一種提高水稻稻瘟病抗性的基因Os02g0532500、蛋白及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于作物遺傳技術領域，更具體地，本發明設及一種提高水稻稻攝病抗性 的基因0s02g0532500、蛋白及其應用。
【背景技術】
[0002] 由真菌Magnaporthe grisea巧eberOBarr引起的水稻稻攝病是世界各稻區危害 最嚴重的水稻病害之一，對全球稻作栽培產生毀滅性的影響。稻攝病在水稻生長各個時期 都可能發生，尤W葉攝和穗攝的危害最大。全球每年因稻攝病造成的產量損失達11~30%， 直接經濟損失約50億美元，損失的糧食足W養活6000萬人口。在我國，凡有水稻栽培的地方 都有稻攝病發生。南北稻區每年均受到不同程度危害，一般減產10~20%，重的達40~ 50%，局部田塊甚至顆粒無收。
[0003] 目前，利用品種的抗性，開展稻攝病抗性育種被認為是最經濟、有效和環境友好的 防治途徑。近年來，育種學家們利用常規育種技術培育出了許多水稻稻攝病抗病品種。但 是，大部分抗病品種推廣應用2~3年后即喪失其稻攝病抗性。如高抗稻攝病品種"窄葉青8 號"推廣種植不到Ξ年便喪失抗性，高產抗病優質品種"梗釉89"推廣不到四年，其抗病性也 明顯下降。由此可見，水稻品種稻攝病抗性周期短是水稻生產中一個普遍而突出的問題，延 長水稻品種稻攝病的持性壽命已成為我國乃至各水稻生產國水稻改良中需要優先解決的 問題。
[0004] 對稻攝病持久抗性品種Moroberekan、谷梅2號和Ξ黃占2號的抗病遺傳分析結果 表明，稻攝病持久抗性由質量抗性和數量抗性兩部分組成。由主效基因控制的稻攝病抗性 稱為質量抗性(完全抗性），其表現為水稻寄主與稻攝病菌的不親和性，具有小種專化性。在 W往的稻攝病抗性育種中往往只利用了個別的主效基因。運些品種大面積推廣應用時，一 旦遇到新的小種或病原菌毒性產生變異時就會喪失其抗病性。運是造成水稻品種稻攝病抗 性周期短的根本原因。與之相對應的是數量抗性(部分抗性），有多個微效基因組成。數量抗 性表現為寄主與病菌的親和性，抑制稻攝病菌繁殖，延緩發病進程，在形態上表現為葉片的 病斑數少、病斑小。由于數量抗性的小種專化性不強，或由于其微效多基因的性質不容易被 稻攝病菌克服，因此數量抗性被認為與水稻稻攝病持久抗性緊密相關，已成為研究的熱點 和前沿。
[0005] 隨著分子標記技術的發展和水稻抗病功能基因組的深入開展，國際上迄今已鑒定 和定位了 300多個稻攝病數量抗性QTL，但是，盡管已標記鑒定出眾多的稻攝病數量抗性 QTL，水稻稻攝病數量抗性分子育種很少有成功的報道。其主要原因一方面在于數量抗性的 微效多基因的性質，另一方面QTL作圖的不精確性。應用QTL作圖方法標記定位的QTL區間一 般在10~30cM。在運一區間有數W百計基因的存在。分子標記選擇時往往受到親本多態性 和重組的影響，使得稻攝病數量抗性分子育種很難有效進行。可見，鑒定稻攝病數量抗性的 功能基因，是水稻稻攝病數量抗性和持久抗性分子育種取得突破的關鍵。
【發明內容】
[0006] 基于此，為了克服上述現有技術的缺陷，本發明提供了一種提高水稻穗攝抗性的 基因0s02g0532500、蛋白及其應用。
[0007] 為了實現上述發明目的，本發明采取了如下具體的技術方案：
[000引一種提高水稻稻攝病抗性的基因0s02g0532500,所述基因具有如SEQ ID No:l所 示的核巧酸序列。
[0009] 本發明還提供了一種提高水稻稻攝病抗性的蛋白，所述蛋白具有如SEQ ID No:2 所示的氨基酸序列。
[0010] 在其中一些實施例中，所述提高水稻稻攝病抗性的蛋白由如SEQ ID No: 1所示的 核巧酸序列編碼。
[0011] 本發明還提供了提高水稻稻攝病抗性的基因0s02g0532500在提高水稻稻攝病抗 性方面的應用。
[0012] 由于控制稻攝病數量抗性的基因多，單個基因的效應小，很難應用圖位克隆的策 略克隆其功能基因。近年來，越來越多的研究表明，防衛基因化efense response，DR gene) 與數量抗病性密切相關。本發明申請人前期用防衛基因對水稻稻攝病數量抗性的研究結果 表明，防衛基因與稻攝病數量抗性密切相關，其中5個防衛基因與稻攝病數量抗性QTL共定 位，并進一步通過基因沉默技術驗證位于第8染色體的稻攝病數量抗性QTL區間內的防衛基 因草酸氧化酶類蛋白（GLP)基因家族具有稻攝病數量抗性功能。應用候選防衛基因進行稻 攝病數量抗性分析將是分離、鑒定水稻稻攝病功能基因一個很好的策略。
[0013] 草酸氧化酶類蛋白，又稱類胚素蛋白（germin-1化e protein，GLP)，在植物的生長 發育W及逆境脅迫中發揮著重要作用，是一種重要的防衛基因。草酸氧化酶屬于草酸降解 酶之一，廣泛存在于高等植物(水稻、小麥等）W及細菌、真菌和苔薛中，它的作用是氧化草 酸產生此化和C〇2,遏制病原菌的侵染，因此在植物的逆境脅迫及抗病防御中發揮著重要功 能。本發明申請人采用候選基因的方法篩選與水稻稻攝病葉攝數量抗性相關的基因時，發 現在水稻第8染色體的化P基因與葉攝數量抗性密切相關，對減少病葉面積的貢獻率達到 30.0 %。用基因沉默的方法沉默了整個第8染色體化P基因家族之后，水稻葉片對稻攝病菌 的感病性明顯增加。在進一步篩選與水稻葉攝抗性和穗攝抗性相關的基因時發現，另一位 于水稻2號染色體的一個化P基因0s02g0532500,在葉攝和穗攝接種后其表達量顯著上調。 因此該基因可能在水稻稻攝病抗性中發揮了重要作用。
[0014] 與現有技術相比，本發明具有W下有益效果：
[0015] 1.本發明首次證明了水稻化P基因0s02g0532500是水稻稻攝病抗性的功能基因， 該基因的克隆和生物學功能驗證對于水稻稻攝病抗性的分子機制研究有重要的參考意義；
[0016] 2.本發明提供了利用Camv35S啟動子過表達0s02g0532500基因的水稻轉化過表達 載體。該載體轉化水稻后能大幅提高0s02g0532500的表達量，伴隨著表達量的提高，轉化植 株的稻攝病抗性明顯增強，并且轉基因植株在生長狀態及農藝性狀上沒有明顯的改變。因 此，本發明通過化mv35S啟動子過表達0s02g0532500的技術可W應用于水稻的基因遺傳工 程育種，并能夠應用于生產實踐中，改良水稻的稻攝病抗性，從而保障目前水稻病害頻發的 氣候條件下的水稻生產安全。
【附圖說明】
[0017]圖巧實施例1中所使用的過表達載體P冊SN載體圖譜；
[0018] 圖2為實施例2的轉基因植株中0s02g0532500表達水平檢測圖；
[0019] 圖3為實施例3中過表達0s02g0532500對水稻植株的葉攝抗性的影響，其中**表示 與對照相比存在極顯著差異；
[0020] 圖4為實施例3中過表達0s02g0532500對水稻植株的穗攝抗性的影響，其中**表示 與對照相比存在極顯著差異。
【具體實施方式】
[0021] W下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。下列實施例中未 注明具體實驗條件和方法，所采用的技術手段通常為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0022] 實施例1提高水稻稻攝病抗性的基因及過表達載體的構建
[0023] (1)、取水稻稻攝病高抗品種Ξ黃占2號（SHZ-2)的幼苗葉片部位，用Tr i Zo 1 Reagent(Invitrogen公司，其貨號為：15596026)提取葉片總RNA，采用甲醒變性凝膠電泳和 紫外分光光度計檢測總RNA的純度及量；
[0024] (2)、取化g的總RNA做起始逆轉錄反應，所采用的逆轉錄酶為PrimeScript(TAKARA 公司），逆轉錄反應的步驟參考該逆轉錄酶的使用說明。W逆轉錄產物為模板，采用引物:F， CCGGAATTCAGTGACAGAACGAGCGTAGAAT(SEQ ID No:3);R， GGAAGATCTTCACTAACGGGGAGTAACCTAA(SEQ ID No:4)，進行PCR擴增，PCR所用的聚合酶為KOD FX(Toyok)公司）。反應體系為50化，按照KOD FX的說明書配制PCR反應體系。反應條件為:9