一種適用于根部接種的稻瘟病菌菌株y4及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物保護技術領域，具體涉及一種適用于根部接種的稻瘟病菌菌株Υ4 及應用。
【背景技術】
[0002] 稻瘟病是一種在水稻上發生的世界性真菌病害，嚴重影響水稻生產和糧食安全。 據報道，全球每年因稻瘟病造成的水稻產量損失約占總產量的10~15%，經濟損失達數十 億美元；在我國，稻瘟病每年都有不同程度發生，特別是近幾年，在西南、長江中游和東北等 稻作區持續大發生，年發病面積達330~570萬公頃，損失稻谷數億公斤，給我國水稻安全 生產帶來了巨大隱患（劉占領等，2007;鄭釗等，2009)。目前在大多數情況，仍然依靠傳統 的化學藥劑和種植抗病品種來控制該病害，但效果并不是很理想。加之人們對食品安全的 日益重視及環保意識的逐漸加強，化學藥劑的使用已不再是現代農業生產上首推的防治措 施；受病原菌小種遺傳的復雜性、致病多樣性及極易變異性三方面因素影響，導致新的抗病 品種常常推廣數年后便失去抗性（Skamni〇ti&Gurr，2009)。因此，發展稻瘟病持續、環境友 好的防治措施需要對稻瘟病的病害侵染、發生和成災過程有一個更加深入系統的了解。
[0003] 稻痕病菌（Magnaportheoryzae)作為一種傳統的"氣傳"病原真菌，被劃歸于巨 座殼科（Magnaporthaceae)，而巨座殼科真菌除稻痕菌外還包括典型的土傳病原真菌，如小 麥全蝕病菌Gaeumannomycesgraminis、草坪夏季斑枯病菌M.poae和小麥根部侵染病原 M.rhizophila(Cannon，1994)。18S和28SrDNA等聚類分析結果表明，稻瘟病菌與以上土傳 病菌均可聚為一類，親緣關系較為接近（Cannon, 1994;Thongkanthaetal.，2009)。Sesma 和Osbourn(2004)報道稻瘟病菌可在菌絲上形成簡單的膨大附著枝侵入水稻根部，2~4周 后在根、莖、葉、穗部位可觀察到典型的稻瘟病斑，雖然癥狀出現時間與分生孢子侵入地上 組織相比較慢，但這已說明M.oryzae可通過根部系統侵染水稻引起全株發病。因此稻瘟菌 除經氣傳侵染外，在田間還可能由水稻根部侵染，在植株地上部分引起典型的稻瘟病癥狀。 由此，推測稻瘟病可能在田間也兼顧土傳病害的侵染、流行特點。盡管如此，在已有研究中， 研究者在室內對稻瘟病菌根部接種發病率很低，平均發病率僅10%左右，這極大的限制了 關于稻瘟病菌對水稻根部侵染機制的深入研究。鑒于此，有必要弄清不同條件對稻瘟病根 部侵染發病的影響，建立稻痕病菌根部接種體系，打破制約稻痕病致病機制深入研究的技 術瓶頸。
[0004] 因此在室內完善稻瘟病的人工接種條件，建立起一套穩定高效的稻瘟病根部接種 技術體系，已成為現今研究的一項重要任務。而植物病原真菌侵染寄主的關鍵在于其本身 的致病力以及侵染的環境條件，所以本發明以一株強致病力的稻瘟菌株作為出發菌株，構 建穩定地稻瘟菌綠色熒光標記菌株作為研究對象；圍繞這個菌株研究并建立了一套高效穩 定的稻瘟菌根部接種體系。
【發明內容】
[0005] 本發明目的在于克服現有技術的缺陷，提供了一種適用于根部接種的稻瘟病菌菌 株Y4,該菌株已于2015年10月8號送至中國典型培養物保藏中心保藏，分類命名：稻瘟菌 (Magnaportheoryzae)Y4,保藏編號：CCTCCN0:M2015592,地址：中國武漢武漢大學。
[0006] 本發明的另一個目的在于提供了一種適用于根部接種的稻瘟病菌菌株Y4的應 用，利用該病菌選擇合適的環境參數對水稻進行侵染，解決了目前稻瘟病根部接種發病率 不穩定這一難題。
[0007] 為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：
[0008] -種適用于根部接種的稻瘟病菌菌株Y4的獲得：
[0009] 將稻瘟菌野生型菌株和含有質粒pCAMsgfp農桿菌的頂培養液混合培養，挑取單 菌落于含潮霉素50μg/ml的PDA平板上，28 °C下培養5d(重復3次），對轉化子進行生理生 化特性的鑒定，最終獲得了一株高效穩定的稻瘟病菌Y4,在普通光學顯微鏡和熒光顯微鏡 下觀測分生孢子形態，分生孢子發綠色熒光，洋梨形或倒棍棒形，頂端鈍尖，基部鈍圓，有腳 胞，與野生型菌株相比，在孢子形態上沒有差異，呈典型稻瘟病菌分生孢子特征。每平方厘 米的產孢量可達到9. 43X105個/ml，孢子萌發率為98 %。
[0010] 該菌株已于2015年10月8號送至中國典型培養物保藏中心保藏，分類命名：稻瘟 菌（Magnaportheoryzae)Y4,保藏編號：CCTCCNO:M2015592,地址：中國武漢武漢大學。一 種適用于根部接種的稻瘟病菌菌株Y4的應用，包括利用該菌株侵染水稻，具體包括以下步 驟：
[0011] 采用菌絲塊根部接種法，水稻種子置于〇. 7%的水瓊脂培養基上，黑暗28°C保濕 催芽生長，直至幼根生長至5-6cm，將幼根生長健壯的幼苗移至裝有35ml蛭石的玻璃管中， 4個菌塊放在幼根上，其上用15ml的蛭石覆蓋，再加水至蛭石水勢為-2Kp，接種后的水稻植 株放置在32°C、16h光照/8h黑暗條件的培養箱中生長。
[0012] 與現有技術相比，本發明具備以下優點：
[0013] 1.通過農桿菌介導（ATMT)遺傳轉化方法，獲得攜帶GFP標記的抗潮霉素轉化子。 對轉化子進行致病力、熒光強度以及熒光穩定性的篩選，得到一株致病力強、熒光信號強且 穩定的熒光標記菌株。由于轉化子可發綠色熒光，便于跟蹤稻瘟菌的侵染過程。
[0014] 2.提供了一種適用于稻痕病菌（Magnaportheoryzae)Y4的穩定高效的稻痕菌根 部侵染方法，為進一步研究稻瘟菌根部侵染機制提供條件，在理論上可在病害循環、發病因 素方面深入認識稻瘟病，在實踐應用上，可為稻瘟病防控措施的正確實施提供指導。
【附圖說明】
[0015] 圖1為培養7天的稻瘟病菌菌株Y4菌落形態示意圖；
[0016] 其中圖1中a為菌落形態反面，圖1中b為菌落形態正面。
[0017] 圖2為培養7天的稻瘟菌菌株Y4分生孢子；
[0018] 其中圖2中a為明場下觀察形態，圖2中b為熒光下觀察形態。
[0019] 圖3為菌絲塊接種根部方法示意圖。
[0020] 圖4為稻痕病菌根部侵染發病不意圖；
[0021] 其中圖4中a為發病植株整體形態，b為葉部發病部位在明場、熒光條件下觀察侵 染情況，c為莖部發病部位在明場、熒光條件下觀察侵染情況，d為根部發病部位在明場、熒 光條件下觀察侵染情況。
【具體實施方式】
[0022] 本發明所述技術方案，如未特別說明，均為本領域的常規方案，所用試劑或材料， 如未特別說明均為公眾可獲得的。
[0023] 實施例1:
[0024] 稻痕病菌（Magnaportheoryzae)Y4的獲得及鑒定：
[0025] 將稻瘟菌野生型菌株和含有質粒pCAMsgfp農桿菌的頂培養液混合培養，挑取單 菌落于含潮霉素50μg/ml的PDA平板上，28 °C下培養5d(重復3次），共篩選出243個轉化 子，對轉化子進行生理生化特性的鑒定，最終獲得了一株高效穩定的稻瘟病菌Y4。將稻瘟 病菌Y4菌絲塊，置于PDA平板上，28°C光照條件下培養7天，觀察其菌落形態，菌落從中間 到邊緣依次是褐色、淡褐色、黑褐色、白色，氣生菌絲不發達，呈典型稻瘟病菌菌落特征（圖 1)。在普通光學顯微鏡和熒光顯微鏡下觀測分生孢子形態，分生孢子發綠色熒光，洋梨形或 倒棍棒形，頂端鈍尖，基部鈍圓，有腳胞，與野生型菌株相比，在孢子形態上沒有差異，呈典 型稻瘟病菌分生孢子特征（圖2)。每平方厘米的產孢量可達到9. 43X105個/ml，孢子萌 發率為98%。
[0026] 該菌株已于2015年10月8號送至中國典型培養物保藏中心保藏，分類命名：稻瘟 菌（Magnaportheoryzae)Y4,保藏編號：CCTCCNO:M2015592,地址：中國武漢武漢大學。
[0027] 稻瘟病菌GFP熒光菌株Y4分子鑒定：采用CTAB法