一種微量熱法結合測定自由基清除率確定高抗氧化大豆肽的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于大豆深加工技術領域，尤其是一種微量熱法結合測定自由基清除率確定高抗氧化大豆肽的制備方法。
【背景技術】
[0002]蛋白質的酶法改性通常是指利用酶水解對大豆蛋白進行改性。蛋白質的酶法改性因專一性強、酶解過程溫和，而受到人們的廣泛關注。隨著酶生產、膜反應器和固定化酶技術的不斷發展，酶水解方法更趨于簡單化、自動化，酶法水解已成為新的方向。隨著一些新用途的酶的發現和應用，極大的拓寬了酶法改性的應用范圍，例如各類蛋白水解酶、轉谷氨酰胺酶、磷酸酶以及過氧化氫酶的應用，使得過去只能采用化學方法進行的磷酸化、去酰胺、交聯聚合等改性方式都可以采用酶法改性來進行。特別是一些低廉價格的微生物酶的出現，進一步降低了酶法改性的成本，使其更具有實用性。
[0003]伴隨著酶化學的迅猛發展，美國、日本對于大豆蛋白的酶解工藝和酶解過程的感官特性、功能特性及營養價值改善的研究取得了較大的進展。目前國內外生產的大豆肽是大豆蛋白質經蛋白酶水解得到的多種肽分子混合物。
[0004]對蛋白酶水解制備大豆肽的方法國內外學者進行了大量的研究，大都是通過測定產物的性質，來確定最佳反應溫度、酸度等條件，試驗方法較復雜，隨意性較大，不能準確定量確定蛋白酶水解反應的最佳工藝。致使蛋白酶水解工藝控制欠缺理論指導，控制難。微量熱法通過高靈敏度的微量量熱儀直接測量酶催化反應過程中微量的熱量變化，獲得蛋白酶對大豆蛋白催化反應的熱功率一時間曲線，定量確定蛋白酶水解大豆分離蛋白最佳反應溫度、pH。具有靈敏度高、操作簡單等優點。結合測定自由基清除率可以準確定量確定高抗氧化大豆肽的制備方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于，克服現有技術的不足，提供一種制備高抗氧化大豆肽的方法。本發明用一種新的研究方法微量熱法，對大豆蛋白酶解制取大豆肽最適蛋白酶、最適條件進行定量的研究，結合測定產物自由基清除率確定一種新的高抗氧化大豆肽的制備方法。
[0006]為解決上述技術問題，本發明的技術方案為:一種微量熱法結合測定自由基清除率確定高抗氧化大豆肽的制備方法，其特征在于，具體方法包括以下步驟:
[0007](I)配制溶液:
[0008]溶液①:準確稱取大豆分離蛋白樣品，用不同pH值(ρΗ3.3-ρΗΙΟ.0)的緩沖溶液分別配制濃度為5-10g L 1的大豆分離蛋白溶液。
[0009]溶液②:配制濃度為0.1-0.3g L 1的中性蛋白酶(酶活力5.3X10 4U/g)溶液，胰蛋白酶(酶活力5.1 X 104U/g)溶液，菠蘿蛋白酶(酶活力6.0X 104U/g)溶液，堿性蛋白酶(酶活力5.7X104U/g)溶液。
[0010](2) 90°C大豆分離蛋白溶液進行水浴處理1min ;
[0011](3)測定熱功率時間曲線:取溶液①2ml放入不銹鋼安瓿中。把滴定微量量熱儀的連桿上繞細塑料管，管中盛蛋白酶溶液②lml，先預熱，當溫度恒定后，將攪拌系統打下，轉速為60-120rpm，用蠕動栗把蛋白酶溶液②注入安瓿中，然后進行熱功率一時間曲線的測定;
[0012](4)通過熱功率一時間曲線，按照熱動力學理論和對比進度法解析出中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶各溫度(306.15K-336.15K)、pH值(ρΗ6.13_ρΗ9.22)時米凱利斯常數Km和最大速度Vmax，并建立米凱利斯常數與溫度、pH值間的關系式，從而獲得中性蛋白酶最適溫度319.19K、最適pH7.13 ;胰蛋白酶最適溫度323.27K、最適PH7.77 ;菠蘿蛋白酶最適溫度314.63K、最適pH6.99 ;堿性蛋白酶最適溫度329.5K、最適ρΗ8.25。
[0013](5)通過熱功率一時間曲線，求得中性蛋白酶在其最適溫度、最適pH的米凱利斯常數Κπι = 24.028.?Λ胰蛋白酶在其最適溫度、最適pH的米凱利斯常數Km = 42.41g.!/，菠蘿蛋白酶在其最適溫度、最適pH的米凱利斯常數Km = 50.31g *L \堿性蛋白酶在其最適溫度、最適PH的米凱利斯常數Km = 16.0lg -L \從而可以知道堿性蛋白酶與底物大豆分離蛋白的親和力最強，結合產物自由基清除率測定進一步確定堿性蛋白酶是催化水解大豆分離蛋白的最適蛋白酶。
[0014](6)不同試驗條件(底物濃度、酶底比、pH、溫度、酶組合)下得到的大豆肽產品，進行自由基清除率測定，根據試驗結果確定高抗氧化大豆肽的制備方法:調漿一加酶反應—分離提取一脫除異味一脫除無機鹽類一殺菌滅酶一濃縮、噴霧干燥一高抗氧化大豆肽產品。其中加酶反應底物濃度5-10%、pH值8.25、酶底比1-3%、水解溫度329.5K，堿性蛋白酶水解大豆蛋白3h后加與堿性蛋白酶1:3的胰蛋白酶，在323.27K，pH7.77水解2h，獲得高抗氧化大豆肽，10mg/mL時DPPH自由基清除率為99.83%。
[0015]本發明的有益效果是:本發明使用的微量熱法具有靈敏度高，操作簡單、實驗結果精準等優點；本發明提供一種制備高抗氧化大豆肽的方法，能夠有效提高產品的抗氧化性，本產品10mg/mL時DPPH自由基清除率為99.83%。與普通工藝生產的抗氧化大豆肽相比，自由基清除率顯著提高，本發明無污染，成本低，工藝簡單，產品抗氧化性高，水溶性好、安全、無毒、無副作用等，具有較高的推廣價值，可以用于保健品、功能食品、食品添加劑的開發。同時可以很好地對大豆深加工企業大豆肽生產中的蛋白酶水解工藝控制提供理論指導，產生較高經濟價值和社會效益，其前景非常廣闊。
【附圖說明】
[0016]圖1是堿性蛋白酶在pH = 6.80,不同溫度時催化反應的熱功率一時間曲線
[0017]圖2是堿性蛋白酶在T = 312.15K,不同酸堿度時催化反應的熱功率一時間曲線
[0018]圖3是中性蛋白酶在T = 319.19K, PH = 7.13下催化反應的熱功率一時間曲線
[0019]圖4是在溫度為323.27K和PH = 7.77時胰蛋白酶催化反應的熱功率一時間曲線
[0020]圖5是在T = 314.63K，pH = 6.99時菠蘿蛋白酶催化反應的Km和Vmax
[0021]圖6是在溫度為329.12K, PH = 8.31時堿性蛋白酶催化反應的熱功率一時間曲線【具體實施方式】:
[0022]實施例1
[0023]1.溶液的配制:
[0024]溶液①:準確稱取大豆分離蛋白樣品，用pH值為7.13,7.65,8.14、8.67、9.22的緩沖溶液分別配制濃度為1g.L 1的大豆分離蛋白溶液。
[0025]溶液②:配制濃度為0.2g L 1堿性蛋白酶溶液。
[0026]2.90°C大豆分離蛋白溶液進行水浴處理1min ;
[0027]3.實驗是在4ml不銹鋼安瓶(滴定微量量熱儀)中進行的。取大豆分離蛋白溶液2ml放入不銹鋼安瓿中。把滴定微量量熱儀的連桿上繞細塑料管，管中盛堿性蛋白酶溶液lml，先預熱，當溫度(316.15K ；321.15K ；326.15K ；331.15K ；336.15K)恒定后，將攪拌系統打下，轉速為120rpm，用蠕動栗把堿性蛋白酶溶液注入安瓿中，然后進行熱功率一時間曲線的測定，記錄儀開始記錄，當記錄筆畫出與基線平行的直線時即認為實驗結束，攪拌停止。每個體系重復實驗測定三次，取平均值。
[0028]實驗測得在pH = 6.80,不同溫度時酶催化反應的熱功率一時間曲線如圖1
[0029]由圖1 得到不同溫度(316.15K ；321.15K ；326.15K ；331.15K ；336.15K)下的酶催化反應的米凱利斯常數(Km)和最大速率(Vmax):
[0030]T = 316.15K, Km = 20.06 和 Vmax = 0.1493 ；T = 321.15Κ, Km = 18.67 和 Vmax =0.1610 ；Τ = 326.15Κ, Km = 17.71 和 Vmax = 0.1749 ；Τ = 331.15Κ, Km = 18.17 和 Vmax =0.1619 ；Τ = 336.15Κ, Km = 19.60 和 Vmax = 0.1505 ；
[0031]根據Km和Vmax的數據，用計算機擬合，得Km—T曲線方程，即
[0032]Km = 0.020Τ2-13.18Τ+2172, R = 0.9920，求極值得到堿性蛋白酶的最適溫度為329.5Κ。
[0033]實驗測