橡膠的產量。
[0019] 并且實驗顯示，本發明篩選得到的粘質沙雷氏菌HBRM-16 (Serratia marcescens subsp. Marcescens HBRM-16)有較強的嗜鐵能力、具有一定的產IAA能力、具有一定的解磷 能力、具有一定的固氮能力，并且對不同抗生素具有適應敏感性，為化學防治打下基礎。
【附圖說明】
[0020] 為了使本發明的內容更容易被清楚的理解，下面根據本發明的具體實施例并結合 附圖，對本發明作進一步詳細的說明，其中，
[0021] 圖 1 為粘質沙雷氏菌 HBRM-16 (Serratia marcescens subsp. Marcescens HBRM-16)的菌落形態；
[0022] 圖2為本發明所述HBRM-16菌株的生長曲線圖；
[0023] 圖3為本發明所述HBRM-16菌株對橡膠樹幼苗的促生作用測試結果；其中，大寫字 母代表1 %水平差異極顯著，小寫字母代表5 %水平差異顯著；
[0024] 圖4為本發明所述HBRM-16菌株產IAA能力的定性測定結果；
[0025] 圖5為本發明所述HBRM-16菌株產IAA能力的定量測定結果；
[0026] 圖6為本發明所述HBRM-16菌株的嗜鐵能力測定結果；
[0027] 圖7為本發明所述HBRM-16菌株的解磷能力測定結果；
[0028] 圖8為本發明所述HBRM-16菌株的固氮能力測定結果。
【具體實施方式】
[0029] 實施例1菌株HBRM-16的分離、純化及其ACC脫氨酶活性測定
[0030] 1. 1 采樣
[0031] 樣品為海南省東方市廣壩農場的橡膠樹根際土壤，采樣時避開路邊，施肥溝，選取 無明顯環境影響（包括水源污染、人為影響）的林段根據對角線法進行布點。將采集的帶 有根際土壤的橡膠樹細根放入塑料袋內并做好記錄。
[0032] 1. 2菌株分離純化
[0033] L 2. 1樣品處理
[0034] 取5段大小約Icm的根放入50mL無菌水中，浸泡lOmin，輕微震蕩處理5min，制成 懸浮液備用。
[0035] 1. 2. 2菌株分離純化
[0036] 吸取ImL懸浮液加入到50mLPAF培養液中，28°C、200r/min條件下振蕩培養24h， 從其中吸取ImL菌懸液重復轉接1次，第2次菌懸液中轉移ImL至50mL DF培養液中，28°C、 200r/min條件下振蕩培養24h，然后從中吸取ImL菌懸液加入到50mL ADF培養液中，28°C、 200r/min條件下振蕩培養24h，用于ACC脫氨酶活性細菌的篩選。梯度稀釋ADF培養液中 的菌懸液，并涂布于ADF固體平板，28°C恒溫箱中培養，待長出單菌落后挑取單菌落分離純 化。將初步篩選出來的菌株繼續涂布于以ACC為唯一氮源的固體培養基上培養，以反復驗 證各菌株利用ACC為唯一氮源生長的特性，重復3次。純化后保存于TSB斜面培養基，并以 含體積分數30%甘油的混懸液形式保存于-80°C冰箱中。經過上述初篩、復篩及純化的過 程，從橡膠樹根際土樣中分別分離到產ACC脫氨酶的菌株152株，并各自進行命名。
[0037] 1. 3菌株的ACC脫氨酶活性測定
[0038] I. 3. 1標準曲線的制定
[0039] 用 0· lmol/L(pH8. 5)Tris_HCI 配制 100mmol/L a-丁酮酸，4°C保存，用前母液稀 釋至10mmol/L。取出200uL a_ 丁酮酸梯度稀釋液（0. 1-1. Oumol)，分別加入300uL 0. 2% 2, 4-二硝基苯肼，混勻后于30°C溫育30min，加入2mL2mol/L NaOH顯色，在540nm處測定光 吸收值，以a- 丁酮酸濃度為橫坐標，光吸收值為縱坐標制成標準曲線。
[0040] 1.3. 2細胞懸液制備
[0041] 將菌株HBRM-16在TSB培養液中24h的純培養物4°C離心收集，用DF培養液（不 加（NH 4)2SO4)離心洗滌兩次，菌體懸浮于ADF培養液，在28°C旋轉搖床200rpm的條件下培 養24h，以誘導產生ACC脫氨酶。4°C離心收集菌體，用0. lmol/L Tris-HCl緩沖液（pH值 為7. 6)洗滌離心兩次，重懸浮于600uL 0. lmol/L Tris-HCl緩沖液（pH值為8. 5)中，加入 30uL甲苯并迅速振蕩30s以破碎細胞。
[0042] 1. 3. 3酶活測定
[0043] 取200uL的含甲苯的細胞提取物于I. 5ml離心管中，加入20uL 0. 5mol/L ACC，振 蕩混勾。于30°C保溫15min后，加入ImL 0. 56mol/L HC1，振蕩混勾，室溫下16000g離心 511^11。取11^上清液，加入8001^0.56111〇1/1!1(：1，混勻后，加入3001^2,4-二硝基苯肼， 混勾后于30°C保溫30min。然后用2.0mL 2mol/L NaOH顯色，于540nm處測定光吸收值。 以a- 丁酮酸制作標準曲線，根據提取液中a- 丁酮酸的含量，計算出單位時間ACC脫氨酶催 化ACC生成a- 丁酮酸的量，即單位酶活力，用μ mol/min表示。
[0044] 1. 3. 4菌體細胞抽提物中總蛋白含量測定
[0045] 采用Bradford比色法，以牛血清白蛋白為蛋白質（Pr)測定標準樣品。然后用單 位酶活除以總蛋白濃度即比活力（U/mg)表示ACC脫氨酶活性。
[0046] 通過測定，上述篩選得到的菌株中，菌株命名編號為HBRM-16菌株的ACC脫氨酶活 性最高，其酶活值為〇. 164U/mg。
[0047] 實施例2菌株HBRM-16的鑒定
[0048] 1、微生物學特性
[0049] 對在28°C培養箱中劃線培育的HBRM-16菌株進行形態特征觀察，如圖1所示，發現 HBRM-16菌株近球形短桿菌，革蘭氏染色陰性，周生鞭毛，有動力，無莢膜，無芽孢；在TSB培 養基上培養48h后，菌落近圓形，不透明且邊緣整齊，產紅色水溶性色素，中間紅色較深而 邊緣較淺，表面光滑，質地粘稠，易挑取，菌落平均直徑為8. 90mm，24h平均直徑為6. 80mm。
[0050] 2、分子生物學鑒定
[0051] 以菌株總DNA為模板，使用通用引物27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和反向 引物1492R(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'），進行16S rDNA擴增，引物由上海立菲生物技 術有限公司合成。
[0052] PCR反應體系（30ul) :10倍Taq mix 15ul，引物各0· 5ul，基因組DNAluL，加水至 30uL。PCR 反應程序：預變性：95°C，5min ;變性：94°C，Imin ;退火：55°C，Imin ;延伸：72°C， Imin ;35 個循環，延伸：72°C，10min，4°C保存。
[0053] 擴增出條帶后切膠回收并進行連接轉化，將陽性克隆送去上海立菲生物技術有限 公司進行。將所得序列與NCBI數據庫中的序列進行Blast分析，利用Mega 5.0軟件中 的鄰接法構建系統發育樹。通過比對分析，結果顯示與粘質沙雷氏菌的同源性為99. 86%， 因此推斷HBRM-16菌株為粘質沙雷氏菌，因此命名為粘質沙雷氏菌HBRM-16 (Serratia marcescens subsp. Marcescens HBRM-16)，并保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏編 號為 CCTCC M 2015670。
[0054] 3、生防菌的生理生化鑒定
[0055] (1)甲基紅試驗
[0056] ①培養液配制：稱取蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HP045g，分別溶解混勾后定容到 1000mL，調 pH 7.