一種重組乳酸菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，設及到一種W乳酸乳球菌為載體的抗I型糖尿病疫苗 及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 糖尿病值i油etes)是一組W高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖則是由于膜島 素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起。長期高血糖會導致各種組織，特別是眼、 腎、屯、臟、血管、神經的慢性損害、功能障礙。臨床上主要表現為"Ξ多一少"即多尿、多飲、 多食、消瘦等表現。糖尿病是現代疾病中的第二殺手，其對人體的危害僅次于癌癥。I型糖 尿病（IDDM)是由于膜島β細胞破壞或功能缺失導致膜島素絕對缺乏所引起的糖尿病，患 者血糖水平持續升高，出現糖尿病。目前治療I型糖尿病的方法主要有W下幾種：皮下注射 膜島素及其類似物、膜島移植、干細胞治療、通過基因工程技術再造能分泌膜島素的克隆細 胞來代替膜島細胞、W及預防或治療性疫苗。目前，利用疫苗來預防I型糖尿病的越來越受 到人們的關注。
[0003] 熱休克蛋白化eatshockprotein,服巧60是膜島β細胞主要的自身抗原之一， 它具有抗原膚分子伴侶作用；巨隧細胞、DC和ΝΚ細胞等表面均存在HSP60受體，抗原和 HSP60的融合蛋白具有祀向免疫細胞的作用；另外，HSP60也具有免疫佐劑功能，可誘導DC 活化，HSP60通過其受體與APC細胞作用，可誘發一系列的免疫激活事件，包括免疫細胞成 熟、活化和抗原的交叉激活。實驗發現，結合分歧桿菌HSP65與人源HSP60有大約50 %的 同源性，且HSP65作為卡介苗的主要抗原已廣泛用于人類肺結核的防治，因此本疫苗選用 HSP65作為抗原表位的載體。
[0004] IA2P2是一段小膚，含有至少一個對I型糖尿病發生有重要作用的T細胞表位。其 相應的自身抗體也是I型糖尿病的特異性血清標志物，對新發病的I型糖尿病患者敏感性 很高。實驗證實，通過誘發機體產生針對IA2P2的強免疫應答，可有效地抑制I型糖尿病 的發生。但IA2P2的免疫源性較弱，發明人通過多次重復串聯和大分子承載的方法發現可 增強其免疫源性。因此，鑒于HSP65可承載的表位長度及IA2P2可能含有的表位數，本發明 IA2P2進行6次重復串聯，并與HSP65融合，構建出服P65-6IA2P2的編碼基因序列。 陽0化]乳酸乳球菌化actococ州Slactis)在食品工業中應用廣泛，是一種公認的食品級 微生物，安全性較高。此外，乳酸乳球菌作為一種腸道益生菌，具備多種生理功能：控制腸 內感染、抗腫瘤活性等，還能促進小腸局部細胞免疫和體液免疫。并且乳酸乳球菌的遺傳背 景明確，基因操作技術純熟。因此，乳酸乳球菌是安全的疫苗遞送載體，不會在腸道內定植， 不會危害腸道內正常益生菌群和造成潛在的基因污染。消化道每天都會接觸到食物中的非 已抗原，但多數人對食物均不產生免疫反應，主要因為人類的腸道黏膜免疫系統能及時誘 導對食物中無害抗原的耐受。運種粘膜耐受機制能夠擴散到全身，誘導全身性的耐受反應。 而用乳酸菌遞呈的蛋白也會被識別為食物中的無害抗原而產生耐受。因此，本疫苗選用乳 酸乳球菌作為載體。通過口服活菌疫苗的方式，達到黏膜耐受的效果，克服了傳統疫苗安全 性差、生產成本高、接種方式難接受的缺陷。
【發明內容】
[0006] 本發明目的之一是提供一種W乳酸乳球菌為載體的抗I型糖尿病疫苗的制備和 應用，該疫苗能有效預防和治療I型糖尿病。
[0007] 一種重組乳酸菌，其特征在于該重組乳酸乳球菌命名為乳酸乳球菌NZ9000PCYT: 服P65-6IA2P2Lactococ州SlacticsNZ9000pCYT出SP65-6IA2P2;保藏于中國典型培養 物保藏中屯、，保藏地址中國武漢武漢大學；保藏時間：2014年11月28日；保藏編號：CCTCC NO：M2014609〇
[0008] 該重組乳酸乳球菌由融合蛋白服P65-6IA2P2的編碼基因通過質粒PCYT電轉入乳 酸乳球菌中獲得；其中所述融合蛋白服P65-6IA2P2是由疫苗膚IA2P2重構膚段重復六次融 合在服P65載體的C端構成；所述乳酸乳球菌為LactococcuslactisNZ9000基因工程重 組菌；所述服P65-6IA2P2融合蛋白的氨基酸序列如SEQNO:1所示。
[0009] 所述的服P65-6IA2P2融合蛋白的編碼基因的核巧酸序列如SEQNO:2所示。
[0010] 具體的來說：將IA2P2重構膚段，重復六次融合在HSP65載體的C端 (服P65-6IA2P2)，共由690個氨基酸組成。序列表中SEQNO:1的氨基末端第1-540位為 HSP65序列，氨基末端第541-542位為AS(丙氨酸-絲氨酸），氨基末端第543-565位為 IA2P2序列，其中IA2P2段中的前10個氨基酸來自于IA2,后13個氨基酸來自于人服P60 蛋白序列。自氨基酸第566-567、591-592、616-617、641-642、666-667為5個重復的柔性連 接膚SS(絲氨酸-絲氨酸）。氨基酸第 568-590、593-615、618-640、643-665、668-690 為 5 個重復的IA2P2膚段。
[0011] 所述服P65-6IA2P2融合蛋白的核巧酸序列具體可如序列表中SeqNO. 3所示。
[0012] 所述服P65-6IA2P2融合蛋白的編碼基因可通過重組質粒PCYT:服P65-6IA2P2導 入乳酸乳球菌。所述重組質粒PCYT出SP65-6IA2P2是將PCYT:服P65-6P277中的P277基 因用所述融合蛋白編碼基因替代得到的重組質粒；而所述的PCYT:服P65-6P277是將PCYT: NUC中的NUC基因用服P65-P277編碼基因代替得到。所述表達載體PCYT:NUC為PWV01衍 生載體，啟動子為化isA，攜帶氯霉素抗性基因W及多克隆位點（MC巧。
[0013] 所述的重組乳酸乳球菌在制備治療I型糖尿病藥物中的應用。
[0014] 所述的服P65-6IA2P2在制備治療I型糖尿病藥物中的應用。
[0015] 一種抗I型糖尿病疫苗，其特征在于其活性成分含有權利要求1所述的重組乳酸 乳球菌。
[0016] 一種檢測試劑盒，其特征含有權利要求1所述的權利要求1所述的重組乳酸乳球 菌或服P65-6IA2P2。
[0017] 本發明所提供的重組乳酸乳球菌可為Lactococcus lactis NZ9000型，也可為其 它許可在人體使用的乳酸菌。
[0018] 本發明所提供的表達載體可為PCYT-NUC，也可為其它許可在人體使用的乳酸菌表 達載體。
[0019] 有益效果：
[0020] 1、由于IA2P2為小膚，免疫原性較弱。而服P65的強抗原性可W起到免疫佐劑的 作用，可顯著增強與其結合的抗原膚的免疫原性，并且6次串聯IA2P2重復表位序列，也可W加強免疫原性。因此，本疫苗將6次串聯IA2P2重復表位序列與HSP65簇基端融合，更容 易產生高滴度、高特異性的抗體，從而對于I型糖尿病的治療效果更好。
[0021] 2、研究表明，HSP65自身有蛋白酶的催化活性，容易被自身的蛋白酶降解。運樣 就限制了熱休克蛋白的應用。在服P65的分離純化過程中，HSP65及其融合蛋白容易發生 降解。即使在純化過程中添加蛋白酶抑制劑或者對HSP65進行改構，也不能得到明顯抑制 HSP65降解的效果。因此，需要嚴格控制操作條件及利用組氨酸標簽系統來盡量減少熱休克 蛋白及其融合蛋白降解程度。運給純化過程造成極大不便，而本疫苗通過乳酸乳球菌作為 遞送融合蛋白服P65-6IA2P2的載體，使蛋白在機體中進行表達，巧妙地避免了蛋白降解的 問題，同時也省去了復雜的純化過程，間接的節約了生產成本，對于實現大規模生產有重要 意義。
[0022] 3、本疫苗選用PCYT質粒作為載體，適用于異源性抗原在乳酸菌中的誘導表達。 PCYT載體不僅能在E.coliD冊i中復制，而且可W在LactococcuslactisNZ90000中穩定 表達。
[0023] 4、傳統疫苗一般通過皮下注射的方式進行給藥，不僅存在安全性問題，而且運種 侵入式的給藥方式很難被接種者接受，尤其是青少年和兒童。而本疫苗打破程措，通過口服 給藥的方式，方便快捷，經濟適用，易為青少年兒童接受。經實驗證實，本疫苗經過抗體檢測 能穩定表達融合蛋白，實現粘膜給藥發揮藥效。
[0024] 5、本疫苗采用乳酸乳球菌作為載體。乳酸乳球菌不會在腸道內定植，也不會危害 腸道內正常益生菌群和造成潛在的基因污染。口服乳酸乳球菌試驗顯示其在腸道內能夠存 活3天，且4天后在排泄物中檢測不到任何關于乳酸乳球菌的特征基因標記。乳酸乳球菌 能夠順利避開胃酸的侵襲，但在十二指腸卻有大部分的被溶解，但其余的乳酸乳球菌能夠 在小腸的后段得到復蘇。小腸內環境溫和，腸道長度較長，蠕動緩慢。分泌表達的蛋白能定 向在運里得到較好的吸收，并被免疫細胞所識別。此外乳酸菌基因操作技術成熟，抗原蛋白 能穩定表達，也便