雞傳染性法氏囊病超強毒df-1細胞適應株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及動物病毒學領域，具體地說，涉及雞傳染性法氏囊病超強毒DF-1細胞 適應株及其應用。
【背景技術】
[0002] 雞傳染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease, IBD)，是由法氏囊病毒（IBDV) 引起的雞的一種高度接觸性傳染病。法氏囊病病毒屬于雙RNA病毒科，禽雙RNA病毒屬。法氏 囊病毒有兩個血清型，I型法氏囊病毒對雞有致病力，Π 型病毒對雞無致病力。該病于1979 年傳入我國并開始大面積流行，隨著法氏囊疫苗的應用，該病得到了一定程度的控制，但根 據流行病學調查結果顯示，近些年來該病呈現出新的流行特點：發病日齡明顯變寬，最早有 3日齡發病的報道，最長可延長到200日齡的產蛋雞，而且高日齡雞群患傳染性法氏囊病有 形成區域性爆發的報道;發病率和病死率都有所提高，而且發病雞群多為免疫雞群，這一特 點說明，I型病毒存在變異株和超強毒株(vvIBDV)，能突破傳統疫苗的保護。雞血液中傳統 疫苗株高滴度的抗體并不能完全抵抗vvIBDV的攻擊。臨床癥狀與經典毒株相同，病變更嚴 重，可使法氏囊、胸腺、脾臟和骨髓嚴重損傷；IBDV的感染力有所增強，傳播途徑增多，IBDV 在體內及外環境中存活時間延長，對外界各種理化變化的抵抗能力有所增強，致使本病的 傳播途徑增多，可通過消化道和呼吸道及其他各種形式接觸感染;繼發或并發感染嚴重，由 于法氏囊是中樞免疫器官，因此感染傳染性法氏囊病后能造成機體不同程度的免疫抑制， 使雞群生長發育產生不同程度的受阻;此外由于環境衛生差，飼養管理混亂，飼料營養價值 不全，會造成大腸桿菌、支原體、球蟲病等嚴重繼發或并發，給診斷和治療增加了難度，使死 亡率增加。針對這種情況，分離最新的法氏囊超強毒流行毒株，篩選、培育出免疫原性好、 且可以適應細胞系繁殖的種毒，應用于規模化生產，研制生產實際需要的IBD疫苗產品對于 該病的預防和控制具有極其重要的意義。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供雞傳染性法氏囊病超強毒DF-1細胞適應株（即雞傳染性法氏 囊病病毒IBDV-LY23株)及其應用。
[0004] 為了實現本發明目的，本發明人從山東臨沂地區發生疑似IBD疫情的雞場采集出 現典型癥狀和病理變化的病雞法氏囊、脾臟組織，經標準化方法處理后，分離得到CK/SD/ LY/2014株。對該分離株進行了致病性試驗，克隆其主要保護性抗原基因 VP2,并進行了序列 分析和比較。結果表明，該分離株VP2基因具有222六、2421、2790、2561、284六、2941和2993等 超強毒株特征性氨基酸，與疫苗株B87、D78核苷酸酸同源性為94.9%、95.1 %，與歐洲標準 超強毒UK661株核苷酸同源性為97.6%，氨基酸同源性為99.6%。其對SPF雞胚半數致死量 (ELD 5Q)為107·17/0.2πι1，以104ELD 5Q/只的劑量接種4周齡SPF雞，死亡率達90%。從而證實傳 染性法氏囊病病毒CK/SD/LY/2014為一株符合歐洲超強毒標準和特點的國內超強毒株。
[0005] 該CK/SD/LY/2014株經雞胚盲傳 5代后，又經雞成纖維細胞DF-1連續傳代15代，結 果表明病毒在細胞上穩定地大量增殖，病毒對10日齡SPF雞胚的ELD5Q為106'38/0.2ml，細胞 半數感染量(TCID5Q)為108'5TCID5Q/ml。進而篩選得到本發明的雞傳染性法氏囊病超強毒 DF-1細胞適應株，命名為IBDV-LY23株，分類命名為:雞傳染性法氏囊病病毒，保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科 學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCC No. 11594,保藏日期2015年11月19日。
[0006] 將本發明的雞傳染性法氏囊病超強毒DF-1細胞適應株IBDV-LY23以同步接毒的 方式進行批量培養，收獲病毒，將其滅活后制備成疫苗，免疫雞體后經檢測具有良好的免疫 原性，對超強毒IBD/SD/LY/2014的致死性攻擊，具有100%的保護率。與國內外部分同類疫 苗進行的比較研究中，本超強毒滅活苗抗體陽性率、抗體滴度及對超強毒的保護率，在參與 比較的疫苗中，均居于首位。
[0007] 本發明還提供所述雞傳染性法氏囊病超強毒DF-1細胞適應株在制備雞傳染性法 氏囊病疫苗中的應用。
[0008] 前述的應用，將IBDV-LY23株的滅活病毒液與佐劑按一定比例混合即得雞傳染性 法氏囊病疫苗。
[0009] 其中，所述IBDV-LY23株優選用β-丙內酯滅活。所述佐劑為MONTANIDE ISA 71 VG。
[0010] 進一步地，前述應用具體為：將IBDV-LY23株用β-丙內酯滅活，將滅活病毒液與 MONTANIDE ISA 71 VG按照重量比3:7混合，經乳化得到所述疫苗。
[0011] 本發明還提供一種預防雞傳染性法氏囊病的疫苗組合物，所述疫苗組合物的有效 成分包含滅活后的雞傳染性法氏囊病超強毒DF-1細胞適應株。
[0012] 本發明提供的雞傳染性法氏囊病超強毒DF-1細胞適應株IBDV-LY23可在DF-1細胞 上連續傳代培養，TCID5Q達到108'5/mL，將其滅活后制備成疫苗，免疫雞體后經檢測具有良好 的免疫原性，對超強毒IBD/SD/LY/2014的致死性攻擊，具有100 %的保護率，同時安全性高、 效力穩定、持續期長。可將本發明的毒株IBDV-LY23作為疫苗株預防雞傳染性法氏囊病，對 預防、控制雞傳染性法氏囊超強毒流行具有重要的價值。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發明實施例2中CK/SD/LY/2014株VP2基因的RT-PCR檢測結果；其中，Μ為 Trans2K plus Markers: 1 為VP2基因的RT-PCR產物。
【具體實施方式】
[0014] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0015] 實施例1傳染性法氏囊病毒CK/SD/LY/2014株分離與鑒定
[0016] 2014年8月，山東臨沂地區某雞場發生疑似IBD疫情，無菌采集出現典型癥狀和病 理變化的病雞法氏囊、脾臟組織，剪碎研磨，稱重量后分別按照1:3的重量比加入滅菌的 PBS，4°C、6000r/min離心 1 Omin，4°C、8000r/min離心 1 Omin，取上清液轉入另一無菌 1 · 5ml 離 心管中，加入雙抗(終濃度為青霉素2000IU/ml，鏈霉素2mg/ml)，37°C作用lh，經尿囊膜接種 10日齡SPF雞胚各5枚，0.2mL/枚。棄去24h內死亡的雞胚，以后每隔6h觀察1次，收取死亡雞 胚，至144小時取出所有雞胚尿囊膜及胚體，組織搗碎，用含青鏈霉素的無菌PBS做2倍稀釋， 記為El代，留樣檢測，病毒分離物置于-70°C保存。
[0017] 瓊脂擴散試驗(AGP):
[0018] 將上述El代病毒離心取上清液與IBD標準陽性血清進行瓊脂擴散試驗，并設標準 抗原與標準陽性血清對照孔，在37°C溫箱中放置24h后觀察結果。約36h，El代病毒上清液與 標準陽性血清孔之間出現了乳白色清晰沉淀線，與陽性對照組相同，而陰性對照組無沉淀， 結果表明IBDV陽性。將其命名為CK/SD/LY/2014株。
[0019] 實施例2傳染性法氏囊病毒CK/SD/LY/2014株生物學特性測定
[0020] 雞胚接種試驗：
[0021] 用絨毛尿囊膜(CAM)接種法將上述E1代病毒上清液按每胚0.2mL接種于10枚9~10 日齡SPF雞胚，設等劑量的無菌PBS液為陰性對照組。置37°C孵化箱繼續孵化，每12h照蛋檢 查1次，棄掉24h內死亡胚，記錄雞胚死亡和病變情況，接種觀察至144h后，收取所有存活雞 胚并觀察病變。雞胚在接種后48~72h內死亡，死亡胚尿囊膜增厚，腹部腫脹，剖檢可見，雞 胚肝臟黃色變性，并伴有斑駁狀壞死，與IBDV所致病變相符。
[0022] RT-PCR 檢測：
[0023] 利用核酸抽提試劑盒提取IBDV核酸，按照Promega公司AMV反轉錄酶產品說明書進 行RT-PCR檢測和VP2基因擴增。經過RT-PCR擴增，電泳后出現1條約1300bp大小的條帶，符合 預期大小（圖1)。對分離毒株VP2基因核苷酸序列及相對應的氨基酸序列進行分析，結果表 明該分離株VP2基因具有222A、2421、279D、2561、284A、2941和299S等超強毒株特征性氨基 酸，與疫苗株B87、D78核苷酸酸同源性為94.9%、95.1 %，與歐洲標準超強毒UK661株核苷酸 同源性為97.6 %，氨基酸同源性為99.6 %。
[0024] CK/SD/LY/2014株VP2第212位氨基酸發生突變(D-N)，IBDV流行株在VP2上的212 位氨基酸的變異(D-N)是近年來國內IBDV新分離株的顯著特點。
[0025]致病力測定：
[0026]雞胚半數致死量(ELD5Q)的測定：
[0027] 將E1代病毒上清液，經絨毛尿囊膜(CAM)途徑接種10日齡SPF雞胚，按10倍遞進稀 釋，取1〇_4~共7個稀釋度，每個稀釋度接種5枚雞胚，接種劑量為0.2mL/枚，在37°C孵化 箱繼續孵化，棄掉24h內死亡的雞胚。以后每日照胚12h照蛋1次，觀察至168h，詳細記錄各組 雞胚死亡情況及胚體病變，根據Reed-Muech計算尿囊膜懸液中病毒的ELD 5Q為107·1 V〇. 2mL 讀1)。
[0028] 表1 CK/SD/LY/2014株病毒滴度測定 [0029]
[0030J 雞體回歸試驗：
[0031] 將30只4周齡SPF雞隨機分成兩組，一組20只，經口接種E1代病毒上清液，每只 0.2mL(104ELD5Q)，另一組10只，相同途徑接種等量的滅菌PBS做為正常對照組。接種后每天 觀察各組雞臨床表現，對病死雞進行剖檢，并記錄死亡數量及病理變化。
[0032]接種后2d雞開始發病，雞群發病率達到100%，病雞羽毛蓬松，采食減少，扎堆，精 神萎靡。接種后3d開始陸續死亡，其死亡高峰在接種后3d~4d，死亡率達到91.67%。剖檢可 見法氏囊腫脹，內有干酪樣物質或血塊，多數法氏囊呈"紫葡萄狀"，腿部、胸部肌肉有出血， 腎臟腫脹且有尿酸鹽沉積。對照組均正常(表2)。
[0033] 表2 CK/SD/LY/2014分離株對4周齡SPF雞的致病性試驗
[0034]
[0035] 實施例3細胞適應株的篩選及鑒定
[0036] 將E1代CK/SD/LY/2014病毒液用雞胚盲傳至E5代。將DF-1細胞按照3 X 105/孔的劑 量鋪于6孔板，將E5代病毒液用DMEM進行10倍梯度稀釋至10-4~10-8。將長至單層的DF-1細 胞用不含血清的DMEM沖洗2遍，然后將稀釋好的病毒液接種于DF-1細胞，每個稀