促進骨髓間充質干細胞成骨再生關鍵基因高表達的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域中的一種促進骨髓間充質干細胞成骨再生關鍵基因高表達的方法。
【背景技術】
[0002]骨組織缺損是因外傷、感染、腫瘤等因素使機體喪失一些骨質從而形成較大間隙，這一問題在臨床較為常見并且較難處理。如何促進骨組織缺損的修復，一直是該領域研究人員研究的重點。近年來，隨著骨組織工程技術的發展，這一問題得到了一定程度的解決。在骨組織工程中需要支架材料和種子細胞的相互結合才能發揮其應有的作用，而種子細胞的選擇尤為重要，早期研究人員選用骨細胞和骨髓基質細胞，但是這些種子細胞取材困難，容易對患者造成二次傷害。因此，研究人員將種子細胞的目標鎖定在了間充質干細胞。間充質干細胞有著低免疫原性的特性，并且具有多向分化的潛能，在一定的條件下可分化為成骨細胞、成脂肪細胞和成軟骨細胞等成熟的細胞。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是間充質干細胞的一種，具有多向分化的潛能，并且植入體內后能進繼續產生成骨活動。在這一過程中決定骨再生的關鍵轉錄因子RUNX和Osterix的基因表達均上調，以及骨再生早期的典型代表因子-骨橋蛋白基因(0ΡΝ)和堿性磷酸酶(ALP)亦會表達上調，但是要充分發揮骨髓間充質干細胞的成骨能力，首先在體外需要有成骨誘導液誘導的情況下其才能向成骨細胞方向分化，并且細胞誘導這一過程需要至少14天的時間。因此，如何縮短成骨誘導時間或避免成骨誘導這一步驟，顯的尤為重要，本發明采用的一種新的培養體系，在骨髓間充質干細胞正常培養時使用本發明的培養體系，骨髓間充質干細胞在維持其原有干性的同時，決定成骨再生的相關因子的基因表達上調，為應用骨組織工程治療骨缺損提供了必要的種子細胞，也為骨組織工程治療骨缺損縮短了時間。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于提供一種促進骨髓間充質干細胞成骨再生相關基因表達上調的培養體系，采用本發明的培養體系培養骨髓間充質干細胞，骨髓間充質干細胞不僅保持較高的干性，而且促進骨髓間充質干細胞內成骨再生關鍵轉錄因子(0SteriX、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(0PN、ALP)的基因高表達。
[0004]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:
[0005]—種促進骨髓間充質干細胞成骨再生關鍵基因高表達的方法，步驟如下:
[000?]⑴骨髓間充質干細胞的分離:獲取無菌的骨髓，無菌條件下1500rpm離心5min;棄去上清液，使用無菌磷酸緩沖液反復沖洗，1500rpm離心5min，棄上清;磷酸緩沖液等倍稀釋混勾沉淀，緩慢添加到淋巴分離液上，2000rpm離心20min ；收集白膜層單核細胞于新的無菌的離心管內，磷酸緩沖液清洗，1500rpm離心5min;棄上清，用培養液重懸沉淀，計數，以1 XlOVcm2接種至培養瓶中培養，培養液分別采用a-MEM+10%FBS和a-MEM+5 %血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1 ；
[0007]⑵骨髓間充質干細胞的消化、傳代，待骨髓間充質干細胞長至80%時，采用0.05%的胰蛋白酶+0.02%的EDTA對其進行消化，以1 X 104cells/cm2傳至新的培養瓶中。
[0008]而且，取兩種培養體系培養的第三代骨髓間充質干細胞進行流式鑒定，兩種培養體系培養的骨髓間充質干細胞陽性率均高于95%，陰性率均低于5% ;
[0009]而且，取第三代骨髓間充質干細胞，提取RNA-反轉錄獲得cDNA-進行Q-PCR，比較兩種培養體系培養的骨髓間充質干細胞成骨再生相關的轉錄因子Oster ix和RUNX基因和骨再生早期典型代表因子基因0ΡΝ和ALP的表達量。
[0010]一種促進骨髓間充質干細胞成骨再生關鍵基因高表達體系，a-MEM+5%血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1。
[0011]本發明的有益效果是:
[0012]⑴本發明采用一種新的培養體系，從骨髓間充質干細胞原代開始用該培養體系進行培養，與傳統的培養體系相比較，本發明采用的培養體系培養出的骨髓間充質干細胞內決定成骨再生的關鍵轉錄因子(0SteriX、RUNX)的基因以及骨再生早期代表性因子的基因-骨橋蛋白(0ΡΝ)和堿性磷酸酶(ALP)明顯高表達。
[0013]⑵應用本發明的培養體系培養骨髓間充質干細胞不僅骨髓間充質仍然保持較高的干性，而且其可以促進骨髓間充質干細胞成骨再生的關鍵轉錄因子(0SteriX、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(0PN、ALP)的基因高表達，這為臨床應用骨組織工程治療骨缺損提供了理想的種子細胞。
[0014]⑶采用本發明的培養體系培養的骨髓間充質干細胞作為種子細胞用于骨組織工程治療骨缺損，避免了骨髓間充質干細胞體外成骨誘導的步驟，為臨床應用骨組織工程治療骨缺損縮短了至少14天的時間。
【附圖說明】
[0015]圖1為Osterix的mRNA表達水平(相對熒光強度)；
[0016]圖2為RUNX的mRNA表達水平(相對熒光強度)；
[0017]圖3為0ΡΝ的mRNA表達水平(相對熒光強度)；
[0018]圖4為ALP的的mRNA表達水平(相對熒光強度)；
【具體實施方式】
[0019]下面結合附圖并通過具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護范圍。
[0020]—種促進骨髓間充質干細胞成骨再生關鍵基因高表達的方法，步驟如下:
[°021 ]⑴骨髓間充質干細胞的分離:獲取無菌的骨髓，無菌條件下1500rpm離心5min;棄去上清液，使用無菌磷酸緩沖液反復沖洗，1500rpm離心5min，棄上清;磷酸緩沖液等倍稀釋混勾沉淀，緩慢添加到淋巴分離液上，2000rpm離心20min ；收集白膜層單核細胞于新的無菌的離心管內，磷酸緩沖液清洗，1500rpm離心5min;棄上清，用培養液重懸沉淀，計數，以1 X106/cm2接種至培養瓶中培養，培養液分別采用a-MEM+10%FBS和a-MEM+5 %血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1 ；
[0022]⑵骨髓間充質干細胞的消化、傳代，待骨髓間充質干細胞長至80%時，采用0.05%的胰蛋白酶+0.02%的EDTA對其進行消化，以1 X 104cells/cm2傳至新的培養瓶中；
[0023]⑶取兩種培養體系培養的第三代骨髓間充質干細胞進行流式鑒定，兩種培養體系培養的骨髓間充質干細胞陽性率均高于95%，陰性率均低于5% ;
[0024]⑷取第三代骨髓間充質干細胞，提取RNA-反轉錄獲得cDNA-進行Q-PCR，比較兩種培養體系培養的骨髓間充質干細胞成骨再生相關的轉錄因子(Osterix、RUNX)基因和骨再生早期典型代表因子基因(0PN、ALP)的表達量。
【主權項】
1.一種促進骨髓間充質干細胞成骨再生關鍵基因高表達的方法，其特征在于:步驟如下: ⑴骨髓間充質干細胞的分離:獲取無菌的骨髓，無菌條件下1500rpm離心5min;棄去上清液，使用無菌磷酸緩沖液反復沖洗，1500rpm離心5min，棄上清;磷酸緩沖液等倍稀釋混勾沉淀，緩慢添加到淋巴分離液上，2000rpm離心20min ；收集白膜層單核細胞于新的無菌的離心管內，磷酸緩沖液清洗，1500rpm離心5min;棄上清，用培養液重懸沉淀，計數，以1 X 106/cm2接種至培養瓶中培養，培養液分別采用a-MEM+10 %FBS和a-MEM+5 %血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1 ； ⑵骨髓間充質干細胞的消化、傳代，待骨髓間充質干細胞長至80 %時，采用0.05 %的胰蛋白酶+0.02%的EDTA對其進行消化，以1 X 104cells/cm2傳至新的培養瓶中。2.根據權利要求1所述的促進骨髓間充質干細胞成骨再生關鍵基因高表達的方法，其特征在于:取兩種培養體系培養的第三代骨髓間充質干細胞進行流式鑒定，兩種培養體系培養的骨髓間充質干細胞陽性率均高于95%，陰性率均低于5%。3.根據權利要求1所述的促進骨髓間充質干細胞成骨再生關鍵基因高表達的方法，其特征在于:取第三代骨髓間充質干細胞，提取RNA-反轉錄獲得cDNA-進行Q-PCR，比較兩種培養體系培養的骨髓間充質干細胞成骨再生相關的轉錄因子Oster ix和RUNX基因和骨再生早期典型代表因子基因0PN和ALP的表達量。4.一種促進骨髓間充質干細胞成骨再生關鍵基因高表達體系，其特征在于: a-MEM+5%血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1。
【專利摘要】本發明涉及一種促進骨髓間充質干細胞成骨再生關鍵基因高表達的方法，步驟如下：骨髓間充質干細胞的分離：獲取無菌的骨髓，經過前處理用培養液重懸沉淀，計數，以1×106/cm2接種至培養瓶中培養，培養液分別采用a-MEM+10％FBS和a-MEM+5％血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1。采用本發明的培養體系培養的骨髓間充質干細胞作為種子細胞用于骨組織工程治療骨缺損，避免了骨髓間充質干細胞體外成骨誘導的步驟，為臨床應用骨組織工程治療骨缺損縮短了至少14天的時間。
【IPC分類】C12N5/0775
【公開號】CN105441389
【申請號】CN201510934333
【發明人】趙剛, 馬潔, 劉微微, 高偉瑋
【申請人】天津市康婷生物工程有限公司
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年12月15日