Dna三向節活化的雜交鏈式反應用于尿嘧啶dna糖基化酶的高靈敏檢測的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及酶活性檢測領域，具體涉及DNA三向節活化的雜交鏈式反應用于尿嘧啶DNA糖基化酶的高靈敏檢測。
【背景技術】
[0002]在過去十幾年里，DNA因其具有嚴格的堿基配對原則而成為一種有趣的組裝元素用于可控的、程序化的設計和組裝DNA納米材料。通過合理的序列設計和DNA自組裝過程，一系列的動態DNA納米器件被成功組裝，如納米機器、邏輯門、催化放大器等，它們大多是基于Toehold介導的鏈置換反應。DNA納米器件通常是通過pH的調節、核酸雜交以及金屬離子與堿基的反應引發的。然而，一般的設計僅僅將一種目標物轉化為信號輸出，這大大限制了目標物響應的DNA納米器件的多樣化設計。
[0003]典型的DNA三向節是由三條單獨的DNA互相雜交形成，它作為一種新型的DNA納米組裝構筑單元被應用于DNA動態自組裝中。多臂結構為組裝目標物響應的DNA納米器件提供了更多的可能性。對Toehold介導的鏈置換反應而言，在不同的三向節臂上安置Toehold和鏈迀移序列是至關重要的，原因為該種設計可使組裝更加靈活，反應更易調節。在DNA三向節活化策略中，最初Toehold序列和鏈迀移序列是不可接近的，當進行識別反應后，通過某種信號轉導機制的引入，即可將該識別事件轉化為三向節的活化過程。最近，DNA三向節活化策略被成功用于目標物誘導的DNA環路和邏輯門中。然而，在該類設計中仍存在諸多限制，Toehold和鏈迀移序列通過一段完整的適體鏈連接或被劈開成兩條DNA鏈，這就只能依賴指定的識別機制構建DNA納米器件，如適體與蛋白質的綁定、金屬與特定堿基對的結合等。因此，構建功能先進且能識別多種目標物的DNA納米器件仍是個巨大的挑戰。
[0004]核酸酶，如DNA修飾酶，在調節基因表達和維持基因完整性上起重要作用。DNA修飾酶的異常表達可能干擾基因形式的遺傳外重新編程進而影響核染色質結構，引起許多疾病，如癌癥、亨廷頓疾病或精神異常等。然而，DNA修飾酶作用的底物為一段DNA序列或特定的堿基位點，利用DNA修飾酶構建DNA納米器件的最大障礙即為缺少有效的識別機制，如何將該類酶的作用轉化為DNA三向節活化過程，是本領域技術人員面臨的難題。
【發明內容】
[0005]為解決上述現有技術存在的問題，發明人通過引入新的酶識別機制，可以實現將不同種目標物轉化為同一種信號輸出的一般性納米器件的構建。以DNA糖基化酶UDG為模型，開發了 DNA三向節活化中的發夾重構機制，將DNA修飾酶(UDG)對底物的作用轉化為雜交鏈式反應的觸發過程，從而引起DNA的自組裝過程，并實現了通用性DNA納米器件的構建。該器件能夠用于DNA糖基化酶UDG的高靈敏檢測和抑制劑篩選，證明了該方法具有潛在的應用價值。
[0006]本發明涉及以下技術方案:
[0007]1、一種雜交鏈式反應方法，包括由DNA修飾酶參與的DNA三向節活化形成DNA三向節觸發鏈，進而引發發卡結構H1、H2的雜交鏈式反應，其特征在于，DNA修飾酶識別探針與DNA修飾酶作用，識別探針發生發夾重構，繼而形成DNA三向節觸發鏈。
[0008]本發明所述的發卡重構是指，DNA修飾酶識別探針是包括toehold、DNA修飾酶的識別序列、鏈迀移部分、位于DNA修飾酶識別序列兩端的兩段互補的輔助序列且鏈迀移部分與識別序列雜交的發卡結構，DNA修飾酶與識別探針結合使得鏈迀移部分與識別序列的雜交變得極其不穩定，繼而探針中兩段互補的輔助序列發生配對雜交，原來的發夾結構發生重構，toehold和鏈迀移部分拉近，形成一個三向節觸發鏈，體系中加入Hl和H2時，三向節結構打開Hl的發夾，進而形成Hl和H2交替組裝的雙鏈結構。
[0009]本領域技術人員明了，不同類型的DNA修飾酶可以通過不同的方式使得識別序列發生堿基變化，即而引發識別探針的發卡重構，優選的，識別探針設計為，加入尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)后，識別序列中的U被移除，生成無堿基位點(AP site)，使鏈迀移部分與UDG識別序列的雜交變得極其不穩定，這時，兩端互補的輔助序列雜交，使原來的發夾發生重構。
[0010]2、一種基于DNA三向節活化雜交鏈式反應的尿嘧啶DNA糖基化酶檢測方法，其特征在于，
[0011](I)制備UDG識別探針、HU H2，其中UDG識別探針是包括toehold、UDG酶識別序列、鏈迀移部分、位于UDG酶識別序列兩端的兩段互補的輔助序列且鏈迀移部分與識別序列雜交的發卡結構，識別探針與UDG酶結合可使得鏈迀移部分與識別序列的雜交變得極其不穩定，繼而探針中兩段互補的輔助序列發生配對雜交，原來的發夾結構發生重構，toehold和鏈迀移部分拉近，形成一個三向節觸發鏈；
[0012](2)加入UDG酶，進行雜交鏈式反應；
[0013](3)對反應結果進行信號檢測。
[0014]優選的，上述檢測方法在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)與識別探針作用前，進行DNA的退火，包括UDG識別探針、雜交鏈式反應的Hl和H2的退火，使UDG酶識別探針、Hl和H2均形成穩定的非活化狀態發夾結構。
[0015]優選的，雜交鏈式反應中形成的雙鏈在每個H2的末端都會形成一個G-四倍體結構，作為信號報告元件，通過加入熒光染料NMM進行信號檢測。
[0016]優選的，識別探針的序列為CTT GCA ATT GTGA UTUTGT CTCAC TT ACAA AA ACGTTACC, Hl 的序列為 ACAA CGAA CACG TTACC GGGTA GGGCG TTAGGA GGTA ACGT GTTC GTTGTAAT TGCA AGG, H2 的序列為 TGGGT TCCTAA CGCCC TACCC GGTAA CGTGT TCGTT GT GCAATTACAA CGAA CACG TTACC GGTA GGCG GG。
[0017]優選的，識別探針的濃度為250ηΜ，Η1的濃度為500nM，H2的濃度為550nM ;雜交鏈式反應的組裝時間采取120min。
[0018]3、一種利用上述檢測方法進行尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑/拮抗劑篩選的方法，其特征在于:在步驟(2)中，額外加入不同濃度的候選抑制劑后，進行雜交鏈式反應。
[0019]4、一種基于DNA三向節活化雜交鏈式反應的尿嘧啶DNA糖基化酶檢測試劑盒，其特征在于，包括UDG酶識別探針、Hl和H2，信號檢測試劑，所述UDG識別探針是包括toehold,UDG酶識別序列、鏈迀移部分、位于UDG酶識別序列兩端的兩段互補的輔助序列且鏈迀移部分與識別序列雜交的發卡結構，識別探針與UDG酶結合可使得鏈迀移部分與識別序列的雜交變得極其不穩定，繼而探針中兩段互補的輔助序列發生配對雜交，原來的發夾結構發生重構，toehold和鏈迀移部分拉近，形成一個三向節觸發鏈。
[0020]優選的，識別探針的序列為CTT GCA ATT GTGA UTUTGT CTCAC TT ACAA AA ACGTTACC, Hl 的序列為 ACAA CGAA CACG TTACC GGGTA GGGCG TTAGGA GGTA ACGT GTTC GTTGTAAT TGCA AGG, H2 的序列為 TGGGT TCCTAA CGCCC TACCC GGTAA CGTGT TCGTT GT GCAATTACAA CGAA CACG TTACC GGTA GGCG GG。
[0021]優選的，識別探針的濃度為250ηΜ，Η1的濃度為500nM，H2的濃度為550nM ;雜交鏈式反應的組裝時間采取120min。
[0022]本發明取得了以下技術效果:
[0023](I)本發明引入新的酶識別機制，提供了新的DNA三向節活化策略。
[0024](2)本發明所述的DNA三向節活化策略，克服了現有技術中只能依賴指定的識別機制構建DNA納米器件的限制(如適體與蛋白質的綁定、金屬與特定堿基對的結合)。
[0025](3)本發明以DNA糖基化酶UDG為模型，開發了發夾重構機制，將DNA修飾酶酶對底物的作用轉化為雜交鏈式反應的觸發過程，引起DNA的自組裝過程，實現了一類酶底物的通用性DNA納米器件的構建。
[0026](4)本發明所述方法針對尿嘧啶DNA糖基化酶實現了高靈敏檢測，其中UDG的檢測下限達到0.0