鮑曼不動桿菌假定蛋白a1s_1462蛋白及制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，特別涉及鮑曼不動桿菌假定蛋白A1S_1462蛋白及制 備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii)為非發酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于 自然界，屬于條件致病菌。該菌是醫院感染的重要病原菌，主要引起呼吸道感染，也可引發 菌血癥、泌尿系感染、繼發性腦膜炎、手術部位感染、呼吸機相關性肺炎等。國內資料表明， 鮑曼不動桿菌約占臨床分離的不動桿菌的70%以上。鮑曼不動桿菌對第三代和第四代頭孢 菌素的耐藥率已達63.0%~89. 9%。對四種氨基糖苷類（阿米卡星、慶大酶素、奈替米星、 妥布霉素）和環丙沙星的耐藥率菌達96.3%。我國目前的絕大多數菌株對亞胺培南、美羅 培南、頭孢鮑曼不動桿菌派酮/舒巴坦和多黏菌素 B保持敏感，但在呼吸道感染的治療中效 果較差。
[0003] 由于現有抗生素難以有效治療鮑曼不動桿菌感染，而新的可以用于治療鮑曼不動 桿菌感染的抗生素在短期內無法獲得的情況下，治療鮑曼不動桿菌引起的感染性疾病也 變得日益復雜，近年來醫學界的相關的病原微生物研宄學習者也對鮑曼不動桿菌的預防 和治療進行了相關研宄。西班牙Michael J. McCnnell等人利用急性膿血癥小鼠模型對 鮑曼不動桿菌滅活全菌疫苗的主動免疫和被動免疫兩個方面進行了評價；同時，Michael J. McCnnel 1等人在2011年對鮑曼不動桿菌的外膜蛋白疫苗進行了研宄，結果提示OMC可以 刺激T細胞分泌IFN- γ及活化Thl及Th2輔助B細胞分泌IgG抗體，均對小鼠具有良好的 免疫保護性。但是以上全菌疫苗和外膜復合物疫苗成分復雜，同時含有大量的內毒素，對機 體的毒副作用較大，因此研發一種質量可控，安全有效的鮑曼不動桿菌疫苗是必然的趨勢。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種鮑曼不動桿菌蛋白A1S_1462蛋白及制備方法和應用， 該蛋白可應用于制備抗鮑曼不動桿菌感染的亞單位疫苗以及相關的檢測試劑盒。
[0005] 本發明的技術方案如下：
[0006] 鮑曼不動桿菌A1S_1462重組蛋白，包含A1S_1462成熟肽，所述成熟肽的氨基酸序 列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 所述重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0008] 所述重組蛋白通過標簽蛋白GST融合表達，所述標簽蛋白融合于所述A1S_1462蛋 白的N端。
[0009] 所述重組蛋白的氨基酸序列還包括在SEQ ID NO. 1的氨基端和/或羧基端缺失、 替代、和/或添加了 1 一 20個氨基酸殘基的具有免疫原性的變體，該變體與所述氨基酸序 列具有至少80%的同一性。
[0010] 該重組蛋白由融合表達并酶切后在成熟肽的的氨基端加入GPLGS五個氨基酸形 成。
[0011] 編碼A1S_1462重組蛋白的多核苷酸。
[0012] A1S_1462重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：
[0013] 1)設計PCR的引物如下：
[0014] 正向引物
[0015] 5'-CGCGGATCCATGGCACCTGTAAAAGAACAAAAAAT-3'
[0016] BamH I [0017] 反向引物
[0018] 5'-TTATGCGGCCGCCTTACTTTTTTGTAGCTGCG-3'
[0019] Not I
[0020] 2)使用步驟1)設計的引物通過PCR擴增出編碼A1S_1462蛋白目的基因片段；
[0021] 3)步驟2)所得的基因片段克隆至表達載體，然后轉化至宿主菌；
[0022] 4)誘導轉化后的宿主菌表達A1S_1462重組蛋白；
[0023] 5)純化重組蛋白。
[0024] 表達載體或宿主細胞，包含編碼權利要求1所述重組蛋白的多核苷酸或宿主細 胞。
[0025] 所述載體是pGEX-6P_2表達載體；所述宿主細胞是大腸桿菌，所述大腸桿菌是 XLl-Blue0
[0026] 抗A1S_1462蛋白的抗體。
[0027] A1S_1462重組蛋白在制備預防或治療鮑曼不動桿菌感染的藥物中的應用。
[0028] A1S_1462重組蛋白在制備鮑曼不動桿菌檢測試劑盒中的應用。
[0029] 本發明所述A1S_1462蛋白，可在SEQ ID N0:l、3或5中天然產生或人工引入突 變或變異（包括但不限于，置換，缺失和/或添加），而不影響A1S_1462的生物學特性。因 此，在本發明中，"A1S_1462"意欲包括全長A1S_1462蛋白、其成熟肽和其變體，包括SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:5所示的多肽以及其天然或人工的變體，所述變體保留了 A1S_1462的生物學特性，即，具有強免疫原性。并且，當描述A1S_1462的序列片段時，其不 僅包括SEQ ID NO: 1、3或5所示的多肽的序列片段，還包括該多肽的天然或人工變體中的 相應序列片段。
[0030] 根據本發明，當在蛋白/多肽的背景中使用時，術語"變體"是指這樣的蛋白，其氨 基酸序列與參照蛋白/多肽（例如，本發明的A1S_1462蛋白）的氨基酸序列具有一個或 多個（例如1-10個或1-5個或1-3個）氨基酸差異（例如，保守氨基酸置換），或者具有 至少 60%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或 99% 的同一 性，并且其保留了參照蛋白/多肽的必要特性。在本發明中，蛋白/多肽（例如，本發明的 A1S_1462蛋白）的必要特性可以指，具有強免疫原性。
[0031] 上述"同一性"用于指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的匹配情況。當兩個進行 比較的序列中的某個位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據時（例如，兩個DNA分 子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤占據，或兩個多肽的每一個中的某個位置都被賴氨酸 占據），那么各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的"百分數同一性"是由這兩個序列 共有的匹配位置數目除以進行比較的位置數目XlOO的函數。例如，如果兩個序列的10個 位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT 共有50%的同一性（總共6個位置中有3個位置匹配）。通常，在將兩個序列比對以產生 最大同一性時進行比較。
[0032] 如本文中使用的，術語"保守置換"意指不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的 蛋白/多肽的生物學活性的氨基酸置換。例如，可通過本領域內已知的標準技術例如定點 誘變和PCR介導的誘變引入保守置換。保守氨基酸置換包括用具有相似側鏈的氨基酸殘基 替代氨基酸殘基的置換，例如用在物理學上或功能上與相應的氨基酸殘基相似（例如具有 相似大小、形狀、電荷、化學性質，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等）的殘基進行的置換。
[0033] 根據本發明，術語"免疫原性（immunogenicity) "是指，能夠刺激機體形成特異抗 體或致敏淋巴細胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫細胞，使免疫細胞活化、增殖、分 化，最終產生免疫效應物質如抗體和致敏淋巴細胞的特性，也指抗原刺激機體后，機體免疫 系統能形成抗體或致敏T淋巴細胞的特異性免疫應答。
[0034] 在本發明中，術語"多肽"和"蛋白質"具有相同的含義，可互換使用。
[0035] 本發明鑒于全長A1S_1462蛋白含有一個信號肽，其信號肽對應1~20位的氨基 酸序列，為了在最大限度上保持A1S_1462的結構和功能不發生較大的變化，本發明還提 供了一種融合蛋白，其包含A1S_1462蛋白的成熟肽、其變體或其片段以及標簽蛋白。優 選地，所述標簽蛋白為GST ;優選地，標簽蛋白融合于A1S_1462蛋白的成熟狀的N端。上 述融合蛋白經酶切獲得A1S_1462重組蛋白；優選地，當標簽蛋白為GST時，酶切所用酶為 PreScission protease (PP酶），酶切獲得的A1S_1462重組蛋白在A1S_1462蛋白的成熟肽 N端增加五個氨基酸殘基GPLGS。
[0036] 在另一個方面，本發明涉及編碼本發明的A1S_1462蛋白、融合蛋白及其變體的多 核苷酸以及含有該多核苷酸的載體。
[0037] 可用于插入目的多核苷酸的載體包括但不限于克隆載體和表達載體。在一個實施 方案中，載體是例如質粒，粘粒，噬菌體，柯斯質粒等等。
[0038] 在另一個方面，本發明還涉及包含上述多核苷酸或載體的宿主細胞。此類宿主細 胞包括但不限于，原核細胞例如大腸桿菌細胞，以及真核細胞例如酵母細胞，昆蟲細胞，植 物細胞和動物細胞（如哺乳動物細胞，例如小鼠細胞、人細胞等）。本發明的宿主細胞還可 以是細胞系。
[0039] 本發明提供一種獲得A1S_1462重組蛋白的方法，其包含以下步驟：
[0040] 1.利用重組宿主細胞表達本發明的融合蛋白；
[0041] 2.回收所述融合蛋白；
[0042] 3.對回收的融合蛋白進行酶切，并從酶切產物中回收A1S_1462重組蛋白；
[0043] 優選地，當標簽蛋白為GST時，酶切所用酶為PreScission protease (PP酶）。
[0044] 在一個優選實施方案中，獲得本發明的A1S_1462重組蛋白的方法的步驟（1)還包 括：
[0045] ( i )根據編碼A1S_1462蛋白的核酸序列設計正向引物和反向引物；
[0046] ( ii )使用步驟（i )設計的正向引物和反向引物，通過PCR擴增出編碼A1S_1462 蛋白的基因片段；
[0047] (iii)將步驟（ii )所獲得的基因片段克隆至表達載體，然后轉化至宿主細胞；
[0048] ( iv )誘導轉化后的宿主細胞表達A1S_1462融合蛋白。
[0049] 本發明優選采用pGEX-6p_2質粒來構建重組原核細胞（例如大腸桿菌），表達 A1S_1462融合蛋白，其主要特點是所表達的融合蛋白中的氨基端接有一個26kDa的GST標 簽，該標簽可作為蛋白純化標記。與其他融合載體相比，PGEX系列載體具有純化條件溫和、 步驟簡單、不需要變性劑的加入，從而使純化后的蛋白能最大限度保持其空間構象和免疫 原性。
[0050] 本發明所述正向引物和反向