桿狀病毒載體的制作方法
【專利說明】桿狀病毒載體
[0001] 本申請是2009年11月11日申請的PCT國際申請PCT/GB2009/002647于2011年 5月5日進入中國國家階段的、申請號為200980144325.4且發明名稱為"桿狀病毒載體"的 發明專利申請的分案申請。
[0002] 本發明涉及用于將基因插入到桿狀病毒序列的基因座中的轉移載體。本發明還涉 及使用轉移載體和衍生的桿粒和桿狀病毒的方法。
[0003] 已經將桿狀病毒表達系統用于在真核細胞中表達數以千計的蛋白質用于結構和 生物化學研究（14)。除了表達單個重組蛋白的能力之外，桿狀病毒系統也已用于共同表達 形成復合物的多種蛋白（15-22)。這一點是重要的，因為基因組范圍內的相互作用的篩選揭 示了活細胞的多種關鍵功能是由多亞基蛋白復合物完成的（23)。已經使用了兩種主要的策 略利用桿狀病毒系統實現蛋白質的共表達。使用各自表達一種重組蛋白的兩種或者多種病 毒共感染細胞是目前為止最常見的方法（19,24,25)。然而，這些研究中蛋白質復合物的產 率通常變化很大并且由兩種不同的桿狀病毒共感染相同的細胞不滿足泊松分布（poisson distribution) (26)。因此，盡管共感染方法在技術上簡單，但在實踐中其僅限于相對簡單 的復合物的回收，用于不需要大量純化蛋白的應用。
[0004] 對于例如結構研究和需要多種蛋白質的大規模的疫苗試驗的應用而言，以及對于 由多個亞基形成的更加復雜的復合物而言，使用了共表達來自插入到多角體蛋白或者PlO 位置的多個類似表達框中的的蛋白質的可選方法（15-18,22,27)。該方法的優點在于在培 養物中的每一個被重組病毒感染的細胞都以可再生的方式表達形成蛋白質復合物所需要 的蛋白質。將共感染和單獨桿狀病毒方法進行比較時，單獨桿狀病毒方法證明具有顯著更 高的重組復合物產率（28)。然而，使用單獨的重組病毒表達多種蛋白質并不是沒有缺點。 盡管棒狀的桿狀病毒看起來似乎對于其基因組中的插入相當有耐受力，但基因是通過同源 重組轉移到病毒，同時轉移載體的尺寸必須容易在大腸桿菌中操作。因此，對于能插入到轉 移載體中的基因的數目有限制。在實踐中，這意味著不大可能表達來自單個座位上的多于4 種的蛋白質。除此之外，桿狀病毒含有表達蛋白質的序列，該蛋白質促進同源重組（29-32)。 因此，含有大量重復序列的病毒容易發生重排和重組（21，33,34)。
[0005] 通過在桿粒的chiA/cathepsin基因座插入IoxP位點，修改了單獨桿狀病毒共表 達的方法，所述的桿粒已經在多角體蛋白基因座上含有Tn7的靶點（20)。這使得通過在大 腸桿菌中的重組在這些基因座的每一個中插入多個表達框。正如假定這個系統依賴于經過 修飾以表達不同基因的表達框的重復復制所預料的那樣，有證據顯示插入到該系統中在某 種程度上在遺傳上不穩定（21)。
[0006] 最近的桿狀病毒研究受益于ET重組系統的使用，該重組系統使得能夠選擇性地 敲除病毒的基因（35-49)。然而，還未檢驗這種技術改造和促進在plO和多角體蛋白之外的 基因座上表達蛋白的潛力。
[0007] 本發明涉及從單個的桿狀病毒基因組中有效地表達多種重組蛋白質（即桿狀病 毒蛋白質）的方法。該方法使得能夠使用ET重組系統在病毒基因組內的不同基因座上有 效地插入單個的蛋白質表達框。除此之外，該方法使得能表達具有多個亞基的復合物。
[0008] 已經完善地建立了使用桿狀病毒作為表達系統來表達單個的蛋白質。該表達系統 的基本方法學自從其首次產生以來變化很小。到133kb時桿狀病毒的dsDNA太大無法直接 操作。因此將編碼外來蛋白質的基因在大腸桿菌中克隆到含有來自AcMNPV昆蟲病毒的表 達框的載體中，隨后將其與病毒DNA-起引入到昆蟲細胞中，在昆蟲細胞中病毒和細胞的 蛋白質介導同源重組，導致表達外源蛋白質的感染性（相對于昆蟲細胞）病毒的產生。在這 一主旨下，已經產生了一些變化，包括如果發生重組僅僅復制的病毒基因組（1，2)，和在大 腸桿菌中使用桿粒進行重組從而加快重組病毒的選擇，所述的桿粒基于轉位子Tn7 (3)的 使用。通過使用以上簡述的桿狀病毒表達系統，還實現了多蛋白復合體在昆蟲細胞中的表 達。最初使用各自表達單一蛋白質的多種病毒共感染易感細胞和在表達之后純化的蛋白質 復合物。然而，這充其量也沒有效力并且重復性不足以用于擴大規模。作為選擇，生產了將 多個表達單元整合但是與單個的病毒基因座重組的載體（4-6)。這些載體的優點在于它們 在每一個受感染的細胞中生產全部的重組蛋白亞基，并導致顯著更高的重組蛋白復合物的 產率。除此之外，由于僅有一種病毒表達所有的蛋白，感染的結果更加具有可重復性。這些 載體的缺點是雙重的。首先，該載體含有重復的序列，并且所述的桿狀病毒表達促進同源組 合、表達的蛋白質，尤其是來自含有三個或者四個表達單元的蛋白質，并且所述的蛋白質通 過大量的病毒傳代（其在工業規模中對于桿狀病毒蛋白質表達是必要的）并不總是在遺傳 上非常穩定。第二，實踐中對于可以在大腸桿菌中容易保持和操作的插入物的大小有限制， 限制了可以從這些載體中表達的蛋白質的數目。為了生產多種蛋白質，提出的另一種方法 是在桿狀病毒的一個基因座上插入外來蛋白質，隨后選擇表達該蛋白的病毒，并使用該病 毒基因組在第二個基因座上重組，從而表達其他的蛋白質（7)。然而，由于在此方法中涉及 的高水平的技術技能和時間的量（第一個座位16天以及各個隨后的座位各25天），這種方 法基本未曾使用。最近的開發旨在修飾基于BAC的Τη7轉位子，以便在桿狀病毒的第二個 基因座中插入LoxP位點，從而使得能在大腸桿菌中的該座位上插入額外的基因（8)。然而， 本方法仍然存在下述問題，即在細菌載體中來自啟動子的復制的重復序列意味著對于多個 病毒傳代而言，該構建物在遺傳上不穩定，并且轉移載體會迅速地達到在大腸桿菌中操作 的最大實際尺寸。
[0009] 本發明的方法克服了現有方法中固有的至少一些問題，例如遺傳不穩定性，以及 對多輪重組的需要。
[0010] 根據第一個方面，本發明提供了用于將基因插入到桿狀病毒序列的基因座中的轉 移載體，該轉移載體包括：
[0011] 表達框，所述表達框包括與基因可操作地連接的真核啟動子；
[0012] 雙向選擇框，該雙向選擇框包括：
[0013] (i)編碼第一個選擇標記的可表達序列；和
[0014] (ii)編碼第二個選擇標記的可表達序列；和
[0015] 位于表達和雙向選擇框側翼的序列，其中所述的序列大體上對應于桿狀病毒序列 中基因座的序列。
[0016] 本發明的轉移載體可以用于將基因有效地插入到桿狀病毒序列的基因座中，并選 擇包含該基因的桿狀病毒序列。特別地，已經發現，與使用單個選擇標記相比，通過使用雙 向選擇框，陽性克隆（即含有所插入的基因的桿狀病毒序列）的鑒定獲得了大幅度增加。這 與使用單個的選擇標記相比，具有顯著優勢。僅有少量的桿狀病毒被轉化，所以標記僅僅以 很低的水平表達。例如，如果該標記具有抗生素抗性，則只能使用非常低水平的抗生素。這 導致了對細菌變體的選擇，該細菌變體對于所使用的抗生素具有抗性。因此，一些在平板上 生長的細菌可以不含有修飾。使用兩種陽性選擇方法克服該假陽性的選擇。
[0017] 本發明的轉移載體可以是任意適用的載體，只要其能夠通過同源重組與桿狀病毒 序列重組，從而將基因插入到桿狀病毒的序列中。適用的轉移載體對于本領域技術人員而 言是熟知的。所述的轉移載體的關鍵特征在下文中進一步地討論。
[0018] 插入到桿狀病毒序列中的基因可以是任意的異源基因（即非桿狀病毒基因）。優 選的是該異源基因編碼蛋白質復合物的亞基。所述異源基因可以編碼病毒蛋白、受體的組 分或者分子伴侶復合物。尤其優選的是，該異源基因編碼病毒蛋白，該病毒蛋白與其他的 病毒蛋白一起可以形成病毒樣顆粒（VLP)。
[0019] 基因插入到桿狀病毒序列處的基因座可以是任意適用的基因座，該基因座允許所 插入的基因的表達，并且不阻礙桿狀病毒序列復制的能力。此外，所使用的座位不應該影響 桿狀病毒感染細胞的能力，即復制或者從細胞傳播到細胞的能力。該座位包括多角體蛋白 和plO座位。此外，本發明人鑒定的其他適用的座位包括ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2 和 odv_e56。
[0020] 所述的桿狀病毒序列可以是能夠在昆蟲細胞及原核細胞如大腸桿菌中復制的任 何適用的桿狀病毒。特別地，可以使用含有BAC復制子的任何病毒性桿狀病毒基因組。適 用的桿狀病毒序列包括AcMNPV桿粒。
[0021] 術語"表達框"指基因表達所需的元件的組合。因此，表達框包括適合的啟動子， 從而使得所編碼的基因在真核細胞細胞（即昆蟲細胞）中表達，以及位于基因序列側翼的 適合的聚腺苷酸化信號序列。用于在真核細胞中表達基因的表達框對于本領域的技術人員 而言是熟知的。特別優選的啟動子包括桿狀病毒晚期啟動子（例如P35)或者病毒性極晚 期啟動子（例如多角體蛋白和PlO啟動子）。適合的聚腺苷酸化信號序列包括色氨酸羥化 酶（Tph)聚腺苷酸化序列，或者來自桿狀病毒基因的聚腺苷酸化序列。
[0022] 所述的表達框可以包含不止一個基因（例如2、3或者4個基因），這導致不止一個 基因的表達。然而，通常優選的是所述表達框包括單個的基因。
[0023] 已經發現所述的雙向選擇框提高了已成功接受基因的克隆的鑒定和分離。所述的 雙向選擇框包含2個不同的選擇標記。所述的框還包含在細菌細胞中表達標記所需的任意 元件，如一個或多個細菌啟動子。選擇已接受基因的序列的步驟包括選擇包括兩個選擇標 記的序列。這一選擇步驟在細菌細胞，如大腸桿菌中進行。所述的選擇標記可以是使得細 胞含有要選擇的框的任何標記。例如，所述的標記可以是可視的，例如導致細胞或者菌落出 現顏色或者顏色變化的標記。可選地，該標記可以賦予例如對抗生素的抗性。兩個選擇標 記可以是同樣類型的標記，例如耐受兩種不同的抗生素，或者不同類型的標記，例如抗生素 抗性和可視的標記。第一個選擇標記優選地為可視的標記，例如LacZalpha片段，該標記使 得表達LacZalpha片段的細胞在IPTG和X-gal的存在下顯示藍色。第二個選擇標記優選 地是任意的賦予抗生素抗性的標記，例如對氯霉素、四環素、嘌呤霉素、氨芐西林、青霉素、 阿泊拉霉素、卡那霉素或者腐草霉素產生抗性。特別優選的是，第二種標記賦予對腐草霉素 的抗性。
[0024] 在優選的實施方案中，所述的雙向選擇框的側翼為LoxP重組序列。在Cre重組酶 的存在下，LoxP重組序列的聯合在一起，導致內含子的缺失。因此，當將任意附加的基因 插入到桿狀病毒序列中時，可以將所述的雙向選擇框除去，從而使得可以使用同樣的選擇 標記。優選地，對所述的LoxP位點進行修飾從而確保在位點之間僅發生單輪重組。適用的 經修飾的LoxP位點對于本領域的技術人員而言是已知的，例如經修飾的Lox66和Lox71位 點。
[0025] 在表達框和雙向選擇框側翼的序列基本上對應于基因座的序列，使得在轉移載體 和桿狀病毒序列之間能發生同源重組。每個側翼序列的長度優選地至少20bp，更優選地至 少30bp，以及甚至更優選地至少50bp，并且具有允許與基因座的序列發生特異性重組的序 列。
[0026] 根據第二個方面，本發明提供了生產重組桿粒的方法，該方法包括：
[0027] 將桿粒和根據本發明第一個方面的轉移載體結合在一起從而允許同源重組發生； 和
[0028] 選擇包含雙向選擇框的重組桿粒。
[0029] 重組桿粒可以使用標準技術進行選擇，所述的技術取決于所述雙向選擇框。
[0030] 用于生產重組桿粒的方法可以額外地包括檢測桿粒或者其表達產物中基因的存 在。根據具體的基因可以使用合適的篩選方法。
[0031] 除此之外，如果選擇框側翼是LoxP重組序列，則所述的方法優選地包括在L