一種稻瘟病菌分生孢子的培養制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種稻瘟病菌分生孢子的培養制備方法，該方法利用多起點培養技術，以及氣生菌絲產孢技術，快速培養制備稻瘟病菌分生孢子。該方法實施步驟如下：1)產孢培養基的制備；2)多起點移植菌體的配備；3)將多起點移植菌體植入培養平板；4)孢子制備培養；5)孢子的洗脫分離。本發明的特色與優點是：1)快速高效，通常培養5天后新一代孢子能達到高產孢量的理想狀態；2)制備培養全程能保持無菌操作，成品孢子液的污染機率大幅降低；3)操作技術簡單，結果產孢量大。
【專利說明】
一種稻瘟病菌分生孢子的培養制備方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及植物病理學技術和微生物學技術。具體是一種稻痕病菌分生孢子的培養制備方法。
【背景技術】
[0002]植物病原真菌的繁殖體除了具有繁殖擴大自身種群數量的基本作用外，更重要的是擁有與寄主互作識別，并發動侵染寄主的功能，因此在大多數植物病害的研究過程中，都需要使用病原菌的繁殖體作試驗材料，顯而易見，高效便捷的繁殖體材料的培養制備方法，將非常有利于研究工作的高效開展。稻瘟病是我國水稻生產的一種重大病害，該病害的病原菌(Magnaporthe grisea)的繁殖體包括有性態的子囊孢子、和無性態的分生孢子二種類型。目前在實驗室內制備有性孢子存在較大的技術難度，因此，至今的有關研究所用的繁殖體主要是使用該病菌的分生孢子。
[0003]稻痕病菌分生孢子的培養制備方法可歸結為二大類。
[0004]—類是采用植物籽粒作培養基的培養法，即先將植物籽粒(如大麥粒等)浸潤并滅菌制成培養基，然后將菌絲體移植入籽粒培養基內培養，當菌絲長滿籽粒后，用水洗刷掉籽粒表面菌絲，并轉放到方盤類器具內再進行光照培養，整個過程一般需要18天以上。該方法通常能制備大量的分生孢子，不過，培養制備全程時間較長，成品孢子液難以避免雜菌污染，而且存在較多的培養基雜質。
[0005]另一類是采用凝固劑瓊脂制成培養基的平板培養法，即先將有關養分(如燕麥汁)與瓊脂制成固體培養基并倒成平板，然后將少許菌絲體塊移植入培養基平板中間培養，當平板上長滿菌絲后，用工具刮除平板表面氣生菌絲，并轉到光照條件下再培養，整個過程一般需要10?13天以上。該方法能克服前述方法的一些不足，如獲得的成品孢子液雜質少，且容易避免雜菌污染。但該方法耗費時間仍有過長之嫌;且長時間的平板培養仍然存在較高的雜菌污染機率;在培養中途需要刮去氣生菌絲的技術操作，以及需要提供光照等技術支持，實踐應用仍然不方便。因而技術上仍有改進提高的空間。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種稻瘟病菌分生孢子的培養制備方法。
[0007]本發明解決上述技術問題的技術方案如下:
[0008]—種稻瘟病菌分生孢子的培養制備方法，主要是應用多起點培養技術，以及氣生菌絲產孢技術，快速培養制備稻瘟病菌分生孢子，培養制備方法的步驟如下:
[0009]1.產孢培養基的制備:按常規方法制備產孢培養基，該培養基的組成為:燕麥167g，瓊脂20g，水1000ml;常規高溫滅菌，倒入9cm培養皿制成培養平板。
[0010]2.多起點移植菌體的配備:在無菌條件下，用無菌水洗滌常規備存的稻瘟病菌菌落，得到孢子-菌絲碎混合液，用該混合液作為制備新一代分生孢子的多起點移植菌體。
[0011 ] 3.將多起點移植菌體植入培養平板:用微量移液器將步驟2配備的多起點移植菌體移植入步驟I制備的培養平板，并使菌體液在平板面上分散均勻。
[0012]4.孢子制備培養:將步驟3操作完備后的制備培養平板轉入溫度為28°C、相對濕度為90 %的恒溫培養箱內暗培養。
[0013]5.孢子的洗脫分離:通常步驟4培養5天后，新一代分生孢子達到高產孢量的狀態；用無菌水將平板上孢子洗脫，并集中到滅菌容器內，即獲得較純凈的稻瘟病菌分生孢子液。
[0014]本發明的特色與優點是:
[0015]I)快速高效，通常培養5天后新一代孢子能達到高產孢量的理想狀態。
[0016]2)制備培養全程能保持無菌操作，成品孢子液的污染機率大幅降低。
[0017]3)操作技術簡單，結果產孢量大。
【附圖說明】
[0018]圖1是本發明將多起點移植菌體植入培養平板并培養2天后的稻瘟病菌菌落。
[0019]圖2是本發明將多起點移植菌體植入培養平板并培養5天后的稻瘟病菌菌落。
【具體實施方式】
[0020]下面結合附圖與實施例對本發明作進一步描述。
[0021]本發明所述的產孢培養基是應用燕麥作主要成分的培養基，其組分為:燕麥167g，瓊脂20g，水1000ml;組分燕麥為水煮開180分鐘后取汁用;培養基經過常規高壓高溫滅菌后備用。
[0022]本發明所述的多起點移植菌體是指洗滌常規備存的平板菌落所獲得的分生孢子與菌絲碎的混合液，該混合液中孢子占大多數，將該混合液移植到培養平板并均勻分散于平板面上，每一個孢子或菌絲片段都可以萌發生長，因而可以在培養平板上形成大量的生長起點，因此，本發明將這種移植方式的菌體液稱為多起點移植菌體。大量的生長起點同時生長，就能在培養平板上快速形成均勻的菌落。
[0023]相對而言，常規的移植菌體為一菌絲塊，盡管該菌絲塊可能含有較多的菌絲片段，但在培養平板面上，病菌是以該菌絲塊為中心向四周空白培養基輻射生長，實際相當于只有單一個生長起點。
[0024]多起點移植菌體液內的孢子和菌絲量一般無需準確定量，取一個9cm培養皿的正常菌落加水1ml洗滌獲得的菌體液，取其20?50μ1作移植菌體，能滿足正常制備培養新一代孢子用的菌體量要求。
[0025]發明人觀察發現，在產孢培養過程中，新一代分生孢子形成于菌落表面的氣生菌絲上，刮除菌落表面菌絲的技術操作并不能增加產孢量，反而降低產孢量；同樣進行光照處理也不能增加產孢量，反而降低產孢量，因而在技術操作上，本發明無需按常規實施刮除菌落表面菌絲，也無需增加光照條件。
[0026]產孢培養環境的相對濕度應維持在90%左右，過低的濕度不利于菌落產孢，也容易導致培養基干燥，實際工作中若利用沒有控濕條件的培養箱，可在箱內放置干凈的濕毛巾增加濕度；但不宜將濕度提高至近于飽和濕度，因為發明人發現，在近于飽和濕度條件下，該培養技術的產孢效能反而下降。
[0027]通常產孢制備培養2天后可見明顯的菌落并形成氣生菌絲，如圖1所示，培養3天后就能產生新一代孢子，培養5天后菌落表面已形成密集的氣生菌絲，并且新一代孢子達到高產孢量的理想狀態，如圖2所示;另外，此高產孢量狀態能維持至培養11天后。
[0028]在制備培養結果的新一代孢子洗脫操作中，若用毛刷類工具刷洗會產生大量的菌絲片段混雜于孢子液中，而用光滑玻棒刷洗獲得的孢子液，其中混雜的菌絲片段較少。
[0029]實施例1
[0030]應用本發明一種稻瘟病菌孢子的培養制備方法，培養制備稻瘟病菌菌株Mg2013_l的分生孢子，按如下步驟實施操作:
[0031]1.產孢培養基的制備
[0032]按常規方法制備產孢培養基，該培養基的組成為:燕麥167g，瓊脂20g，水1000ml;常規高溫滅菌，倒入9cm培養皿制成培養平板。
[0033]2.多起點移植菌體的配備
[0034]在無菌條件下，用1ml無菌水洗滌常規備存的稻瘟病菌菌株Mg2013-1的菌落一皿，得到孢子-菌絲碎混合液，用該混合液作為制備新一代分生孢子的多起點移植菌體。
[0035]3.將多起點移植菌體植入培養平板
[0036]用微量移液器取步驟2配備的多起點移植菌體40μ1移植入步驟I制備的培養平板，用T形玻棒在平板面上輕輕涂抹，使菌體液在平板面上分散均勻。
[0037]4.孢子制備培養:將步驟3操作完備后的制備培養平板轉入溫度為28°C、相對濕度為90 %的恒溫培養箱內暗培養。
[0038]5.孢子的洗脫分離:步驟4培養5天后，新一代分生孢子達到高產孢量的狀態;取無菌水15ml將一皿培養平板的新一代孢子洗脫，所獲得的分生孢子液，孢子濃度可達1.48X16 個/ml。
[0039]實施例2
[0040]應用本發明一種稻瘟病菌孢子的培養制備方法，培養制備稻瘟病菌菌株Mg2015_7的分生孢子，按實施例1的步驟I至步驟5操作實施，只是步驟2的菌株是Mg2015-7;結果用無菌水15ml洗脫一皿培養平板所獲得的新一代分生孢子液，孢子濃度可達1.20 X 16個/ml。[0041 ] 實施例3
[0042]應用本發明一種稻瘟病菌孢子的培養制備方法，培養制備稻瘟病菌菌株Mg2015_
14的分生孢子，按實施例1的步驟I至步驟5操作實施，只是步驟2的菌株是Mg2015-14;結果用無菌水15ml洗脫一皿培養平板所所獲得的新一代分生孢子液，孢子濃度可達1.38 X 16個/ml。
【主權項】
1.一種稻痕病菌分生孢子的培養制備方法，其特征在于，利用多起點培養技術，以及氣生菌絲產孢技術，快速培養制備稻瘟病菌分生孢子;方法的步驟如下: .1)產孢培養基的制備:按常規方法制備產孢培養基，該培養基的組成為:燕麥167g，瓊月旨20g，水100ml;常規高溫滅菌，倒入9cm培養皿制成培養平板； .2)多起點移植菌體的配備:在無菌條件下，用無菌水洗滌常規備存的稻瘟病菌菌落，得到孢子-菌絲碎混合液，用該混合液作為制備新一代分生孢子的多起點移植菌體；. 3)將多起點移植菌體植入培養平板:用微量移液器將步驟2)配備的多起點移植菌體移植入步驟I)制備的培養平板，并使菌體液在平板面上分散均勻；. 4)孢子制備培養:將步驟3)操作完備后的制備培養平板轉入溫度為28°C、相對濕度為90 %的恒溫培養箱內暗培養；. 5)孢子的洗脫分離:通常步驟4)培養5天后，新一代分生孢子達到高產孢量的狀態；用無菌水將平板上孢子洗脫，并集中到滅菌容器內，即獲得較純凈的稻瘟病菌分生孢子液。
【文檔編號】C12N3/00GK105861412SQ201610345467
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月24日
【發明人】張君成, 王忠文, 曾東強, 李界秋, 熊英, 時婷婷
【申請人】廣西大學