肽的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及來自蛋白脂質蛋白（PLP)的肽。具體地，本發明涉及包含衍生自PLP 的一個親水區段的肽，其能夠與MHC分子體外結合并被呈遞給T細胞而無須抗原加工。本 申請還涉及該肽在治療和/或預防疾病中的用途。
【背景技術】
[0002] 多發性硬化（MS)是影響中樞神經系統的慢性退行性疾病，特征在于神經軸突的 脫髓鞘。MS會造成眾多生理和精神癥狀，并且通常發展為生理缺陷和認知功能障礙。疾病 通常在年輕人（20至40歲）中發病，在女性中更常見，并且在世界范圍內影響超過一百萬 人。
[0003] MS的病程各不相同，并且會潛伏或隨時間穩步發展。已根據進展模式描述了MS的 幾種亞型。患有MS的人會患有幾乎任何神經癥狀或跡象，包括知覺變化，如喪失敏感度或 發麻、刺痛或麻痹（感覺遲鈍和感覺異常）、肌肉虛弱、陣攣、肌肉痙攣或移動困難；協調和 平衡困難（共濟失調）；語言問題（構音障礙）或吞咽問題（吞咽困難）、視覺問題（眼球 震顫、視神經炎（包括光幻視）或復視）、疲勞、急性或慢性疼痛以及膀胱和腸困難。
[0004] 目前MS被認為是免疫介導性病癥，其中人體自身的免疫系統攻擊并損傷了髓鞘 質。
[0005] 沒有已知的針對MS的治愈方法。已證明，幾種現有療法在疾病侵襲（復發）后的 功能恢復中、在預防或降低新的疾病侵襲（復發）的程度或頻率中、或者在預防或降低殘疾 程度中是有效的。然而，很多現有MS療法有副作用或耐受不良。因而需要對能有效治療MS 并有效緩解或減少MS的癥狀的MS替代療法。
【發明內容】
[0006] 本發明人已確定了一系列衍生自蛋白脂質蛋白（PLP)的肽，所述肽可以通過固定 的抗原呈遞細胞呈遞給T細胞。這些肽可有效預防和/或治療脫髓鞘疾病，如多發性硬化。
[0007] 因此，在第一方面，本發明提供了能夠與MHC分子體外結合并被呈遞給T細胞而無 需抗原加工的肽，且所述肽包含以下蛋白脂質蛋白（PLP)區段的全部或一部分：
[0028] 在第二方面，本發明提供了根據本發明的第一方面的肽，其用于治療和/或預防 脫髓鞘疾病。
[0029] 在第三方面，本發明提供了包含一種或多種根據本發明的第一方面的肽的藥物組 合物。
[0030] 在第四方面，本發明提供了治療和/或預防有此需要的受試者中的脫髓鞘疾病的 方法，所述方法包含向所述受試者給藥根據本發明的第一方面所述的肽的步驟。
[0031] 在第五方面，本發明涉及根據本發明的第一方面的肽在制造用于預防和/或治療 脫髓鞘疾病的藥物中的用途。
[0032] 與本發明的第二、第四和第五方面有關，所述疾病可為多發性硬化。
【附圖說明】
[0033] 圖1 _圖1 :三種PLP肽區段在體外和體內產生應答，以及所述應答與DR結合預測 相關。A，大體上代表計算機模擬的PLP肽與HLA-DRB1*1501的結合預測（IEDB和NetMHCII 法），以及這些肽在這些小鼠中誘導增殖應答的能力。B和C代表這些長肽中的4種誘導 EAE的能力（2組獨立實驗）。
[0034]圖2-確定HEAL-26中的apitope。
[0035]圖3-確定TWTT-28中的apitope。
[0036]圖4-確定GVLP-28中的apitope。
[0037] 圖5 -誘導耐受性（tolerisation)方案。
[0038] 圖6-來自用HEAL-26或P0P-4預處理的小鼠的LNC的增殖和細胞因子生成。A， 代表來自用HEAL-26或P0P-4apitope預處理小鼠的LNC的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-標 準誤差（SM)。
[0039] 圖7-來自用HEAL-26或P0P-4預處理的小鼠的SPL的增殖和細胞因子生成。A，代 表來自用HEAL-26或P0P-4apitope預處理小鼠的SPL的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0040] 圖8 -來自用TWTT-28預處理的小鼠的LNC的增殖和細胞因子生成。A，代表來自 用TWTT-28apitope預處理小鼠的LNC的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0041] 圖9 -來自用TWTT-28預處理的小鼠的SPL的增殖和細胞因子生成。A，代表來自 用TWTT-28apitope預處理小鼠的SPL的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0042] 圖10_來自用POP-15預處理的小鼠的LNC的增殖和細胞因子生成。A，代表來自 用P0P-15apitope預處理小鼠的LNC的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0043] 圖11_來自用P0P-15預處理的小鼠的SPL的增殖和細胞因子生成。A，代表來自 用P0P-15apitope預處理小鼠的SPL的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0044] 圖12-來自用P0P-22預處理的小鼠的LNC的增殖和細胞因子生成。A，代表來自 用P0P-22apitope預處理小鼠的LNC的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0045] 圖13-來自用P0P-22預處理的小鼠的SPL的增殖。A，代表來自用P0P-22apitope 預處理小鼠的SPL的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0046] 圖14 -來自用P0P-22或GVLP-28預處理的小鼠的LNC的增殖和細胞因子生成。 A，代表來自用P0P-22(左圖）或GVLP-28(右圖）apitope預處理小鼠的LNC的胸腺嘧啶核 苷摻入的均值+/-SEM。
[0047] 圖15-用P0P-22或GVLP-28預處理的小鼠的SPL的增殖和細胞因子生成。A，代表 來自用P0P-22或GVLP-28apitope預處理小鼠的SPL的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0048] 對于圖6至15的每張圖，B，表示胸腺嘧啶核苷摻入的刺激指數。C，表示在培養物 上清液中分泌的細胞因子的量。在B和C中，每劑量的每個點表示單只小鼠，而帶橫杜的表 示中值。P是用Mann-Whitney檢驗計算的。僅顯示了低p值。小于0. 05的p值被認為是 顯著的。
【具體實施方式】
[0049] 在第一方面，本發明涉及肽。
[0050]肽
[0051] 術語"肽"根據其標準含義是用來指一系列殘基（通常為L-氨基酸），通常通過 a_氨基和相鄰氨基酸的羧基之間的肽鍵彼此相連。該術語包括修飾的肽和合成的肽類似 物。
[0052] 本發明的肽的長度為能夠與主要組織相容性復合體（MHC)I類或II類分子體外結 合并被呈遞給T細胞而無需抗原加工。換句話說，該肽能夠直接與MHC分子的肽結合槽結 合而無需在一個端點或兩個端點進行任何修剪。
[0053] 與MHCI類分子結合的肽通常為7至13個氨基酸、更通常地為8至10個氨基酸 的長度。該肽的結合通過以下方式在其兩個端點得到穩定，所述方式為肽的主鏈原子與所 有MHCI類分子的肽結合槽內的非可變位點之間的接觸。在所述槽的兩個端點處都具有非 可變位點，其與肽的氨基和羧基末端結合。肽長度的變化通過肽主鏈的卷曲來調節，通常在 允許所需柔性的脯氨酸或甘氨酸殘基處發生。
[0054] 與MHCII類分子結合的肽通常為8至20個氨基酸之間的長度，更通常地為10至 17個氨基酸之間的長度，并且可以更長。這些肽以沿著兩端開放的MHCII肽結合槽（與 MHCI類肽結合槽不同）伸展的構象存在。主要通過主鏈原子與排列形成肽結合槽的保守 殘基接觸而使肽維持在合適的位置。
[0055] 本發明的肽可以通過化學方法制備（PeptideChemistry,Apractical Textbook.MikosBodansky,Springer-Verlag,Berlin.)。例如，可以通過固相技術合成 肽（RobergeJY等人（1995)Science269:202-204)，從樹脂上切除，并通過制備性高效液 相色譜純化（如Creighton(1983)ProteinsStructuresAndMolecularPrinciples,WH FreemanandCo,NewYorkNY)。例如，根據制造商提供的說明書使用ABI431A肽合成儀 (PerkinElmer)可實現自動合成。
[0056] 或者，可通過重組方式、或通過從更長的多肽上切除來制備所述肽。例如，可以通 過從髓鞘蛋白脂質蛋白上切除來獲得所述肽。肽的組成可通過氨基酸分析或測序來確定 (如Edman降解法）。
[0057] 髓鞘蛋白脂質蛋白（PLP)
[0058] 髓鞘質是非傳導性（電絕緣）材料，其形成層即髓鞘，該層通常僅環繞神經元的 軸突。其對于神經系統發揮正常功能十分重要。組成髓鞘質的一些蛋白為髓鞘堿性蛋白 (MBP)、髓鞘少突膠質細胞糖蛋白（MOG)和蛋白脂質蛋白（PLP)。
[0059] 髓鞘蛋白脂質蛋白（PLP)，即中樞神經系統（CNS)髓鞘質中最豐富的蛋白，是疏水 性完整膜蛋白。
[0060] 人類PLP序列如SEQIDNo. 16中所示。
[0061] SEQIDNo. 16
[0067] 本發明的肽可衍生自PLP序列的親水區段。所述肽可衍生自經抗原呈遞細胞對抗 原天然加工而產生的抗原片段。
[0068] PLP的親水區段為：
[0099] 所述肽可包含來自這些肽中的一種的最小表位。
[0100] 具體地，所述肽可包含以下中的一種、由以下中的一種組成或包含以下中的一種 的最小表位：
[0105] 在適應性免疫應答中，T淋巴細胞能夠識別蛋白質抗原的內在表位。抗原呈遞細 胞（APC)吸收蛋白抗原并將它們降解成短的肽片段。肽可與細胞內的主要組織相容性復合 體（MHC)I類或II類分子結合并被轉運至細胞表面。當與MHC分子一起被呈遞至細胞表面 時，該肽可被T細胞識別（通過T細胞受體（TCR))，在這種情況下該肽為T細胞表位。
[0106]T細胞表位在對任何抗原（無論是自身的或外來的）的適應性免疫應答中扮演了 重要的角色。已通過使用實驗模型證實了T細胞表位在超敏性疾病（包括過敏、自身免疫 性疾病和移植排斥）中扮演的重要角色。通過注射與佐劑組合的合成肽（基于T細胞表位 的結構）可以誘導炎癥性或過敏性疾病。
[0107] 相比之下，已顯示可以通過給藥可溶形式的肽表位來誘導對特定肽表位 的免疫耐受。在實驗性自身免疫腦脊髓炎（EAE--種多發性硬化（MS)的模型） (Metzler和Wraith(1993)Int.Immunol.5:1159-1165;Liu和Wraith(1995)Int. Immunol. 7:1255-1263;Anderton和Wraith(1998)