用于防治白蟻的內生菌混合生物發酵產物的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種防治白蟻的生物發酵產物的制備方法。
【背景技術】
[0002] 白蟻是極具破壞性的害蟲，世界范圍內均有分布，被列為世界性的五大害蟲之一。 白蟻的危害無孔不入、無處不在，造成巨大的經濟損失，且其繁殖速度快、活動隱蔽。生物防 治法是利用病原微生物或者內生菌生物發酵代謝產物來防治白蟻的一種方法，該法具有高 效、無污染、成本低等特性，現已成為白蟻防治的主要方法。植物內生菌生物發酵代謝產物 可以促進植物生長、提高植物抗逆性、抗蟲害，為獲得天然產物及開發新藥提供了一個巨大 的生物資源庫。
[0003] 我國多年來一直用氯丹、滅蟻靈等有機氯農藥來防治白蟻，由于有機氯農藥對環 境的污染和對人類健康的危害，一些國家已經相繼禁用，而我國尚未有良好的替代品。因 此，迫切需要有高效、低毒、對環境影響小且相對比較經濟的殺蟲劑來改善我國目前白蟻防 治現狀。
【發明內容】
[0004] 本發明是要解決現有防治白蟻的化學藥劑對環境和人類危害大，防治效果較差的 問題，提供用于防治白蟻的內生菌混合生物發酵產物的制備方法。
[0005] 本發明用于防治白蟻的內生菌混合生物發酵產物的制備方法，按以下步驟進行：
[0006] -、菌株的活化：挑取解藻朊類芽孢桿菌HDZK-BYB36轉接到牛肉膏蛋白胨固體斜 面培養基中，于37°C恒溫培養24h;挑取枯草芽孢桿菌HUB-I-47轉接到牛肉膏蛋白胨固體 斜面培養基中，于37 °C恒溫培養24h;
[0007] 二、挑取步驟一活化后的解藻朊類芽孢桿菌HDZK-BYB36轉接到含有50mL牛肉膏 蛋白胨液體培養基的250mL培養瓶中，于170~180r/min、37°C回轉式搖床中培養18~ 24h，得解藻朊類芽孢桿菌種子液；挑取步驟一活化后的枯草芽孢桿菌HUB-I-47轉接到含 有50mL牛肉膏蛋白胨液體培養基的250mL培養瓶中，于170~180r/min、37°C回轉式搖床 中培養18~24h，得枯草芽孢桿菌種子液；
[0008] 三、將步驟二制得的解藻朊類芽孢桿菌種子液和枯草芽孢桿菌種子液等體積混合 后，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中進行混合發酵培養24~36h;
[0009] 四、發酵結束后，于5000r/min離心10~15min，使菌體和發酵液分開，得到發酵 液；
[0010] 五、從步驟四獲得的發酵液中分離出能夠高效毒殺白蟻的發酵代謝產物。
[0011] 本發明的有益效果：
[0012] 本發明采用微生物發酵法生產抗白蟻藥劑，以此種生物藥劑代替現有的以化學藥 劑為主的抗白蟻藥劑，既達到了防治白蟻的目的，又避免了環境污染。本發明內生菌混合生 物發酵代謝產物防治白蟻的方法中樹木內生菌代謝產物對白蟻腸道菌有較好的抑制作用， 發酵代謝產物濃度為lOmg/mL和20mg/mL時，2~3d后，其白蟻死亡率（p< 0. 05)為100 %。 本發明制備的發酵代謝產物對白蟻也有顯著的殺滅作用。本發明具有高效、無污染、成本低 等特性。
【具體實施方式】
[0013] 本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
【具體實施方式】 [0014] 一：本實施方式用于防治白蟻的內生菌混合生物發酵產物的制備方 法，按以下步驟進行：
[0015] -、菌株的活化：挑取解藻朊類芽孢桿菌HDZK-BYB36轉接到牛肉膏蛋白胨固體斜 面培養基中，于37°C恒溫培養24h;挑取枯草芽孢桿菌HUB-I-47轉接到牛肉膏蛋白胨固體 斜面培養基中，于37 °C恒溫培養24h;
[0016] 二、挑取步驟一活化后的解藻朊類芽孢桿菌HDZK-BYB36轉接到含有50mL牛肉膏 蛋白胨液體培養基的250mL培養瓶中，于170~180r/min、37°C回轉式搖床中培養18~ 24h，得解藻朊類芽孢桿菌種子液；挑取步驟一活化后的枯草芽孢桿菌HUB-I-47轉接到含 有50mL牛肉膏蛋白胨液體培養基的250mL培養瓶中，于170~180r/min、37°C回轉式搖床 中培養18~24h，得枯草芽孢桿菌種子液；
[0017] 三、將步驟二制得的解藻朊類芽孢桿菌種子液和枯草芽孢桿菌種子液等體積混合 后，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中進行混合發酵培養24~36h;
[0018] 四、發酵結束后，于5000r/min離心10~15min，使菌體和發酵液分開，得到發酵 液；
[0019] 五、從步驟四獲得的發酵液中分離出能夠高效毒殺白蟻的發酵代謝產物。
[0020] 本實施方式中解藻朊類芽孢桿菌HDZK-BYB36為解藻朊類芽孢桿菌 (Paenibacillusaliginolyticus)HDZK-BYB36,已在中文專利 201310192221. 9 中公開。
[0021] 枯草芽抱桿菌HUB-I-47為枯草芽抱桿菌新亞種（Bacillussubtitissubsp. virginianasubsp.nov)HUB-I_47,已在中文專利 201110261415. 0 中公開。
【具體實施方式】 [0022] 二：本實施方式與一不同的是：步驟三中混合發酵培 養的條件為：時間為24~36h，培養溫度為30~32°C，搖床轉速為170~180r/min。其它 與一相同。
【具體實施方式】 [0023] 三：本實施方式與一不同的是：步驟三中混合發酵培 養的條件為：時間為24h，培養溫度為31°C，搖床轉速為175r/min。其它與一 相同。
【具體實施方式】 [0024] 四：本實施方式與一至三之一不同的是：步驟三中牛 肉膏蛋白胨液體培養基的初始pH為7~8。其它與一至三之一相同。
【具體實施方式】 [0025] 五：本實施方式與一至三之一不同的是：步驟三中牛 肉膏蛋白胨液體培養基的初始pH為7. 5。其它與一至三之一相同。
【具體實施方式】 [0026] 六：本實施方式與一至五之一不同的是：步驟三中將 解藻朊類芽孢桿菌種子液和枯草芽孢桿菌種子液混合接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中 的接種量為4%。其它與一至五之一相同。
【具體實施方式】 [0027] 七：本實施方式與一至六之一不同的是：步驟三中牛 肉膏蛋白胨液體培養基在500mL培養瓶中的裝液量為100mL。其它與一至六 之一相同。
[0028] 為驗證本發明的有益效果，進行以下試驗：
[0029] 實施例1 :
[0030] 本實施例用于防治白蟻的內生菌混合生物發酵產物的制備方法，按以下步驟進 行：
[0031] -、菌株的活化：挑取解藻朊類芽孢桿菌HDZK-BYB36轉接到牛肉膏蛋白胨固體斜 面培養基中，于37°C恒溫培養24h;挑取枯草芽孢桿菌HUB-I-47轉接到牛肉膏蛋白胨固體 斜面培養基中，于37 °C恒溫培養24h;
[0032] 二、挑取步驟一活化后的解藻朊類芽孢桿菌HDZK-BYB36轉接到含有50mL牛肉膏 蛋白胨液體培養基的250mL培養瓶中，于175r/min、37°C回轉式搖床中培養22h，得解藻朊 類芽孢桿菌種子液；挑取步驟一活化后的枯草芽孢桿菌HUB-I-47轉接到含有50mL牛肉膏 蛋白胨液體培養基的250mL培養瓶中，于175r/min、37°C回轉式搖床中培養22h，得枯草芽 孢桿菌種子液；
[0033] 三、將步驟二制得的解藻朊類芽孢桿菌種子液和枯草芽孢桿菌種子液等體積混合 后，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中進行混合發酵培養4d;
[0034] 四、發酵結束后，于5000r/min離心15min，使菌體和發酵液分開，得到發酵液；
[0035] 五、從步驟四獲得的發酵液中分離出能夠高效毒殺白蟻的發酵代謝產物。
[0036] 1、發酵液浸膏的制備
[0037] (1)將有機溶劑乙酸乙酯和菌體發酵液以等體積（V/V)比例混合裝入500mL三角 瓶中，于室溫、120r/min萃取24h。萃取結束后，將混合液倒入分液漏斗中，靜止15min后出 現明顯分層，分成有機相和水相，收集有機相待濃縮。
[0038] (2)將上一步得到的水相與正己烷以等體積（V/V)比例混合裝入500mL三角瓶中， 于室溫、120r/min萃取24h。萃取結束后，將混合液倒入分液漏斗中，靜止15min后出現明 顯分層，分成有機相和水相，收集有機相待濃縮。
[0039] (3)萃取后的有機溶劑萃取物在40°C條件下減壓蒸餾濃縮，用5-10mL的正己烷將 粗提物洗下并保存到密封的離心管中，稱重并記錄浸膏質量，4°C冰箱保存。
[0040] 2、微生物混合發酵代謝產物初步分離
[0041] ⑴裝柱
[0042] ①稱取200-300目的柱層析硅膠Ikg置于IKTC烘箱中活化0. 5-lh。
[0043] ②用石油醚浸泡活化好的硅膠，攪拌使硅膠變成勻漿