鮑曼不動桿菌鋅依賴寡肽a1s_1610蛋白及其制備方法和應用【
技術領域：
】[0001]本發明屬于生物
技術領域：
，涉及一種鮑曼不動桿菌A1S_1610蛋白及其在制備鮑曼不動桿菌疫苗中的應用。【
背景技術：
】[0002]鮑曼不動桿菌（Acinetobacterbaumannii)為非發酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界，屬于條件致病菌。廣泛存在于自然界的水及土壤、醫院環境及人體皮膚、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，為條件致病菌。科室分布以ICU最多，其次為呼吸內科患者。感染的病人多是老年患者、危重疾病及機體抵抗力弱的患者，以及使用各種侵入性操作和長期使用廣譜抗生素治療的患者。可引起肺炎、燒傷感染、傷口感染、腦膜炎、尿路感染、腹膜炎、心內膜炎、骨髓炎、關節炎等，并可進一步發展為敗血癥。國內資料表明，鮑曼不動桿菌約占臨床分離的不動桿菌的70%以上。鮑曼不動桿菌對第三代和第四代頭孢菌素的耐藥率已達63.0%~89.9%。對四種氨基糖苷類（阿米卡星、慶大酶素、奈替米星、妥布霉素）和環丙沙星的耐藥率達96.3%。我國目前的絕大多數菌株對亞胺培南、美羅培南、頭孢鮑曼不動桿菌派酮/舒巴坦和多黏菌素B保持敏感，但在呼吸道感染的治療中效果較差。[0003]由于現有抗生素難以有效治療鮑曼不動桿菌感染，且鮑曼不動桿菌引起的感染性疾病也變得日益復雜，近年來醫學界的相關的病原微生物研宄學習者也對鮑曼不動桿菌的預防和治療進行了相關研宄。西班牙MichaelJ.McCnnell等人利用急性膿血癥小鼠模型對鮑曼不動桿菌滅活全菌疫苗的主動免疫和被動免疫兩個方面進行了評價；同時，MichaelJ.McCnnell等人在2011年對鮑曼不動桿菌的外膜蛋白疫苗進行了研宄，結果提示OMC可以刺激T細胞分泌IFN-γ及活化Thl及Th2輔助B細胞分泌IgG抗體，均對小鼠具有良好的免疫保護性。但是由于全菌疫苗為傳統疫苗，其所含疫苗成分復雜，且具有一定的毒副作用，因此安全性不高。外膜復合物疫苗成分復雜，同時含有大量的內毒素，對機體的毒副作用較大，因此研發一種質量可控，安全有效的鮑曼不動桿菌疫苗是必然的趨勢。【
發明內容】[0004]本發明提供一種鮑曼不動桿菌A1S_1610蛋白或其變體，所述A1S_1610蛋白具有如SEQIDNO.1、SEQIDNO.3或SEQIDNO.5所示的氨基酸序列；優選地，其氨基酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.3或SEQIDNO.5所示。然而，本領域技術人員理解，可在SEQIDN0:l、3或5中天然產生或人工引入突變或變異（包括但不限于，置換，缺失和/或添加），而不影響A1S_1610的生物學特性。因此，在本發明中，術語"A1S_1610"意欲包括全長A1S_1610蛋白、其成熟肽和其變體，包括SEQIDNO:1、3或5所示的多肽以及其天然或人工的變體，所述變體保留了A1S_1610的生物學特性，即，具有強免疫原性。并且，當描述A1S_1610的序列片段時，其不僅包括SEQIDNO:1、3或5所示的多肽的序列片段，還包括該多肽的天然或人工變體中的相應序列片段。[0005]根據本發明，當在蛋白/多肽的背景中使用時，術語"變體"是指這樣的蛋白，其氨基酸序列與參照蛋白/多肽（例如，本發明的A1S_1610蛋白）的氨基酸序列具有一個或多個（例如1-10個或1-5個或1-3個）氨基酸差異（例如，保守氨基酸置換），或者具有至少60%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或99%的同一性，并且其保留了參照蛋白/多肽的必要特性。在本發明中，蛋白/多肽（例如，本發明的A1S_1610蛋白）的必要特性可以指，具有強免疫原性。[0006]根據本發明，術語"同一性"用于指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的匹配情況。當兩個進行比較的序列中的某個位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據時（例如，兩個DNA分子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤占據，或兩個多肽的每一個中的某個位置都被賴氨酸占據），那么各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的"百分數同一性"是由這兩個序列共有的匹配位置數目除以進行比較的位置數目XlOO的函數。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性（總共6個位置中有3個位置匹配）。通常，在將兩個序列比對以產生最大同一性時進行比較。這樣的比對可通過使用，例如，可通過計算機程序例如Align程序（DNAstar,Inc.)方便地進行的Needleman等人（1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法來實現。還可使用已整合入ALIGN程序（版本2.0)的E.Meyers和W.MiIler(Comput.ApplBiosci.,4:11-17(1988))的算法，使用PAM120權重殘基表(weightresiduetable)、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定兩個氨基酸序列之間的百分數同一1性。此外，可使用已整合入GCG軟件包（可在www.gcg.com上獲得）的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權重（gapweight)和1、2、3、4、5或6的長度權重來測定兩個氨基酸序列之間的百分數同一性。[0007]如本文中使用的，術語"保守置換"意指不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物學活性的氨基酸置換。例如，可通過本領域內已知的標準技術例如定點誘變和PCR介導的誘變引入保守置換。保守氨基酸置換包括用具有相似側鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的置換，例如用在物理學上或功能上與相應的氨基酸殘基相似（例如具有相似大小、形狀、電荷、化學性質，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等）的殘基進行的置換。已在本領域內定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側鏈（例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸）、酸性側鏈（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不帶電荷的極性側鏈（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非極性側鏈（例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、β分支側鏈（例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和芳香族側鏈（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）的氨基酸。因此，優選用來自相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基替代相應的氨基酸殘基。鑒定氨基酸保守置換的方法在本領域內是熟知的（參見，例如，Brmiimell等人，Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA94:412_417(1997)，其通過引用并入本文）。[0008]根據本發明，AlS_1610蛋白與其他蛋白的連接可包括例如融合和綴合等。特別地，A1S_1610蛋白可通過接頭與其他蛋白連接。根據本發明，術語"接頭"是指用于連接兩個分子（例如蛋白）的短肽。通常，通過將編碼該短肽的多核苷酸序列引入（例如，通過PCR擴增或連接酶）分別編碼所要連接的兩種目的蛋白的2個DNA片段之間，并進行蛋白質表達來獲得融合蛋白，例如目的蛋白1-接頭-目的蛋白2。如本領域技術人員公知的，接頭包括但不限于柔性連接肽，例如Gly-Gly-Gly-Gly，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，Gly-Gly-Ser-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3〇[0009]根據本發明，術語"免疫原性（immunogenicity)"是指，能夠刺激機體形成特異抗體或致敏淋巴細胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫細胞，使免疫細胞活化、增殖、分化，最終產生免疫效應物質如抗體和致敏淋巴細胞的特性，也指抗原刺激機體后，機體免疫系統能形成抗體或致敏T淋巴細胞的特異性免疫應答。[0010]在本發明中，氨基酸通常用本領域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。[0011]在本發明中，術語"多肽"和"蛋白質"具有相同的含義，可互換使用。[0012]本發明鑒于全長A1S_1610蛋白含有一個信號肽，其信號肽對應1~31位的氨基酸序列，為了在最大限度上保持A1S_1610的結構和功能不發生較大的變化，本發明還提供了一種融合蛋白，其包含A1S_1610蛋白的成熟肽、其變體或其片段以及標簽蛋白。優選地，所述標簽蛋白為GST;優選地，標簽蛋白融合于A1S_1610蛋白的成熟狀的N端。上述融合蛋白經酶切獲得A1S_1610重組蛋白；優選地，當標簽蛋白為GST時，酶切所用酶為PreScissionprotease(PP酶），酶切獲得的A1S_1610重組蛋白在A1S_1610蛋白的成熟肽N端增加五個氨基酸殘基GPLGS。[0013]在另一個方面，本發明涉及編碼本發明的A1S_1610蛋白、融合蛋白及其變體的多核苷酸以及含有該多核苷酸的載體。[0014]可用于插入目的多核苷酸的載體是本領域公知的，包括但不限于克隆載體和表達載體。在一個實施方案中，載體是例如質粒，粘粒，噬菌體，柯斯質粒等等。[0015]在另一個方面，本發明還涉及包含上述多核苷酸或載體的宿主細胞。此類宿主細胞包括但不限于，原核細胞例如大腸桿菌細胞，以及真核細胞例如酵母細胞，昆蟲細胞，植物細胞和動物細胞（如哺乳動物細胞，例如小鼠細胞、人細胞等）。本發明的宿主細胞還可以是細胞系。[0016]本發明提供一種獲得A1S_1610重組蛋白的方法，其包含以下步驟：[0017](1)利用重組宿主細胞表達本發明的融合蛋白；[0018](2)回收所述融合蛋白；[0019](3)對回收的融合蛋白進行酶切，并從酶切產物中回收A1S_1610重組蛋白；[0020]優選地，當標簽蛋白為GST時，酶切所用酶為PreScissionprotease(PP酶）。[0021]在一個優選實施方案中，獲得本發明的A1S_1610重組蛋白的方法的步驟（1)還包括：[0022](i)根據編碼A1S_1610蛋白的核酸序列設計正向引物和反向引物；[0023](ii)使用步驟（i)設計的正向引物和反向引物，通過PCR擴增出編碼A1S_1610蛋白的基因片段；[0024](iii)將步驟（ii)所獲得的基因片段克隆至表達載體，然后轉化至宿主細胞；[0025](iv)誘導轉化后的宿主細胞表達A1S_1610融合蛋白。[0026]本發明優選采用pGEX-6p_2質粒來構建重組原核細胞（例如大腸桿菌），表達A1S_1610融合蛋白，其主要特點是所表達的融合蛋白中的氨基端接有一個26kDa的GST標簽，該標簽可作為蛋白純化標記。與其他融合載體相比，PGEX系列載體具有純化條件溫和、步驟簡單、不需要變性劑的加入，從而使純化后的蛋白能最大限度保持其空間構象和免疫原性。[0027]優選地，本發明設計的正向引物和反向引物的核苷酸序列分別示于SEQIDNO.7和SEQID勵.8，所使用的宿主細胞為大腸桿菌乂當前第1頁1 2