專利名稱：肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及甲狀旁腺激素(PTH)和甲狀旁腺激素相關肽(PTHrP)化合物，它們的制備方法，含有它們的藥物制劑以及將其作為藥物的應用。
具體而言，本發明提供了在PTH/PTHrP受體處具有有效的拮抗活性的PTH或PTHrP化合物，其中天然存在于第2位和第10位上的至少一個氨基酸殘基被色氨酸或被在其側鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個氨基酸殘基取代，并且任意地天然存在于第3位和第6位上的至少一個氨基酸殘基被色氨酸或被在其側鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個氨基酸殘基進一步取代，這些化合物均為本發明化合物。
在本發明的具體實施方案中提供了PTH或PTHrP化合物，其中天然存在于第10位上的氨基酸殘基被色氨酸或被在其側鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個氨基酸殘基取代，并且任意地天然存在于第3位和第6位上的至少一個氨基酸殘基被色氨酸或被在其側鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個氨基酸殘基進一步取代。
術語“PTHrP”指任一天然存在形式的PTHrP，例如人、牛、雞、鼠或小鼠PTHrP。為保持一致性并遵照常規方式，下述說明書中，對PTHrP序列中的氨基酸殘基使用同一編號體系，而不考慮本發明PTHrP序列中任一α-氨基酸殘基是否被取代或缺失。
術語“PTH”指任一天然存在形式的PTH，例如人、牛、雞、鼠或小鼠PTH。為保持一致性并遵照常規方式，下述說明書中，對PTH序列中的氨基酸殘基使用同一編號體系，而不考慮本發明PTH序列中的任一α-氨基酸殘基是否被取代或缺失。
“PTHrP化合物”或“PTH化合物”分別指包含基于PTHrP或PTHN-末端片段的氨基酸序列的肽，優選所基于的PTHrP或PTH片段始于第1-7位的任一殘基，終止于第27-38位的任一殘基，例如其為包含達31、34、35、36、37或38位氨基酸殘基的PTHrP或PTHN-末端片段。由此認為術語“PTHrP或PTH”包括這樣的肽，其中所述N-末端片段的一個或多個氨基酸殘基缺失，優選在N末端缺失。根據本發明，我們認為這些術語還包括這樣的肽，其中除了第2位和/或第10位上的取代以及任意地在第3和/或第6位上的取代外，天然存在序列的一個或多個氨基酸殘基被一個或多個其它氨基酸殘基(天然或非天然的)取代。人PTHrP1-38、1-34和1-31N-末端片段序列分別示于SEQ IDNo1、2或3。
人PTH1-38、1-34和1-31N-末端片段序列分別示于SEQID No4、5或6。
PTHrP或PTH化合物的N-末端可以是游離的或被保護的氨基，例如具有《有機合成中的保護基團》，T.W.Greene，J.Wiley&Sons，NY(1981)，219-287中公開的N-保護基，該文在這里引為參考文獻，優選以R″-CO-、R″-O-CO、R″-O-CH2-CO-或R″-SO2保護，或N-末端帶有如下定義的R″、R-NH-CO-或R-NH-CS-的氨基。
本發明化合物C-末端可以是COOH、CONH2或單一取代或雙取代的酰胺，如-CONRcRd，其中Rc和Rd之一為H，另一個為脂族殘基，如C1-6烷基，或兩者均為脂族殘基，或Rc和Rd與其相連的氮原子一起形成雜環基，如吡咯烷基或哌啶基。
根據本發明，PTHrP或PTH化合物在PTH/PTHrP受體處具有有效的拮抗活性，如與PTH/PTHrP受體結合，其在功能生物測定中具有的使PTH/PTHrP受體活化的固有活性(i.a)遠遠小于1，如i.a最大為0.3，在功能生物測定中拮抗PTHrP或PTH或其片斷如PTHrP(1-34)或PTH(1-34)，具有pA2值至少為6.5。本發明優選化合物i.a為0.03或更低甚至在某些測定中不可測出。功能生物測定的例子是現有技術常用的基于骨肉瘤的腺苷酸環化酶測定。這一分析結果提供了體外測定的范圍，根據下文所述的Marcus和Aurbach在內分泌學，85，801-810(1969)中公開的方法，該范圍內的被測化合物在UMR細胞系如UMR-106-06的鼠骨肉瘤細胞中能刺激腺苷酸環化酶活性或拮抗PTHrP、PTH或其片段的作用。
氨基酸指天然存在的或可購買的或非天然的氨基酸或者其光學異構體。非天然氨基酸是指未在mRNA指導下插入蛋白質的氨基酸，如β-Nal，氟代-α-氨基酸如氟丙氨酸，環己基丙氨酸或三甲硅烷基丙氨酸。
“天然氨基酸”指本領域熟知的那些氨基酸。U.S.P.T.O出版的1990年5月15日公開的商標公報第33頁46行列出這些氨基酸及其標準縮寫。此處將這些氨基酸和縮寫符號具體列出。
天然氨基酸如下所示A Ala 丙氨酸D Asp 天冬氨酸E Glu 谷氨酸F Phe 苯丙氨酸G Gly 甘氨酸H His 組氨酸I Ile 異亮氨酸K Lys 賴氨酸L Leu 亮氨酸M Met 蛋氨酸N Asn 天冬酰胺Q Gln 谷氨酰胺R Arg 精氨酸S Ser 絲氨酸T Thr 蘇氨酸V Val 纈氨酸W Trp 色氨酸Y Tyr 酪氨酸側鏈帶有芳基或雜芳基的氨基酸殘基是指氨基酸殘基側鏈為任意進行環取代的苯基甲基、1-或2-萘基甲基、1-或2-萘基乙基、3-或4-吡啶基甲基、3-吲哚基甲基或3-吲唑基甲基；優選定義如下的式-NH-CHR′-CO-的氨基酸殘基。
本發明優選的實施方案提供了式I所示的化合物R-[(X2)p′(X3)q′(X6)s′R10]-D-(y-x)RaI其中x是選自31、34、35、36、37或38的殘基編號，y是選自1、2、3、4、5、6或7的殘基編號，X2為Val或獨立地具有X10的含義之一，X3是Ser或獨立地具有X10的含義之一，X6是Gln或獨立地具有X10含義之一，
R10是Asp或X10，X10為Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′為式(a)、(b)、(c)或(d)基團
其中n是1或2，m是1或2，o是0或1，環A被一個或多個選自氟、氯、硝基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的取代基任意取代，其中兩個烷基或兩個烷氧基取代基也可一起形成一個與環A稠合的環結構，每個環B和C可獨立地被取代，與上述環A所示的取代情況相同，Ya是一個鍵、-CH2-、O、NH或N-C1-6烷基，D是由PTHrP或PTHN-末端片段衍生的氨基酸序列，每個p、q和s為1，條件是當y＞2時，p是0，當y＞3時，q是0，且當y＞6時，s是0，R是H、R″-CO-、R″-O-CO-、R″-O-CH2-CO-、R″-SO2-、R、R-NH-CO-、R-NH-CS-或NH2-C1 -6亞烷基-CO-，其中R″是C1-8烷基；ω-羧基-C1-6烷基；ω-[(C1-4烷氧基)羰基]C1 -6烷基；C2-8鏈烯基；C5-7環烷基；C5-7環烷基C1-4烷基；或苯基、苯基C1-4烷基、1-萘基、2-萘基、1-萘基C1-2烷基或2-萘基C1-2烷基，每個基團中的環被一個或多個選自氟、氯、硝基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的取代基任意取代；雜芳基；
R獨立地具有所給出的R″含義之一，但除去ω-羧基C1-6烷基和ω-[(C1-4烷氧基)羰基]C1-6烷基的含義；和Ra是OH或NH2，條件為X2和R10中至少一個具有X10的含義。
當環A、B或C的取代基一起形成環結構時，它可以是如-O-CH2-CH2-O-。多環環烷基的例子是如金剛烷基。
作為R″的雜芳基為5、6或7元不飽和雜環基，環中含有至少一個氮原子，并可任意地再含如N、O或S雜原子，且任意地與苯環稠合。優選的雜芳基為吲哚基、喹啉基或異喹啉基。
本發明化合物可以例如游離形式、鹽或其配合物形式存在，如可與有機酸、聚合酸和無機酸形成酸加成鹽。這種酸加成鹽形式包括鹽酸鹽和乙酸鹽。例如通過加入無機物如Ca和Zn鹽這種無機鹽或氫氧化物，和/或加入聚合有機物，由本發明PTHrP或PTH化合物形成配合物。
式I化合物中，優選使用下列含義，無論是單獨使用或任意結合或再結合使用1.D是hPTHrP的N-末端片段。
2.D是hPTH的N-末端片段。
3.X10是Trp。
4.X10是-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基團，優選(a)或(c)，更優選(a)。
5.X2是Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基團。
6.每個X2和X10為Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基團。
7.每個X3和X10為Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基團。
8.每個X6和X10為Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基團。
9.每個X2、X6和X10為Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基團。
10.n是1。
11.y是選自3、4、5、6或7的殘基編號，優選為3或5。
12.x選自31或34的殘基編號。
13.R是R″CO-、R″-SO2、R或H2N-C1-6亞烷基-CO-。
14.R″是C1-8烷基、苯基C1-4烷基、1-或2-萘基、1-或2-萘基C1-2烷基。
15.R是ω-羧基C1-6烷基。
正如已經述及的，除第2和/或10位之外的位置上的一個或多個氨基酸可以進一步被上述的天然或非天然氨基酸殘基取代，或者這些位置上的氨基酸缺失。當本發明化合物為hPTHrP衍生物時，它們可能包含其它的氨基酸取代，比如第3位為Ala，第4位為Trp，第5位為任意地環被取代的Phe，第11和/或13位為Leu，或第34位為D-Ala，還可在N-末端缺失1-7個氨基酸殘基而成為任意被截短的氨基酸序列。當本發明化合物是hPTH衍生物時，例如在選自8、16、18、33和34的至少一個位置上氨基酸殘基如Leu8、Ala16、Gln18、Thr33、Ala34或其D-型異構體可進一步被取代。
本發明還提供了用于制備PTHrP或PTH化合物的方法。可逐步進行液相合成或固相合成，或使用基因工程手段或將這些方法結合使用，來制備這些化合物。
例如，可按下述方法制備本發明化合物a)將存在于本發明PTHrP或PTH化合物上的至少一個保護基除去，例如呈被保護形式的式I化合物；或b)通過酰胺鍵將兩個肽片段連接起來，這兩個肽片段可以是被保護的、部分被保護的或未被保護的形式，由此獲得式I所需的PTHrP或PTH化合物氨基酸序列的肽片段，然后可任意地進行該方法的步驟a)，或者c)在所需序列的N-末端殘基或其N-末端片段的氨基上用選擇法以被保護的形式或未被保護的形式加入保護基或取代基，然后任意進行步驟a)，并回收由此得到的呈游離形式、鹽形式或配合物形式的PTHrP或PTH化合物。
可使用與已知方法相似的方法進行步驟a)、b)和c)，如本領域所知的肽化學方法或下面實施例中所述的方法。在這些反應中，當需要時，適用于肽的保護基可用來保護不參加反應的官能團。術語保護基還包括具有官能團的聚合物樹脂。
當本發明化合物中包含非天然或天然殘基時，可將化學逐步合成法與基因工程方法相結合來制備這些化合物；可使用重組技術制備由可基因編碼的氨基酸殘基組成的肽序列(無論是全序列或片段)，并且可使用化學合成法來引入所需非天然氨基酸或末端氨基取代基，當需要時，可將這些片段連結并除去存在的保護基。
下述實施例中，溫度均以℃表示。采用下面的縮寫符號DMF＝二甲基甲酰胺，DMA＝N，N-二甲基乙酰胺-6-磺酰基，Pmc＝2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃，tBu＝叔丁基，PyBOP＝苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷基磷六氟磷酸鹽，Nal(2)＝L-3-(2-萘基)丙氨酸，DIEA＝N，N-二異丙基-N-乙胺，Fmoc＝9-芴甲氧基羰基，RT＝室溫，MS＝電噴射譜測定的M+。實施例1[Trp4，10]hPTHrP(1-34)OH在基于樹脂支持物的聚苯乙烯上，逐步合成此肽，通過Fmoc保護α-氨基，側鏈官能團保護情況如下Asp(OtBu)、Glu(OtBu)、His(Trt)、Lys(Boc)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、Arg(Pmc)、Ser(tBu)、Trp(Boc)和Thr(tBu)。
約0.5mmol/g的Fmoc-Ala-氧甲基-4-苯氧甲基-共聚(聚苯乙烯-1％-二乙烯基苯)用作肽逐步固相合成中的起始原料，固相肽合成包括反復進行α-氨基脫保護、洗滌、偶聯(即將下一個氨基酸殘基接到生長的肽鏈上)和洗滌。使用在DMA中的20％哌啶，將N-αFmoc基團切下。偶聯反應中每個氨基使用4當量的Fmoc-氨基酸和PyBOP-試劑以及DMA中的8當量的DIEA。肽鏈的組合完成后，按前述相同方法使用DMA中的哌啶除去末端Fmoc-保護基。在RT下使用TFA中由5％十二烷基甲基硫和5％水組成的試劑將肽從樹脂支持物上切下，并同時除去所有側鏈保護基，反應時間為2小時。濾去樹脂顆粒，用一些TFA洗滌，向合并的濾液中加入10至20體積的乙醚，使產物沉淀，并用乙醚洗滌，并干燥。將產物在C-18大孔硅膠柱上使用2％磷酸水溶液的乙腈梯度洗脫進行色譜提純。收集含純化合物的級分，通過離子交換樹脂(Biorad，AG4-X4乙酸鹽形式)過濾，冷凍干燥得標題化合物。MS4146用與實施例1相似的方法，使用適當的氨基酸可制備下列化合物實施例2[Trp10，Leu11，Leu13]hPTHrP(1-34)OH MS4059實施例3[Trp10，Leu11]hPTHrP(1-34)OH MS4073實施例4[Trp3，10]hPTHrP(1-34)OH MS4188實施例5[Trp2，10]hPTHrP(1-34)OH MS4176實施例6[Trp10]hPTHrP(2-34)OH MS4018.3實施例7[Trp10]hPTHrP(3-34)OH MS3919.2實施例8[Trp2]hPTHrP(1-34)OH MS4104.9實施例9[Trp10]hPTH(1-34)OH MS4189實施例10[Leu8，Trp10，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4036實施例11[Leu8，Trp10，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(2-34)OHMS3949實施例12[Leu8，Trp10，DLeu11，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4079實施例13[Phe2，Trp10]hPTHrP(1-34)-OHMS4137.1實施例14[Trp2，Trp10]hPTHrP(2-34)-OHMS4105.1實施例15[Trp6，Trp10]hPTHrP(1-34)-OHMS4146.8實施例16[Trp6，Trp10]hPTHrP(6-34)-OHMS3623.3實施例17[Trp10]hPTHrP(7-34)-OH MS3437.6實施例18[Trp3，Trp10]hPTHrP(3-34)-OHMS4018.0實施例19[Trp10]hPTHrP(1-34)OHMS4088.7實施例20[Trp6，Trp10]hPTHrP(3-34)NH2MS3976.8實施例21[Phe6，Trp10]hPTHrP(1-34)OH MS3546.1實施例22[Phe2，Phe6，Trp10]hPTHrP(1-34)OH MS4155.1實施例23N-3-氨基丙酰基-[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(4-34)NH2MS3932.0實施例24Nα-芐氧羰基[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)-NH2
用與實施例1相似的方法制備這些肽，但所用的起始原料是約0.4mmol/g的4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基-甲基)-苯氧基共聚(聚苯乙烯-1％-二乙烯基苯)，其可根據如Tetrah.Letters，283787-3790(1987)中所述的方法來制備。在合成后期，將Z-Ser-OH加到肽鏈上，按實施例1的方法將肽切下并提純。MS3975.3實施例25Nα-乙酰基-[Trp10]hPTHrP(3-34)OH用與實施例1相似的方法合成該肽，在Fmoc-脫保護后期結束時，使用1∶1的乙酸酐和DMF的混合物進行乙酰化。根據前述方法將肽從樹脂上切下并提純。MS3961.1用與實施例1、24或25相似的方法制備下列化合物。實施例26Nα-乙酰基-[Trp10]hPTHrP(2-34)OHMS4060.4實施例271-異己酰-[Leu8，Trp10，Gln18，Thr33，Ala34]-hPTH(1-34)OHMS4091實施例28Nα-2-萘基乙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4097.1實施例29Nα-2-萘基乙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(4-34)NH2MS4009.7實施例30Nα-2-萘基磺酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4119.2實施例31Nα-2-萘氧基乙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4111.5實施例32Nα-2-萘乙酰基-[Ala3，Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4080.8實施例33Nα-芐氧羰基-[Trp2，Nal(2)10]hPTHrP(2-34)NH2MS4248.3實施例343-萘-2-基丙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4110.8實施例353-萘-2-基丙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4110.9實施例36Nα-2-萘基乙酰基-[Nal(2)10，DAla34]hPTHrP(3-34)NH2MS4095.9實施例37Nα-2-萘基乙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-31)NH2MS3788.0實施例38Nα-3-萘-2-基丙酰基1-[Nal(2)10]hPTHrP(7-34)NH2MS3630.0實施例E39Nα-乙酰基-[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(6-34)NH2MS3637.0實施例40Nα-乙酰基-[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(4-34)NH2MS3903.1實施例411-(1-氨基-1-環戊基羰基)-[Leu8，Trp10，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4104例如，根據G.Valle等人在Can.J.Chem.662575-2582(1988)中所述的方法可制備在制備肽樹脂中間體中所用的Fmoc-1-氨基環戊烷-1-羧酸。實施例E421-金剛烷基羰基-[Leue，Trp10，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4155實施例43 1-(3-吲哚基羰基)-[Leu8，Trp10，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4150實施例44 1-(3-喹啉基羰基)-，[Leu8，Trp10，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4104實施例451-(2-萘酰基)-[Leu8，Trp10，Gln18，Thr33，Ala34]-hPTH(1-34)OHMS4147實施例46Nα-(2-萘基)甲基-[Trp10]hPTHrP(2-34)-OH使用S-O.Lawesson等人在Tetrahedron 373635(1981)中所述的Lawesson試劑處理N-萘酰基(2)纈氨酸甲酯，并采用F.S.Guziec等人在Tetrah.Letters 23-26(1990)中所述用于內硫肽(endothiopeptides)的方法來還原得到的N-硫萘酰基(2)纈氨酸甲酯。使用LiOH使該甲酯水解，得到N-α-(萘基(2)甲基)纈氨酸鹽酸鹽，呈結晶固體，mp＝205-210°(dec.)。使用PyBOP試劑將其與預先制備出的被保護的[Trp10]hPTHrP-(3-34)-O-肽樹脂偶聯，該肽樹脂的N-αFmoc基已被除去。按實施例1的方法將肽從樹脂上切下并提純。MS4158.2實施例47Nα-2-萘-2-基乙基-[Trp10]hPTHrP(2-34)OHMS4171.9實施例48Nα-2-萘-2-基乙基-[Ala3，Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4066.7實施例49Nα-琥珀酰基-[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(5-34)NH2用與實施例1相似的方法制備該肽，但使用0.63g4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基共聚(聚苯乙烯-1％-二乙烯基苯)(裝載量約0.4mmol/g)作為起始原料，其可按Tetrah.Letters，283787-3790(1987)中所述的方法制備。偶聯最后一個氨基酸Fmoc-His(Trt)OH后，根據常規方法選擇性除去Fmoc-基，并將肽樹脂與DMF中的琥珀酐(0.5g)和DIPEA(0.86ml)反應。按實施例1的方法以乙酸酯形式從樹脂上切下肽、提純并凍干，得到標題化合物。MS3832.0根據實施例49的方法，可制備下列化合物實施例50Nα-琥珀酰基-[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(5-31)NH2MS3522.1實施例51Nα-琥珀酰基-[Nal(2)6，Nal(2)10]hPTHrP(5-34)NH2MS3881.7實施例52Nα-戊二酰基-[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(5-34)NH2MS3845.6實施例53Nα-琥珀酰基-[Phe6，Nal(2)10，DAla34]hPTHrP(5-34)NH2MS3832.0實施例54Nα-琥珀酰基-[4-Cl-Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(5-34)NH2MS3866.5實施例55Nα-琥珀酰基-[4-Cl-Phe5，4-Cl-Phe6，Nal(2)10]-hPTHrP(5-34)NH2MS3910.2正如動物試驗所表明的，呈游離形式或可藥用鹽形式及配合物形式的本發明化合物顯示出有價值的藥理活性，由此其可用于治療疾病。
根據Marcus和Aurbach在內分泌學，85，801-810(1969)中所述方法，體外評估本發明化合物的生物活性，通過測試它們在UMR106-06鼠骨肉瘤細胞中刺激(促效作用)或抑制(拮抗作用)刺激PTH的環AMP合成的能力。在12孔板上在DMEM-HAM′s F12培養基(1∶1)-10％FCS中，鼠骨肉瘤UMR106細胞生長至匯合。然后將該培養基轉移至含有2％FCS的培養基中，并向每孔加入1-5μCi[3H]-腺嘌呤。兩小時后，用無血清培養基洗滌細胞兩次，并將細胞在DMEM-0.1％BSA中溫育，其中含1mm3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，以排除磷酸二酯酶的作用。20分鐘后，單獨加入測試物質或與PTH一起加入(拮抗作用實驗)。15分鐘后，除去培養基，終止反應，加入0.5ml冰冷的5％三氯乙酸萃取cAMP。加入載體溶液(0.5ml/孔)，其含有0.2mm的未標記腺嘌呤、腺苷、AMP、ADP、ATP和cAMP以及用于測定回收率的0.4μCi[14C]-腺苷。使用系列Dowex AG 50W-X4(200-400目)和氧化鋁色譜來分離[3H]-cAMP，并根據Salomon Y.在Advances in Cyclic NucleotideResearch，Vol.10，Raven Press，35-55，1979中所述方法計數。計算結果，以對照溶劑的％表示，由DRC曲線測定EC50值。根據PTHrP或PTH的DRC曲線的右移值計算拮抗效力并以pA2值表示。本發明化合物在濃度為10-9至10-5M時具有拮抗活性。實施例36、37和49的化合物在UMR 106-06細胞中的pA2值分別為10.3、9.7和9.3。
本發明化合物對PTH受體還具有結合親和性，舉例如下使用乳過氧化物酶法(Anawa Lab.AG，Wangen)來碘化雞[Tyr36]PTHrP(1-36)酰胺，特異活性為2200Ci/mmol。用200μlDMEM和含1％BSA的HAM′sF12(1∶1)洗滌單層負鼠腎細胞(OK1)，并在1μM[Tyr36]chPTHrP(1-36)酰胺存在或不存在時，與每孔50.000cpm[125I-Tyr36]chPTHrP(1-36)酰胺一起在16℃下溫育。溫育后，用0.5ml培養基(4℃)洗滌細胞，用0.5ml1NNaOH溶解并測定放射性。特異性結合為全部結合量減去非特異結合量。使用SCTFIT一種非線性回歸計算機程序(Feyen等人，1992，生物化學和生物物理研究通訊1878-13)分析競爭曲線，數據以平均pKD值(n＝2至3)表示。實施例36、37和49的化合物的pKD值分別為8.3、7.9和8.4。
此外，正如由甲狀腺甲狀旁腺切除的鼠所測定的，靜脈注射本發明化合物后，其具有拮抗PTH的效果。甲狀腺甲狀旁腺切除后24小時，用PTH(1-34)注射被麻醉的鼠，通過離體的頸靜脈測試該化合物。由腹側插入套管，從尿膀胱中收集尿。使用標準方法測定尿中磷酸鹽和cAMP含量及血清中鈣和磷酸鹽含量。這些參數用于定量體內抗PTH效果的拮抗物的效力。在此試驗中，當通過靜脈注射以1μg/kg/h至1mg/kg/h劑量施用本發明化合物時，其拮抗PTH效果。當靜脈注射190g/kg/h實施例49的化合物，且PTH(1-34)靜脈注射量為4μg/kg/h時，其能完全抑制PTH誘導的磷酸鹽尿達90分鐘。
因此，本發明化合物能用來預防或治療下述的所有疾病與由PTH或PTHrP過量釋放引起的血鈣增多相關的疾病，如甲狀旁腺機能亢進、血鈣過多，與惡性腫瘤相關的疾病，如乳-腺癌，肺、食管、頭、頸部的鱗狀細胞癌，以及轉移至骨或未轉移至骨的血癌。此外，本發明化合物還可用于預防或治療PTHrP促發的腫瘤生長、腫瘤穿透以及向骨內生長，用于治療皮膚病，如組織修復治療，如治療燒傷、潰瘍、創傷以及促進毛發生長。
對于這些適應癥，當然將使用不同的合適劑量，例如其依賴于所治療的對象、給藥方式以及疾病的嚴重程度。但通常來說，對于動物日劑量約為0.1至約100mg/kg動物體重會得到滿意的結果。對于較大的哺乳動物，例如人，日劑量范圍約為0.1至500mg本發明化合物。
本發明化合物可以游離形式或可藥用鹽形式或配合物形式給藥。可使用常規方法制備這類鹽及配合物，并且其具有與游離化合物同樣級別的活性。本發明還提供了藥物組合物，其包括呈游離堿形式的或可藥用鹽形式的或配合物形式的本發明化合物以及藥用稀釋劑或載體。該組合物可按常規方式配制。適宜的單位劑量形式包含約0.025至250mg的本發明化合物及其藥用稀釋劑或載體。
本發明化合物可按任一常規途徑給藥，例如可以注射溶液形式或懸浮液形式，或以鼻內或栓劑形式非腸道給藥。另外的方法是，本發明化合物還可以膏體、膠狀物等形式局部給藥，例如如前所述的用于治療皮膚病或使毛發生長。
根據前述內容，本發明還提供了a)用作藥物的本發明化合物或其藥用鹽或配合物；b)對需要治療的受治療者預防或治療上述疾病的方法，該方法包括對所述受治療者施用有效量的本發明化合物或其藥用鹽或配合物；c)本發明化合物或其藥用鹽或配合物，它被用于制備上述方法b)中應用的藥物組合物。
根據本發明的另一實施方案，本發明化合物可用作其它治療中的助劑或佐劑，例如用于使用骨吸收抑制劑治療血鈣過多，特別是使用降鈣素或其類似物或衍生物，如鮭、鰻或人降鈣素，膦酸氫鹽，利尿劑或將其結合使用，或用于使用細胞生長抑制劑或其任一組合的腫瘤治療中。
根據前述內容，本發明還包括下述方面d)預防或治療血鈣過多的方法，例如針對需要這種治療的受治療者預防或治療前述的特定的疾病，該方法包括對所述受治療者施用有效量的a)本發明化合物及b)另一種藥物，所述的另一種藥物為上述的治療劑。
實施例36、37和49的化合物為優選化合物，用于治療或預防與由PTH或PTHrP過量釋放引起的血鈣增高有關的所有疾病。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名SANDOZ LTD.
(B)街道Lichtstrasse35，(C)城市BASLE(E)國家SWITZERLAND(F)郵政編碼(ZIP)CH-4002(A)姓名SANDOZ PATENT GMBH(B)街道Humboldtstrasse 3(C)城市LOERRACH(E)國家GERMANY(F)郵政編碼(ZIP)D-79539(A)姓名SANDOZ ERFINDUNGENVERWALTUNGSGESELLSCHAFT M.B.H.
(B)街道Brunner Strasse 59(C)城市VIENNA(E)國家AUSTRIA(F)郵政編碼(ZIP)A-1230(ii)發明名稱肽(iii)序列數6(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度38個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬結構無(iii)反義無(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO1Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asn Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asn Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His20 25 30Thr Ala Glu Ile Arg Ala35(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度34氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬結構無(iii)反義無(v)片段類型N-末端(xi)序列特征SEQ ID NO2Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asn Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asn Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His20 25 30Thr Ala(2)SEQ ID NO3信息(I)序列特征
(A)長度31氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬結構無(iii)反義無(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO3Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asn Lys Gly Lys Ser Ile Gln15 10 15Asn Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile20 25 30(2)SEQ ID NO 4信息(i)序列特征(A)長度38氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬結構無(iii)反義無(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO 4Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Mer His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 16Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe Val Ala Leu Gly35(2)SEQ ID NO5信息(I)序列特征(A)長度34氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬結構無(iii)反義無(v)片段類型N-末端(xi)序列描述 SEQ ID NO 5Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe(2)SEQ ID NO6信息(I)序列特征(A)長度31氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(iii)假擬結構無(iii)反義無(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO6Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val20 25 30
權利要求
1.一種PTH或PTHrP化合物，其中天然存在于第2位和第10位上的至少一個氨基酸殘基被色氨酸或被在其側鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個氨基酸殘基取代，并且任意地天然存在于第3位和第6位上的至少一個氨基酸殘基被色氨酸或被在其側鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個氨基酸殘基進一步取代，該化合物呈游離形式或鹽形式或配合物形式。
2.一種PTH或PTHrP化合物，其中天然存在于第10位上的氨基酸殘基被色氨酸或被在其側鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個氨基酸殘基取代，并且任意地天然存在于第3位和第6位上的至少一個氨基酸殘基被色氨酸或被在其側鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個氨基酸殘基進一步取代，該化合物呈游離形式或鹽形式或配合物形式。
3.根據權利要求1的化合物，其中其側鏈上帶有芳基或雜芳基的氨基酸殘基是其側鏈任意進行環取代的3或4-吡啶基甲基、3-吲哚基甲基或3-吲唑基甲基或式(a)、(b)、(c)或(d)基團
其中n是1或2，m是1或2，o是0或1，環A被一個或多個選自氟、氯、硝基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的取代基任意取代，由此兩個烷基或兩個烷氧基取代基也可一起形成與環A稠合的環結構，每個環B和環C可獨立地被取代，與上述環A的取代情況相同，并且Ya為直連鍵、-CH2-、O、NH或N-C1-6烷基。
4.根據權利要求1的化合物，其為式I化合物R-[(X2)p，(X3)q，(X6)s，R10]-D-(y-x)RaI其中x是選自31、34、35、36、37或38的殘基編號，y是選自1、2、3、4、5、6或7的殘基編號，X2是Val或獨立地為X10含義之一，X3是Ser或獨立地為X10含義之一，X6是Gln或獨立地為X10含義之一，R10是Asp或X10，X10為Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)、(c)或(d)基團
其中n是1或2，m是1或2，o是0或1，環A被一個或多個選自氟、氯、硝基、C1-4烷基和C1-4烷氧基取代基任意取代，由此兩個烷基或兩個烷氧基取代基也可一起形成與環A稠合的環結構，每個環B和C可獨立地被取代，與上述環A的取代情況相同，Ya是直連鍵、-CH2-、O、NH或N-C1-6烷基，D是由PTHrP或PTH的N-末端片段衍生的氨基酸序列，每個p、q和s為1，條件是當y＞2時，p為0，當y＞3時，q是0，且當y＞6時，s是0，R是H、R″-CO-、R″-O-CO-、R″-O-CH2-CO-、R″-SO2-、R、R-NH-CO-、R-NH-CS或NH2-C1- 6亞烷基-CO-，其中R″是C1-8烷基；ω-羧基C1-6烷基；ω-[(C1 -4烷氧基)羰基]C1-6烷基；C2-8鏈烯基；C5-7環烷基；C5-7環烷基C1 -4烷基；或苯基、苯基C1-4烷基、1-萘基、2-萘基、1-萘基C1- 2烷基或2-萘基C1-2烷基，其中每個基團的環被一個或多個選自氟、氯、硝基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的取代基任意進行環取代；雜芳基；R獨立地具有R″的含義之一，但除去ω-羧基C1-6烷基和ω-[(C1 -4烷氧基)羰基]C1-6烷基的含義；和Ra是OH或NH2，條件是X2和R10中的至少一個具有X10的含義。
5.根據權利要求1或4的化合物，其衍生自hPTH或hPTHrP的N-末端片段。
6.根據權利要求1的化合物，其選自Nα-2-萘基乙酰基-[Nal(2)10，DAla34]hPTHrP(3-34)NH2Nα-2-萘基乙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-31)NH2Nα-琥珀酰基-[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(5-34)NH2。
7.用于制備權利要求1的化合物的方法，所述化合物呈游離形式或鹽形式或配合物形式，該方法包括a)將存在于本發明PTHrP或PTH化合物如呈保護形式的式I化合物上的至少一個保護基脫除；或b)將呈保護形式、部分保護形式或末保護形式的兩個肽片段以酰胺鍵連接起來，由此獲得的肽片段具有所需PTHrP或PTH化合物如式I化合物的氨基酸序列，然后任意地進行該方法的步驟a)，或者c)在呈保護形式或未保護形式的所需序列的N-末端殘基或其N-末端片段的氨基上用選擇法加入保護基或取代基，然后任意進行步驟a)，并回收由此得到的呈游離形式、鹽形式或配合物形式的PTHrP或PTH化合物。
8.一種根據權利要求1的用作藥物的呈游離形式或藥用鹽形式的化合物。
9.一種藥物組合物，其包括權利要求1的呈游離形式或藥用鹽形式的化合物以及藥用稀釋劑或載體。
10.呈游離形式或藥用鹽形式的用作藥物的權利要求1的化合物，其進一步與選自骨再吸收抑制劑和細胞生長抑制劑的治療劑結合。
11.一種對需要治療的受治療者預防或治療與由PTH或PTHrP過量釋放引起的血鈣增多有關的疾病、預防或治療由PTHrP促發的腫瘤生長、治療皮膚病和促進毛發生長的方法，該方法包括對所述受治療者施用有效量的呈游離形式或藥用鹽形式的權利要求1的化合物。
全文摘要
在PTH/PTHrP受體處具有有效拮抗活性的PTH或PTHrP化合物，其中天然存在于第2位和第10位上的至少一個氨基酸殘基被色氨酸或被在其側鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個氨基酸殘基取代，并且任意地天然存在于第3位和第6位上的至少一個氨基酸殘基被色氨酸或被在其側鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個氨基酸殘基進一步取代，其具有藥物活性，例如預防或治療與由PTH或PTHrP過量釋放引起的血鈣增多有關的疾病。
文檔編號C07K14/435GK1154116SQ95194365
公開日1997年7月9日 申請日期1995年7月27日 優先權日1995年7月27日
發明者F·卡丁諾斯, J·H·M·費恩, R·甘澤, F·O·岡伯特 申請人:山道士有限公司