一株降解黃曲霉毒素b1的枝頂孢屬菌株及其應用
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于微生物領域，涉及一株降解黃曲霉毒素 B1的枝頂孢屬菌株及其應用。
【背景技術】
[0002] 全世界每年約有25%的谷物受真菌及真菌毒素污染而不能食用。黃曲霉毒素 (aflatoxin，AFT)是由Aspergillus flavuns、A.nomius、A.parasiticus等多種真菌產生的 次級代謝產物，其中黃曲霉毒素 B1分布范圍最廣且化學性質最穩定，具有很強的致癌性、致 突變性和致畸性，是國際認可的A類致癌物。因此掌握黃曲霉毒素的防治措施，對保障糧油 食品質量安全和確保動物性食品安全尤為重要。
[0003] 自從1960年發現黃曲霉毒素以來，科學工作者便不斷地研究該類毒素的預防和去 毒方法。生物降解黃曲霉毒素是一種行之有效的防毒控毒方法，目前報道可以降解黃曲霉 毒素 B1的細菌較多，主要有紅串紅球菌（Rhodococcus erythropolis)，分支桿菌 (Mycobacterium fluorantheni voranssp)，嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas rnaltophilia)，巨大芽抱桿菌（Bacillus megaterium)，發酵乳酸桿菌（Lactobacillus fermentum)，施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri)，惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)，枯草芽抱桿菌（Baci 1 lus subti 1 is)，腸球菌(Enterococcus)，澄紅色粘球菌 (Myxococcus fulvus)等。而可以降解黃曲霉毒素 B1的真菌相對較少，主要有樹狀指孢霉 (Dactylium dendroide)，少根根霉（Rhizopus arrhizus)，寄生曲霉（Aspergillus parasiticus)，從莖點霉(Phoma sp.)，白腐菌(Trametes versicolor)等。同時大多數的微 生物降解黃曲霉毒素需要較長的處理時間，有的甚至長達168小時。對于乳酸菌，雙歧桿菌 和酵母菌的研究表明，大部分去除毒素的效率在50%以下，而且它們的去除機制是可逆的 結合，而不是對毒素的降解。所以高效的降解黃曲霉毒素的微生物菌種具有非常重要的意 義。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一株降解黃曲霉毒素 B1的枝頂 孢屬菌株及其應用，該菌具有快速高效降解黃曲霉毒素 B1的能力，具有實際應用的前景。
[0005] 本發明實現目的的技術方案如下：
[0006] -株降解黃曲霉毒素 B1的枝頂孢屬菌，保藏編號為:CGMCC No. 11804,分類命名 為:枝頂孢Acremonium sp.，保藏日期：2015年12月03日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
[0007] 降解黃曲霉毒素 B1的枝頂孢屬菌作為飼料防霉劑的應用。
[0008] 降解黃曲霉毒素 B1的枝頂孢屬菌作為生物降解菌劑或生物降解無菌制劑的應用。
[0009] 本發明的優點和積極效果是：
[00?0] 本發明公開一株枝頂孢屬菌（Acremonium sp · )WCQ6A，其菌種保藏號為CGMCC No. 11804,其發酵液液與黃曲霉毒素 B1反應5分鐘后對黃曲霉毒素 B1降解率可以達到74%。
[0011] 本發明的枝頂孢屬菌具有高效快速降解黃曲霉毒素的能力，在生物降解飼料等中 黃曲霉毒素方面具有很好的應用前景。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本發明枝頂孢屬WCQ6A的菌落形態;其中圖la為菌落正面，圖lb為菌落反面； [0013]圖2為本發明高效液相色譜法檢測枝頂孢屬WCQ6A對黃曲霉毒素 B1的降解能力a發 酵液處理24h b未經發酵液處理的對照組；
[0014] 圖3為本發明不同處理時間對枝頂孢屬WCQ6A發酵液降解黃曲霉毒素 B1能力的影 響；
[0015] 圖4為本發明不同pH值對枝頂孢屬WCQ6A發酵液降解黃曲霉毒素 B1能力的影響。
【具體實施方式】
[0016] 下面通過具體的實施方案敘述本發明方法。除非特別說明，本發明中所用的技術 手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發 明的范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背 離本發明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改 動也屬于本發明的保護范圍。
[0017] 本發明提供的枝頂孢屬WCQ6A菌株可高效降解黃曲霉毒素 Bl，5分鐘就可降解74% 的黃曲霉毒素 B1，該菌作為黃曲霉毒素降解的生物材料，無論在開發新的生物降解菌劑還 是生物降解無菌制劑方面都具有很好的應用前景。
[0018] 降解黃曲霉毒素 B1的枝頂孢屬WCQ6A菌株的篩選方法，其包括內容:從腐敗的堿性 土壤樣本中篩選能夠降解香豆素的菌株;二次篩選能夠降解黃曲霉毒素 B1的菌株，采用初 篩培養基(M9+0.1 %的香豆素)分離的多株能夠在香豆素為唯一碳源和能源的平板上生長 的菌株，再用這些菌株分別接種復篩培養基(NB培養基+終濃度為100ug/L的黃曲霉毒素 B1)，選擇到1株降解黃曲霉毒素 B1的菌株，通過形態學，以及ITS核酸序列分析，確定該菌株 屬于枝頂孢屬菌，其保藏編號為:CGMCC No. 11804。其ITS核酸序列為：
[0020] 實施例1
[0021] 菌株的篩選分離
[0022] 1、樣品米集
[0023] 2013年9月，在超凈工作臺中，將采集的堿性土壤樣品放在無菌生理鹽水中震蕩 15min制備成菌懸液，按2 %的接菌量將菌懸液接種到肉湯培養基中，30°C220rpm富集培養 4h。取一定量的發酵液離心，收集菌體，按5%的接菌量轉接到50ml初篩的培養基里，30°C 220rpm培養7天，按5 %的接菌量取培養液2.5ml離心，收集菌體，再次轉接到初篩培養基中， 一共轉接3次。
[0024] 2、菌株的分離
[0025]取300ul有生長跡象的菌懸液涂布初篩固體培養基平板上，30°C條件下培養7d，用 接種環挑取平板上形態、大小、顏色、透明度不同的菌株在初篩固體培養基平板劃線純化3 代，挑選三代都能穩定生長的菌株的單克隆，再次接種到50ml初篩培養基里，轉接3次，選取 有明顯生長跡象的菌株 [0026] 3、枝頂孢屬WCQ6A的形態特征
[0027] 枝頂孢屬WCQ6A菌株在NA培養基上30°C培養7d后，菌落圓形，直徑24-29mm，白色， 邊緣絨狀，背面奶油色至橘黃色。菌落質地絮狀，邊緣整齊，無特殊氣味，命名為WCQ6A，見圖 1〇
[0028] 4、培養基及培養條件
[0029] (1)、初篩培養基KH2P〇4,0.25g;MgS〇4 · 7H20,0.25g;(NH4)2S〇4,0.5g;CaCl2 · 2H20， 0.005g; FeCl3 · H20，0.003g，固體培養基加瓊脂20g，水1升，調pH到7.0。分裝到錐形瓶，加塞 包扎后121°C滅菌20min，稍冷卻后加0.1 % (W/V)香豆素。30°C，220rpm培養7d。
[0030] (2)、肉湯培養基蛋白胨10g;牛肉膏3g; NaCl 5g;加水至1L，分裝到錐形瓶，加塞包 扎后121°C滅菌20分鐘。30°C，220rpm培養4h。
[0031] (3)、NB培養基酵母提取物3g，蛋白胨5g，葡萄糖6g，NaCl 10g，加水至1L，分裝到錐 形瓶，加塞包扎后115°C滅菌20min。按1 %的接種量接種在5mlNB培養基的試管里，30°C 220rpm培養24h，按5 %的接種量接種到100ml培養基中，培養48h。
[0032] (4)、NA培養基為NB培養基加20g瓊脂，用接種環劃線，30°C培養。
[0033] 實施例2
[0034 ]枝頂孢屬WCQ6A菌株對黃曲霉毒素 B1的降解能力分析
[0035] 1、試驗方法
[0036] (1)黃曲霉毒素 B1的配制
[0037]將lmg黃曲霉毒素 B1溶解在10ml色譜純甲醇中獲得濃度為0.1mg/ml的黃曲霉毒素 B1儲存液，再取lml儲存液用99ml超純水稀釋成1000ug/L的黃曲霉毒素 B1使用液。使用終濃 度為 100ug/L。
[0038] (2)菌種培養
[0039] 將初篩得到的WCQ6A菌種按1 %的接種量接種在5m 1NB培養基的試管里，30°C 220rpm培養24h，按5 %的接種量接種到lOOmlNB培養基中，培養48h。
[0040] (3)枝頂孢屬WCQ6A菌株對黃曲霉毒素 B1降解能力的檢測
[00411 取4.5ml發酵液加入50ml棕色青霉素小瓶中，加500ul濃度為1000ug/L的黃曲霉毒 素 B1 (終濃度為100ug/L)，30°C220rpm，分別處理1，2,5，10,20,40和6011^11，_培養基作對 照。
[0042] 處理液lOOOOrpm離心5min，取一定體積的上清用超純水稀釋3倍，然后用定性濾紙 過濾，使用免疫親和柱對實驗組和對照組樣品中的黃曲霉毒素 B1進行凈化提取(方法參照 免疫親和柱的使用說明書），提取液在60°C烘箱中烘干。
[0043]將烘干的樣品衍生化，先加入200ul的正己烷，再加50ul三氟乙酸，激烈震蕩30s， 40°C衍生5min，加入1.95ml乙腈和水混合物（乙腈：水=1:9)，激烈震蕩30s，靜止分層 lOmin，取下層溶液，lOOOOrpm離心5min，然后過0.22um的膜，高效液相色譜檢測黃曲霉毒素 B1的含量。
[0044]高效液相色譜檢測條件為：流動相水：甲醇：乙腈= 70: 17:17的混合物；流速 0 · 6ml/min;色譜柱C18(250mm X 4 · 6mm，0 · 5μηι);激發波長350nm，檢測波長450nm;柱溫：30 °C;進樣量25μ1。
[0045]黃曲霉毒素 Β1降解率（％) =(對照組黃曲霉毒素 Β1含量一實驗組黃曲霉毒素 Β1含 量)/對照組黃曲霉毒素 Β1含量Χ100。
[0046] 2、試驗結果
[0047]實驗結果表明，枝頂孢屬WCQ6A的發酵液在5min時對黃曲霉毒素 Β1的降解率為 74.42%(圖2)，6〇11^11時的降解率為75.68%，2411的降解率為78.46%(如圖3)。
[0048] 實施例3
[0049]不同pH值對枝頂孢屬WCQ6A發酵液降解黃曲霉毒素 B1能力的影響 [0050] 1、試驗方法
[0051 ] 用2M的HC1將發酵液上清的pH值調到4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,把NB培養基調到相應 的pH值作為對照，加入黃曲霉毒素 B1，30°C下反應20min，檢測對黃曲霉毒素 B1的降解率。 [0052] 2、試驗結果
[0053]在pH為4.0時發酵液上清對黃曲霉毒素 B1無降解能力，隨著pH值升高，降解率也逐 漸升高，在pH值為8.0時，降解率達到最高，為71 % (圖4)。
【主權項】
1. 一株降解黃曲霉毒素 B1的枝頂孢屬菌，其特征在于:保藏編號為:CGMCC No. 11804， 分類命名為:枝頂孢Acremonium sp.，保藏日期：2015年12月03日，保藏單位：中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號。2. 權利要求1所述的降解黃曲霉毒素 B1的枝頂孢屬菌作為飼料防霉劑的應用。3. 權利要求1所述的降解黃曲霉毒素 B1的枝頂孢屬菌作為生物降解菌劑或生物降解無 菌制劑的應用。
【專利摘要】本發明涉及一株降解黃曲霉毒素B1的枝頂孢屬菌及其應用，保藏編號為：CGMCC？No.11804，分類命名為：枝頂孢Acremonium？sp.，保藏日期：2015年12月03日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。其發酵液液與黃曲霉毒素B1反應5分鐘后對黃曲霉毒素B1降解率可以達到74％。本發明的枝頂孢屬菌具有高效快速降解黃曲霉毒素的能力，在生物降解飼料等中黃曲霉毒素方面具有很好的應用前景。CGMCCNo. 1180420151203
【IPC分類】C12R1/645, C12N1/14, A23K20/00
【公開號】CN105524844
【申請號】CN201610012424
【發明人】張同存, 李中媛, 王翠瓊, 羅學剛, 馬文建, 宋亞囝, 王楠, 何紅鵬, 周浩
【申請人】天津科技大學
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2016年1月7日