專利名稱：一種利用混菌發酵生產生物腐植酸的方法
技術領域：
本發明屬于應用微生物領域，更具體涉及一種利用混菌發酵生產生物腐植酸的方法。
背景技術：
天然腐植酸主要存在于土壤、河泥、海洋沉積物、褐煤和風化煤之中，由死亡的動植物殘體經長期生物化學或地球物理化學作用后生成。目前國內腐植酸的生產大多采用不同腐植化程度的有機物料，例如泥炭、褐煤、風化煤等，通過酸堿抽提法提取，提取率低，得到的是礦物腐植酸，其活性腐植酸——黃腐酸含量低，且不含有益菌。國外至今還沒有生物 (或礦物)腐植酸的生產企業和產品。在上個世紀九十年代初，我國華北曾有人通過秸桿粉渣堆慪法制造出腐植酸類物質，曾引起科學界轟動，被稱作是“師法自然，超越自然”，由此開辟了中國特色的腐植酸新行業一生物黃腐酸行業；但由于一直沿用土法堆慪工藝，產量低、產品質量不穩定，而且產品又再通過化工工藝提取黃腐酸，因而喪失了產品中的重要成分——有益微生物。到目前為止，我國生物腐植酸行業還處于初級階段，未能形成對腐植酸工業的重大影響，更未能發揮其在國民經濟發展和生態環保方面的應有影響力。我國華北地區(主要是河北省)是生物黃腐酸的發源地，現有中試規模(年產干物質500噸以下)企業5-6家。 但這些廠還是人工堆建發酵法，產量低、產品質量不穩定，某些生產環節(如發酵、干燥)仍依賴于自然條件。福建省詔安縣綠洲生化有限公司采用自然菌群復合發酵甘蔗渣生產生物腐植酸， 不但產品中含有黃腐酸，而且保留了有益菌，使產品功能更趨完善。但由于采用自然菌群發酵，菌種缺乏科學的培育和管理，容易發生變異、衰退和死亡，影響了產品質量和產量；而且發酵生產等工藝條件還有待于進一步改進。中國腐植酸工業協會和專家學者十分重視生物腐植酸行業的發展，一直關注該行業新成果新技術。近年來，多次提倡該行業應規模化、機械化，應以定向菌種提升產品功能， 實現生物腐植酸的產業化生產。
發明內容
本發明提供了一種利用混菌發酵生產生物腐植酸的方法，該方法通過選育和開發優良生產菌種，提升生物腐植酸產品的產量和質量。為了實現上述目的，本發明采取的技術方案為利用枯草芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌混合菌株固體發酵生產生物腐植酸。其中所述固體發酵的發酵培養基的主要成分為蔗渣與麩皮。發酵培養基中蔗渣與麩皮的比例為1:廣1. 5:1 (w/w)0枯草芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌的比例為2:1 (ν/ν)。枯草芽孢桿菌菌懸液和多粘類芽孢桿菌菌懸液的細胞濃度均控制在108cfu/mL。
枯草芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌的總接種量為10% 14%，該百分比為兩種菌懸液的總體積量占發酵培養基重量的比例。所述固體發酵的發酵條件為發酵培養基初始pH為壙5. 5，發酵溫度5(T55°C。所述固體發酵的發酵工藝為發酵培養基初始pH5. 5、發酵培養基中蔗渣與麩皮的比例為1.5:1、混菌的總接種量12%、發酵溫度55°C。本發明以糖廠蔗渣為原料，利用枯草芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌混合固體發酵生產生物腐植酸。枯草芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌的比例為2:1 (各種菌細胞濃度控制在 108cfu/mL)，兩種菌總接種量為10% 14% (v/w)；發酵條件發酵培養基中蔗渣與麩皮的比例為1:廣1.5:1，培養基初始pH為4 5.5，發酵溫度5(T55°C。在此條件下發酵6d，活性腐植酸(黃腐酸)產量增長了 69. 97%。本發明的顯著優點以糖廠蔗渣為原料，變廢為寶，實現企業資源的再利用，體現了循環經濟的發展原則，為我國一大批大中型糖廠的綜合利用技術改造開辟了一條新路子；通過選育和開發優良生產菌種、采用混菌固體發酵生產工藝，提升生物腐植酸產品的生產能力與質量水平，所生產的生物腐植酸產品中不僅富含活性腐植酸(黃腐酸)，而且含有益生菌，為實現生物腐植酸的產業化生產打下基礎。
具體實施例方式
1、優良生產菌種的篩選鑒定
對從自然界篩選得到的7株細菌(從甘蔗田土壤、稻田土壤、稻草秸稈堆肥、腐爛樹根、 食用菌栽培基質等地篩選獲得)進行發酵產腐植酸能力的比較，得到4株優良生產菌株A、 B、C和D,黃腐酸產量的增長率分別為18. 36%、16. 20%、15. 86%和12. 23%。取產腐植酸能力較強的這4株菌，進行不同的搭配組合(即AB、AC、AD、BC、BD、CD)， 測定發酵后不同組合的黃腐酸產量增長率。結果表明，AB組合的發酵效果最好，黃腐酸產量的增長率為28. 85% (表1);且當菌種比例A:B=2:1時，黃腐酸產量的增長率最高，為32. 28% (表 2)。表1不同菌種組合對黃腐酸產量的影響
備注黃腐酸產量增長率％ =(發酵產品的黃腐酸含量-發酵前培養基的黃腐酸含量) /發酵前培養基的黃腐酸含量
表2 AB菌種不同比例對黃腐酸產量的影響
對A、B菌種進行16s rDNA序列分析并結合生理生化鑒定，確定A、B菌種分別為枯草芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌，菌株保存于福州大學生物科學與工程學院。
2、發酵培養基優化
在原有工廠發酵培養基中，蔗渣與麩皮的總含量占95%左右，是影響腐植酸產量的主要成分。考察蔗渣與麩皮不同比例(2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2)對黃腐酸產量的影響，結
4果表明，當蔗渣與麩皮的比例為1:1時，黃腐酸產量的增長率最大，為38. 13% (表3)。
表3蔗渣與麩皮不同配比對黃腐酸產量的影響
權利要求
1.一種利用混菌發酵生產生物腐植酸的方法，其特征在于利用枯草芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌固體發酵生產生物腐植酸。
2.根據權利要求1所述的利用混菌發酵生產生物腐植酸的方法，其特征在于所述固體發酵的發酵培養基的主要成分為蔗渣與麩皮。
3.根據權利要求2所述的利用混菌發酵生產生物腐植酸的方法，其特征在于發酵培養基中蔗渣與麩皮的比例為1:1 1.5:1 (w/w)0
4.根據權利要求1所述的利用混菌發酵生產生物腐植酸的方法，其特征在于枯草芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌的比例為2:1 (ν/ν)。
5.根據權利要求1所述的利用混菌發酵生產生物腐植酸的方法，其特征在于枯草芽孢桿菌菌懸液和多粘類芽孢桿菌菌懸液的細胞濃度均控制在108cfu/mL。
6.根據權利要求1所述的利用混菌發酵生產生物腐植酸的方法，其特征在于枯草芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌的總接種量為10% 14%，該百分比為兩種菌懸液的總體積量占發酵培養基重量的比例。
7.根據權利要求1所述的利用混菌發酵生產生物腐植酸的方法，其特征在于所述固體發酵的發酵條件為發酵培養基初始PH為4-5. 5，發酵溫度50 55°C。
8.根據權利要求1-7中任一條所述的利用混菌發酵生產生物腐植酸的方法，其特征在于所述固體發酵的發酵工藝為發酵培養基初始PH5. 5、發酵培養基中蔗渣與麩皮的比例為1. 5:1、混菌的總接種量12%、發酵溫度550C 0
全文摘要
本發明提供了一種利用混菌發酵生產生物腐植酸的方法。該方法利用枯草芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌固體發酵生產生物腐植酸。本發明通過選育和開發優良生產菌種、采用混菌固體發酵生產工藝，提升生物腐植酸產品的生產能力與質量水平，所生產的生物腐植酸產品中不僅富含活性腐植酸(黃腐酸)，而且含有益生菌，為實現生物腐植酸的產業化生產打下基礎。
文檔編號C12R1/12GK102174583SQ201110042008
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月22日 優先權日2011年2月22日
發明者李殿殿, 李自然, 林娟 申請人:福州大學