偶聯分子于顆粒的制作方法
【專利說明】偶聯分子于顆粒 發明領域
[0001] 本發明涉及連接靶分子(例如抗體、酶、鏈霉、A蛋白、G蛋白、脂蛋白或糖蛋白）與其 它分子(例如其它蛋白質、標簽、染料、合成聚合物和/或納米粒子）。更具體地，本發明涉及 一種方法，所述方法用于設計和生產具有可控比例的兩種或多種分子(例如生物分子、標 簽、染料、合成聚合物和/或納米粒子)的顆粒偶聯物。
[0002] 發明背景
[0003] 在生命科學研究的許多應用(例如藥物研發和診斷）中，有必要采用簡單的工藝將 生物分子，例如肽、蛋白質、多核苷酸和碳水化合物彼此連接，或者與小分子和生物(例如， 蛋白質和多核苷酸)藥物、染料、標簽、合成聚合物和納米粒子連接。現有技術中已存在多種 方法（例如Hermanson等，生物結合技術：學術出版社，1996年（Hermanson，et al ·， Bioconjugate Techniques:Academic Press，1996))〇
[0004] 簡言之，與生物分子形成多功能偶聯物的兩個關鍵要求是，最大程度降低對生物 分子功能的損害，以及控制形成偶聯物的兩種或多種分子的比例。這取決于相互連接的分 子的大小以及應用，可能僅需要將每種類型的一個分子彼此偶聯。另一種方法是將一種類 型的多個分子偶聯至更大的生物分子。例如，如果分子A和B需要彼此連接，無功能損害地形 成A-B，獲得3個A-B在分子水平上不是那么簡單的。很有可能的是，1個A可與1個、2個或更多 個B連接，并且類似地，1個B可與1個、2個、或更多個A連接。可能是A和B與其自身連接，以及， 作為多種連接的結果，也可能仍有完全不能與另一分子形成連接的A和B。根據進行偶聯的 分子以及所使用的方法，產生了不同實體的群體，而在大多數情況下，在不同批次之間實現 均勻性和一致性是有挑戰性的過程。
[0005]已經采用了許多不同的連接化學物質試圖最大程度降低與生物分子形成偶聯物 中一致性和再現性方面的困難。一種完全不同的形成偶聯物的方法是，連接不同的分子至 一個共同的載體，例如一些納米或微小尺寸的顆粒，而不是直接連接此類分子。例如，可以 在顆粒表面產生羧酸，用于含氨基的生物分子的反應，可以在顆粒上產生馬來酰亞胺或溴 乙酰基團，用于與硫醇的反應，并且幾乎任一連接方法可應用于顆粒表面形成兩種或多種 不同分子的偶聯物。然而，隨著顆粒變得越來越小，均勻性和再現性這一同樣的問題出現 了。在顆粒表面產生不同的官能團以獲得正交偶聯，有可能解決這些困難，但在最后，不同 官能團的形成需要從顆粒上共同的起始基團開始，均勻性和再現性這一同樣的問題又出現 了。
[0006] 上述討論的連接方法的示例見于Lim，l-I.s.等.（2008)納米技術，第19卷，第1-11 頁（Lim, I-I · S. et al · (2008)Nanotechnology，vol · 19，ρ· 1-11)，其中描述了蛋白質包裹金 和磁性氧化物/金核/殼納米粒子的合成及表征。這篇文章中描述的體系都使用二硫代雙 (琥珀酰丙酸）（DSP)將蛋白質連接至納米粒子。出于上述原因，形成偶聯物的新方法宜無需 使用這些類型的連接劑。
[0007] 說明書中參考的任何現有技術不是，也不應當認為是承認或任何形式的暗示，該 現有技術在任何司法管轄權限內形成公知常識的一部分，或者本領域技術人員能夠合理預 期該現有技術并認為是相關的。
[0008] 發明綜述
[0009] 本發明人發現，本發明的納米粒子和微粒子能夠連接分子、聚合物和其他顆粒以 得到預定的和期望的多功能實體，所述實體含有以各自特定比例存在的不同分子。
[0010] 因此，本發明涉及一種顆粒，包含：
[0011] -表面；
[0012] -至少部分包覆該表面的過渡金屬離子;和
[0013] _第一靶分子和第二靶分子，其中所述第一和第二靶分子彼此不同，
[0014] 其中，所述顆粒是由一種或多種基材分子或多種原子形成，并且其中所述過渡金 屬離子與顆粒表面的基材分子或原子顆粒，以及至少一個第一靶分子和至少一個第二靶分 子形成配位鍵，從而將第一和第二靶分子連接至顆粒上。
[0015] 在一實施例中，所述顆粒為納米粒子。
[0016] 本發明也涉及一種組合物，包括：
[0017] -由一種或多種基材分子或原子形成的顆粒；
[0018] -具有與過渡金屬離子形成配位鍵的基團的配體；
[0019] -與所述一種或多種基材分子或原子形成配位鍵的過渡金屬離子。
[0020] 在一實施例中，組合物中包含的所述顆粒不具有連接于基材分子或原子以便連接 過渡金屬離子的接頭。所述組合物可進一步包括第一靶分子和第二靶分子，其中所述第一 和第二靶分子彼此不同。
[0021 ] 在一實施例中，所述顆粒為納米粒子。
[0022] 本發明也涉及由多種過渡金屬離子形成的顆粒，包括：
[0023] -表面；
[0024] -第一捕獲分子和第二捕獲分子，其中所述第一和第二捕獲分子彼此不同；
[0025] 其中，在顆粒表面，所述顆粒的過渡金屬離子與第一和第二捕獲分子形成配位鍵， 從而將第一和第二捕獲分子與顆粒連接。
[0026] 在一實施例中，所述第一捕獲分子選自：蛋白質、多核苷酸、碳水化合物和藥物。
[0027] 在一實施例中，所述第二捕獲分子選自：蛋白質、碳水化合物、脂質、多核苷酸、藥 物、標簽劑、合成聚合物和納米粒子。所述蛋白質可以為抗體或其片段。
[0028] 在一實施例中，所述顆粒為納米粒子。
[0029] 本發明也涉及連接第一靶分子至第二靶分子的方法，所述方法包括：
[0030] -提供過渡金屬離子；
[0031] -提供顆粒，其中所述顆粒具有表面，并且由一種或多種形成該顆粒的基材分子或 原子形成；
[0032] -提供預設比例的第一靶分子和第二靶分子；
[0033] -將過渡金屬離子和顆粒與第一和第二靶分子接觸，使得過渡金屬離子與顆粒表 面的基材分子或顆粒原子，以及至少一個第一靶分子和至少一個第二靶分子形成配位鍵， 從而借助顆粒將第一和第二靶分子彼此連接。
[0034] 在一實施例中，所述第一捕獲分子選自：蛋白質、多核苷酸、碳水化合物和藥物。
[0035] 在一實施例中，所述第二捕獲分子選自：蛋白質、碳水化合物、脂質、多核苷酸、藥 物、標簽劑、合成聚合物和納米粒子。所述蛋白質可以為抗體或其片段。
[0036] 在一實施例中，所述顆粒為納米粒子。
[0037] 附圖簡述
[0038]圖1.加入金屬復合物活化的500nm顆粒的懸浮液的抗體量與FACS Canto II儀器 的輸出信號(熒光單位，y軸)成正比。
[0039]圖2.向金屬復合物活化的200nm顆粒中滴定鏈霉親和素-加載生物素化小鼠 IgG/ GAM-HRP。也顯示了包覆鏈霉親和素的Ιμπι磁性顆粒(Merck和Dynal MyOne Cl)。
[0040]圖3.向金屬復合物活化的200nm顆粒中滴加鏈霉親和素和小鼠 IgG-加載生物素化 小鼠 IgG/GAM-HRP〇
[00411圖4.向金屬復合物活化的200nm顆粒中滴加鏈霉親和素和小鼠 IgG-加載生物素化 RPE0
[0042]圖5.向金屬復合物活化的200nm顆粒中滴加鏈霉親和素和小鼠 IgG-加載生物素化 小鼠 IgG并且由山羊抗小鼠 RPE檢測。
[0043]圖6.化學發光分析數據檢測特定濃度的與M270Dyna珠偶聯的阻斷和未阻斷生物 素化-山羊抗人的信號輸出。
[0044] 圖7.特異性信號與非特異性信號與噪聲比的比較。
[0045] 圖8.不同濃度的山羊抗小鼠 IgG和BSA對MyOne(Dynal，Ιμπι)顆粒共偶聯的信號輸 出。
[0046] 圖9.凝集實驗前的M270(3ym)、My0ne(lym)和Merck 200nm顆粒。左邊:室溫下保溫 1小時后的M270 (3μπι，較大顆粒）和MyOne (Ιμπι，較小顆粒）；右邊：室溫下保溫1小時后的 Merck 200nm顆粒。
[0047] 圖10.室溫下保溫1小時之后的M270、My0ne、Merckbead混合物的圖片。可清晰地發 現顆粒凝聚(大顆粒連接至小顆粒）。
[0048]圖11.鏈霉親和素和BSA共偶聯于金屬復合物活化的氧化鐵納米粒子上的特異性 連接和背景。
[0049] 圖12.不同濃度的小鼠 IgG偶聯于金屬復合物活化的氧化鐵納米粒子上的信號和 背景噪音。
[0050] 圖13.使用山羊-抗小鼠-偶聯RPE將鏈霉親和素和小鼠 IgG共偶聯于氧化鐵納米粒 子以便(檢測)熒光信號輸出。
[0051 ]圖14.使用生物素-偶聯RPE將鏈霉親和素和小鼠 IgG共偶聯于氧化鐵納米粒子的 以便(檢測)熒光信號輸出。
[0052]圖15.將抗體偶聯于金屬復合物活化的金納米粒子的試紙檢測。
[0053]圖16.采用在金屬復合物活化的磁性顆粒上檢測抗TNF-alpha抗體和辣根過氧化 物酶進行TNF-alpha夾心免疫測定。
[0054]圖17.量子點（QDot)偶聯于金屬復合物活化的磁性顆粒以便（檢測）熒光信號輸 出。
[0055]圖18.與或不與量子點(QDot)偶聯的金屬復合物活化的磁性顆粒的TEM圖像。
[0056] 發明詳述
[0057]總體上，本發明出乎意料地發現，使用金屬復合物活化的納米粒子和微粒子(有高 反應活性)可用于連接分子、聚合物和其他顆粒，以產生含有不同分子的多功能實體。重要 的是，這些分子在每個顆粒上的比例是可控的，以得到在整個顆粒群體中，其上連接有特定 比例的不同分子的顆粒的一致分布。
[0058] 連接生物分子至不同表面的一種方法是使用金屬復合物，例如用于固定化金屬親 和色譜層析（MAC)的那些，這是一種公知的方法，或者如PCT/AU2005/00966中描述的方法 (公開號為W0 2006/002472)。具體地說，該PCT申請中描述的金屬復合物允許強有力但溫和 的連接反應，從而最大程度降低在所有不同的表面上對生物分子(例如蛋白質）的損害。
[0059] 在此方面，所述金屬復合物活化顆粒可看作是一種可促進不同分子、聚合物或顆 粒通過顆粒或納米粒子彼此連接的交聯劑形式。本質上，所述金屬復合物活化納米粒子和 微粒子作為中間體，所述中間體控制形成多功能實體的不同分子的總數、密度和比例。假定 所述實體是nA-X-mB的形式，其中X為顆粒，且A和B為，例如不同的生物分子、聚合物或納米 粒子