次；根據質粒puc18基因序列，設計引物puc1-f/puc1-r，見表1，擴增線性puc18基因片段，pcr擴增參數為98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃2min，循環30次；72℃延伸10min。獲得基因片段通過凝膠電泳回收。利用multisonestepcloningkit對上述獲得片段進行連接，具體方法參見試劑盒說明。構建可用于擴增敲除galt基因的基因片段的載體，具體構建過程見圖1。經華大基因公司測序正確后，質粒命名為galt1。根據質粒galt1基因序列，設計引物galt1-f/galt1-r，以質粒galt1為模板pcr擴增第一次galt基因敲除的基因片段galtknock1，pcr擴增參數為98℃2min；98℃20s，58℃20s，72℃3min，循環30次。獲得基因片段通過凝膠電泳回收，用于進行galt基因第一輪敲除。然后，根據ncbi公布的大腸桿菌mg1655的基因組序列設計引物galtup2-f/galtup2-r和galtdown2-f/galtdown2-r，見表1，以大腸桿菌mg1655基因組為模板pcr擴增得到galt基因上下游各600-700bp的同源臂基因片段，序列如序列表中seqidno.19及seqidno.20所示，pcr擴增參數為98℃2min；98℃20s，62℃20s，72℃1min，循環30次，72℃延伸10min；根據質粒puc18基因序列，設計引物puc2-f/puc2-r，見表1，擴增線性puc18基因片段，pcr擴增參數為98℃2min；98℃20s，57℃20s，72℃2min，循環30次；72℃延伸10min。獲得基因片段通過凝膠電泳回收。利用multisonestepcloningkit對上述獲得片段進行連接，具體方法參見試劑盒說明。構建可用于擴增敲除galt基因的基因片段的載體，具體構建過程見圖2。經華大基因公司測序正確后，質粒命名為galt2。根據質粒galt2基因序列，設計引物galt2-f/galt2-r，以質粒galt2為模板pcr擴增第二次galt基因敲除的基因片段galtknock2，pcr擴增參數為98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃3min，循環30次。獲得基因片段通過凝膠電泳回收，用于進行galt基因第二輪敲除。表1引物名稱序列puc1-fgaccaaagcagttcgggtaccgagctcgaattcgpuc1-rtttgcggtgtgccgggatcctctagagtcgacctgcagaltup1-ftctagaggatcccggcacaccgcaaagcccttacggaltup1-rctcaaaaaatacgggtcgttccttaatcgggatatccsacbcm-ftcccgattaaggaacgacccgtattttttgagttatcgagattttcaggagctsacbcm-rctttcagactcatttccagcctgaatcaggcatttgagaagcagaltdown1-fctgattcaggctggaaatgagtctgaaagaaaaaacacaatctctggaltdown1-ragctcggtacccgaactgctttggtccccagtgagcgpuc2-fgaccaaagcagttcgggtaccgagctcgaattcgpuc2-rtttgcggtgtgccgggatcctctagagtcgacctgcagaltup2-ftctagaggatcccggcacaccgcaaagcccttacggaltup2-rctttcagactcatttcggtcgttccttaatcgggatatccgaltdown2-ftcccgattaaggaacgaccgaaatgagtctgaaagaaaaaacacaatctctggaltdown2-ragctcggtacccgaactgctttggtccccagtgagcggalt1-fcacaccgcaaagcccttacgalt1-rctttggtccccagtgagcgalt2-fcaccgcaaagcccttacgalt2-rcgttccttaatcgggatatc實施例2l-賴氨酸生產菌株構建利用大腸埃希氏菌mg1655菌株(atcc47076)來構建一株可以生產l-賴氨酸的菌株。具體方法如下。1.過表達二氫吡啶二羧酸合酶(dapa)和天冬氨酸激酶iii(lysc)基因質粒構建利用多片段重組的方法構建了以低拷貝質粒pwsk29為出發載體，包含dapa基因表達框和lysc基因表達框的質粒。具體方法如下所述：首先，根據ncbi公布的大腸桿菌mg1655的基因組序列設計引物lysc-f/lysc-r和dapa-f/dapa-f，見表2，以大腸桿菌mg1655基因組為模板pcr擴增得到帶有自身啟動子的dapa和lysc基因片段，序列如序列表中seqidno.22及seqidno.23所示，pcr擴增參數為98℃2min；98℃20s，65℃20s，72℃2min，循環30次；72℃延伸10min。根據質粒pwsk29基因序列，設計引物pwsk-f/pwsk-r，擴增線性pwsk29基因片段，pcr擴增參數為98℃2min；98℃20s，60℃20s，72℃3min，循環30次；72℃延伸10min。獲得基因片段通過凝膠電泳回收。然后，利用multisonestepcloningkit對上述獲得片段進行連接，具體方法參見試劑盒說明。構建過表達二氫吡啶二羧酸合酶(dapa)和天冬氨酸激酶iii(lysc)基因質粒pwsk-lysc-dapa，具體構建過程見圖3。經華大基因公司測序正確后進行下一步試驗。2.dapa和lysc突變體過表達質粒的構建野生型的dapa基因和lysc基因是受到l-賴氨酸的反饋抑制的，因此為了解除l-賴氨酸對其的反饋抑制，增加其在細胞內的酶活力，對其進行了點突變，以pwsk-lysc-dapa為基礎構建了dapa和lysc突變體過表達質粒。具體方法如下所述。首先，設計利用stratagene系列xl-ⅱ定點突變試劑盒，通過引物lysct352if/lysct352ir(見表2)對質粒pwsk-lysc-dapa進行pcr引入突變位點，獲得的質粒基因片段經過pcr產物回收，除去pcr體系中的酶及緩沖體系中的鹽離子后，采用dpni酶37攝氏度酶切1h除去甲基化的模板質粒dna，處理后的質粒轉入感受態細胞tran10(購自北京全式金生物技術有限公司)，經測序驗證，所獲得的正確突變質粒命名為pwsk-lysc*-dapa，攜帶的lysc突變體核苷酸序列如序列表中seqidno.24所示。然后，設計利用stratagene系列xl-ⅱ定點突變試劑盒，通過引物dapae84t-f/dapae84t-r(見表2)對質粒pwsk-lysc*-dapa進行pcr引入突變位點，獲得的質粒基因片段經過pcr產物回收，除去pcr體系中的酶及緩沖體系中的鹽離子后，采用dpni酶37攝氏度酶切1h除去甲基化的模板質粒dna，處理后的質粒轉入感受態細胞tran10，經測序驗證，所獲得的正確突變質粒命名為pwsk-lysc*-dapa*，攜帶的dapa突變體核苷酸序列如序列表中seqidno.25所示。3.l-賴氨酸生產菌株shg01的構建及發酵驗證將前面構建好的質粒pwsk-lysc*-dapa*電轉化至大腸桿菌mg1655；獲得的菌株命名為mg1655/pwsk-lysc*-dapa*。然后，對其進行l-賴氨酸發酵能力的驗證。發酵培養基如下：葡萄糖40g/l，硫酸銨10g/l，磷酸0.6ml/l，氯化鉀0.8g/l，甜菜堿0.4g/l，硫酸鎂1.2g/l，硫酸錳0.03g/l，硫酸亞鐵0.03g/l，玉米漿有機氮0.4g/l，5％消泡劑0.5ml/l，蘇氨酸0.2g/l，卡那霉素50ug/ml。利用500ml裝入30ml發酵培養基的三角瓶進行發酵實驗，接種2mllb過夜培養的菌液，在37℃、200rpm條件下發酵。利用稀釋的氨水控制ph6.8，發酵32h。菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*發酵32h后，l-賴氨酸產量為4.6g/l。表2引物名稱序列pwsk-fgctgcctgtagttctgacgaagcataaagtgtaaagcctggggtgccpwsk-rgcgctagcgcaggttgcagcacatccccctttcgclysc-fggatgtgctgcaacctgcgctagcgcaggcclysc-rggagaagagttcacgtttattatataaagacgctggttaacagagtacaggctcgdapa-fctctgttaaccagcgtctttatataataaacgtgaactcttctcccagcdapa-rccaggctttacactttatgcttcgtcagaactacaggcagcglysct352i-fgtggcattaatccttgataccaccggttcaacctccactglysct352i-rgtatcaaggattaatgccacgctcacttctgacgtggtgadapae84t-fcgctaacgctactgcgaccgccattagcctgacgdapae84t-rcgtcaggctaatggcggtcgcagtagcgttagcg實施例3galt基因缺失菌株構建1.l-蘇氨酸生產菌株atcc21151δgalt基因缺失突變株構建l-蘇氨酸生產菌株atcc21151基因敲除方法采用經典的red重組方法，參考相關文獻進行。具體操作過程如下：首先，制備菌株atcc21151的感受態細胞，具體感受態細胞制備和轉化過程參考j.薩姆布魯克(sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》；利用質粒pkd46進行轉化，獲得atcc21151/pkd46菌株；然后，利用基因片段galtknock1轉化atcc21151/pkd46菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物galt1-f/galt1-r進行驗證，驗證正確的菌株命名為atcc21151δgalt::sacbcm。最后，利用基因片段galtknock2轉化atcc21151δgalt::sacbcm菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物galt2-f/galt2-r進行驗證，驗證正確的菌株命名為atcc21151δgalt，至此l-蘇氨酸生產菌株atcc21151δgalt基因缺失突變株構建完畢。2.l-賴氨酸生產菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δgalt基因缺失突變株構建l-賴氨酸生產菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*基因敲除方法采用經典的red重組方法，參考相關文獻進行。具體操作過程如下：首先，制備菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*的感受態細胞，具體感受態細胞制備和轉化過程參考j.薩姆布魯克(sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》；利用質粒pkd46進行轉化，獲得mg1655/pwsk-lysc*-dapa*(pkd46)菌株；然后，利用基因片段galtknock2轉化mg1655/pwsk-lysc*-dapa*(pkd46)菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物galt2-f/galt2-r進行驗證，驗證正確的菌株命名為mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δgalt::sacbcm。最后，利用基因片段galtknock2轉化mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δgalt::sacbcm菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物galt2-f/galt2-r進行驗證，驗證正確的菌株命名為mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δgalt，至此l-賴氨酸生產菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δgalt基因缺失突變株構建完畢。實施例4galt基因缺失對l-蘇氨酸發酵的影響為了驗證galt基因缺失對于l-蘇氨酸發酵的影響，利用搖瓶發酵的方法對菌株atcc21151和菌株atcc21151δgalt進行發酵驗證，具體過程如下：發酵培養基如下表3所示：表3將上述l-蘇氨酸生產菌株單菌落分別接種5mllb液體培養基，37℃，220rpm培養12h。按照初始od為0.2轉接裝有30ml發酵培養基的500ml三角瓶，37℃，220rpm培養36h，檢測l-蘇氨酸的濃度。菌株最終產量結果如表4所示，對照菌株atcc21151中l-蘇氨酸產量為4.8g/l，galt基因缺失的菌株atcc21151δgalt中l-蘇氨酸產量為5.7g/l，比出發菌株提高了18.9％，表明在大腸桿菌中部分或全部缺失半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶活性能夠提高l-蘇氨酸的產量。表4菌株l-蘇氨酸g/latcc211514.8atcc21151δgalt5.7實施例5galt基因缺失對l-賴氨酸發酵的影響為了驗證galt基因缺失對于l-賴氨酸發酵的影響，利用搖瓶發酵的方法對菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*和菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δgalt進行發酵驗證，具體過程如下：發酵培養基如下表5所示：表5將上述l-賴氨酸生產菌株單菌落分別接種5ml含有100μg/ml卡那霉素的lb液體培養基，37℃，220rpm培養12h。按照10％的接種量轉接裝有20ml發酵培養基的500ml三角瓶，37℃，220rpm培養30h，檢測l-賴氨酸的濃度。菌株最終產量結果如表6所示，對照菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*中l-賴氨酸產量為4.6g/l，galt基因缺失的菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δgalt中l-賴氨酸產量為5.9g/l，比出發菌株提高了28.2％，表明在大腸桿菌中部分或全部半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶活性能夠提高l-賴氨酸的產量。表6菌株l-賴氨酸g/lmg1655/pwsk-lysc*-dapa*4.6mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δgalt5.9以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出：對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。sequencelisting<110>徐州工程學院<120>利用galt基因缺失菌株通過發酵生產l-氨基酸的方法<130>2017<160>35<210>1<211>34<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物puc1-f<400>1gaccaaagcagttcgggtaccgagctcgaattcg34<210>2<211>37<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物puc1-r<400>2tttgcggtgtgccgggatcctctagagtcgacctgca37<210>3<211>35<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物galtup1-f<400>3tctagaggatcccggcacaccgcaaagcccttacg35<210>4<211>37<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物galtup1-r<400>4ctcaaaaaatacgggtcgttccttaatcgggatatcc37<210>5<211>53<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物sacbcm-f<400>5tcccgattaaggaacgacccgtattttttgagttatcgagattttcaggagct53<210>6<211>43<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物sacbcm-r<400>6ctttcagactcatttccagcctgaatcaggcatttgagaagca43<210>7<211>46<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物galtdown1-f<400>7ctgattcaggctggaaatgagtctgaaagaaaaaacacaatctctg46<210>8<211>37<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物galtdown1-r<400>8agctcggtacccgaactgctttggtccccagtgagcg37<210>9<211>34<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物puc2-f<400>9gaccaaagcagttcgggtaccgagctcgaattcg34<210>10<211>37<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物puc2-r<400>10tttgcggtgtgccgggatcctctagagtcgacctgca37<210>11<211>35<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物galtup2-f<400>11tctagaggatcccggcacaccgcaaagcccttacg35<210>12<211>40<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物galtup2-r<400>12ctttcagactcatttcggtcgttccttaatcgggatatcc40<210>13<211>52<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物galtdown2-f<400>13tcccgattaaggaacgaccgaaatgagtctgaaagaaaaaacacaatctctg52<210>14<211>37<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物galtdown2-r<400>14agctcggtacccgaactgctttggtccccagtgagcg37<210>15<211>19<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物galt1-f<400>15cacaccgcaaagcccttac19<210>16<211>18<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物galt1-r<400>16ctttggtccccagtgagc18<210>17<211>17<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物galt2-f<400>17caccgcaaagcccttac17<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物galt2-r<400>18cgttccttaatcgggatatc20<210>19<211>600<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：galt上游同源臂基因序列<400>19ggcacaccgcaaagcccttacggcaaaagcaagctgatggtggaacagatcctcaccgatctgcaaaaagcccagccggactggagcattgccctgctgcgctacttcaacccggttggcgcgcatccgtcgggcgatatgggcgaagatccgcaaggcattccgaataacctgatgccatacatcgcccaggttgctgtaggccgtcgcgactcgctggcgatttttggtaacgattatccgaccgaagatggtactggcgtacgcgattacatccacgtaatggatctggcggacggtcacgtcgtggcgatggaaaaactggcgaacaagccaggcgtacacatctacaacctcggcgctggcgtaggcaacagcgtgctggacgtggttaatgccttcagcaaagcctgcggcaaaccggttaattatcattttgcaccgcgtcgcgagggcgaccttccggcctactgggcggacgccagcaaagccgaccgtgaactgaactggcgcgtaacgcgcacactcgatgaaatggcgcaggacacctggcactggcagtcacgccatccacagggatatcccgattaaggaacgacc600<210>20<211>600<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：galt下游同源臂基因序列<400>20gaaatgagtctgaaagaaaaaacacaatctctgtttgccaacgcatttggctaccctgccactcacaccattcaggcgcctggccgcgtgaatttgattggtgaacacaccgactacaacgacggtttcgttctgccctgcgcgattgattatcaaaccgtgatcagttgtgcaccacgcgatgaccgtaaagttcgcgtgatggcagccgattatgaaaatcagctcgacgagttttccctcgatgcgcccattgtcgcacatgaaaactatcaatgggctaactacgttcgtggcgtggtgaaacatctgcaactgcgtaacaacagcttcggcggcgtggacatggtgatcagcggcaatgtgccgcagggtgccgggttaagttcttccgcttcactggaagtcgcggtcggaaccgtattgcagcagctttatcatctgccgctggacggcgcacaaatcgcgcttaacggtcaggaagcagaaaaccagtttgtaggctgtaactgcgggatcatggatcagctaatttccgcgctcggcaagaaagatcatgccttgctgatcgattgccgctcactggggaccaaagcagtt600<210>21<211>2546<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：sacbcm基因序列<400>21cgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagttattggtgcccttaaacgcctggtgctacgcctgaataagtgataataagcggatgaatggcagaaattcgaaagcaaattcgacccggtcgtcggttcagggcagggtcgttaaatagccgctagatctaagtaaatcgcgcgggtttgttactgataaagcaggcaagacctaaaatgtgtaaagggcaaagtgtatactttggcgtcaccccttacatattttaggtctttttttattgtgcgtaactaacttgccatcttcaaacaggagggctggaagaagcagaccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgaacatcaaaaagtttgcaaaacaagcaacagtattaacctttactaccgcactgctggcaggaggcgcaactcaagcgtttgcgaaagaaacgaaccaaaagccatataaggaaacatacggcatttcccatattacacgccatgatatgctgcaaatccctgaacagcaaaaaaatgaaaaatatcaagttcctgaattcgattcgtccacaattaaaaatatctcttctgcaaaaggcctggacgtttgggacagctggccattacaaaacgctgacggcactgtcgcaaactatcacggctaccacatcgtctttgcattagccggagatcctaaaaatgcggatgacacatcgatttacatgttctatcaaaaagtcggcgaaacttctattgacagctggaaaaacgctggccgcgtctttaaagacagcgacaaattcgatgcaaatgattctatcctaaaagaccaaacacaagaatggtcaggttcagccacatttacatctgacggaaaaatccgtttattctacactgatttctccggtaaacattacggcaaacaaacactgacaactgcacaagttaacgtatcagcatcagacagctctttgaacatcaacggtgtagaggattataaatcaatctttgacggtgacggaaaaacgt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