專利名稱：一種高產蛇孢假殼素類化合物菌株焦曲霉tkyx429及其應用的制作方法
—種高產蛇孢假殼素類化合物菌株焦曲霉TKYX429及其應用
技術領域
本發明屬于生物工程領域,具體涉及一種高產蛇孢假殼素類(ophiobolins)化合物菌株焦曲霉TKYX429及其應用。
背景技術：
目前發現的蛇孢假殼素類二倍半萜烯化合物有30余種，其基本骨架為C5- CS -C5駢環，顯示了廣譜的抗菌、抗腫瘤活性。
Ophiobolin A (蛇孢假殼素A)具有植物細胞毒性，能以非常低的量抑制水稻胚芽鞘和根的生長；對惡性痕原蟲有輕微抑制；具有抑制kaki >Glomerella Iagenarium、Corticium vagam、Macrospori um batati cola'Bacillus agr1、Trichomonasvaginalis > Trichophyton in terdigi tale^ Trichophyton purpureum、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、白蘚菌、毛滴蟲菌等微生物的生長發育以及殺線蟲的作用；能抑制大鼠的脂肪細胞攝取葡萄糖，對癌細胞系A-549和Mel-20的IC5tl為125nM，P-355為62.5nM，還可抑制鈣調素依賴性的環核苷酸磷酸二酯酶并導致小鼠白血病細胞L1210細胞的凋亡。
Ophiobolin K (蛇孢假殼素 K)也有強殺線蟲{Caenorhabditis elegans)活性，對其EC5tl為26mM ;同時，Ophiobolin K與Ophiobolin G (蛇孢假殼素G)—樣對人結腸癌細胞株Hct-15/Hct-116、人乳腺癌細胞株MDA-MB-231/MCF-7、人肺癌細胞株A549、人白血病細胞K562均有抑制作用并呈較好的量效關系。Ophiobolin K與6-印1-ophiobolin G(6位異構蛇孢假殼素G) —樣具有抑制細胞生物膜生成的功能，對癌細胞系P388/ADR的抑制率高于阿霉素，其衍生物Ophiobolin O (蛇孢假殼素O)對癌細胞系A-549和Mel_20的IC50為125nM，對P-335細胞系的IC5tl為62.5nM，在體外顯著抑制多種腫瘤細胞生長，對乳腺癌MCF-7作用最強，在低劑量能增加耐藥MCF-7細胞(MCF-7/ADR)對阿霉素的敏感性，增敏倍數達到10.5倍。并且Ophiobolin K在裸鼠體內能增加阿霉素對多藥耐藥乳腺癌的敏感性。
真菌在固態發酵條件下，模擬微生物的自然生長狀態，能大量合成很多液體發酵難合成的次級代謝產 物。J.Ruiz-Sanchez等人發現,二職類化合物紫杉醇在固體發酵中的產量比液體發酵產量要高(J.Ruiz-Sanchez, Z.R.Flores-Bustamante, L.Dendooven.A comparative study of Taxol production in liquid and solid-state fermentationwith Nigrospora sp.Afungusisolated from Taxus globosa.Journal of AppliedMicrobiology, 2010，2144-2150)，Takuya Itoh 等人發現 ophiobolins 的產量在固體發酵條件下也高于液體發酵，其最高產率達到了 5(Tl00mg/kg (Hong Wei, TakuyaItohj Masahiro Kinoshita.Cytotoxic sesterterpenes， 6_epi—ophiobolin G and6-ep1-ophiobolin N， from marine derived fungus Emericella variecolor GF10.Tetrahedron.2004,60:6015 - 6019)。發明內容
本發明的首要目的在于提供一種高產蛇孢假殼素類化合物焦曲霉菌株。
本發明的另一目的在于提供上述菌株在制備蛇孢假殼素類化合物中的應用。
本發明的再一目的在于提供利用上述菌株制備蛇孢假殼素類化合物的方法。
本發明的目的通過下述技術方案實現: 一種高產蛇孢假殼素類化合物菌株焦曲霉TKYX429，該菌株保藏于中國典型培養物保藏中心(保藏日期:2013年5月2日，保藏地址:中國.武漢.武漢大學)，其分類命名為焦曲霉 TKYX429 Aspergillus ustus TKYX429，保藏編號為 CCTCC NO:M2013166。
所述的焦曲霉TKYX429通過太空誘變得到，具體為:將焦曲酶094102Aspergillus ustus 094102 (焦曲酶 094102 Aspergillus ustus 094102 保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M208153)的孢子送往“神州8號”搭載(通過強輻射，微重力和高真空等太空綜合環境因素誘發其基因變異)，返回后制備孢子懸液，分離單菌落，挑取286株菌發酵，檢測蛇孢假殼素類化合物合成量，初篩獲得49株正變株，再經過復篩和遺傳穩定性測試獲得。
所述的焦曲霉TKYX429具有如下生物學特征: 菌落在查氏培養基28°C培養7天直徑25-35mm，培養15天直徑45_60mm ;菌落呈灰褐色，有白色邊緣，質地棉絮狀，無滲出液；菌落反面不均勻的黃褐色。分生孢子梗發生于氣生菌絲，分生孢子頭幼時為球形，老后成為輻射形。孢梗莖400-800 μ mX 10-16 μ m,具褐色，壁光滑。頂囊球形或半球形，6-13 μ m，大部分表面可育；產孢結構雙層，梗基4-9 μ mX 3-3.5 μ m,瓶梗4-10 μ mX 2-3 μ m ;分生孢子球形，3-5 μ m,明顯粗糙，具小突起。
所述的焦曲霉TKYX429具有如下分子生物學特征:ITS和18S序列如SEQ ID N0.1和2所示。
上述焦曲霉TKYX429在制備蛇孢假殼素類化合物中的應用。
利用焦曲霉TKYX429制備蛇孢假殼素類化合物的方法，包含如下步驟:將焦曲霉TKYX429種子液接種到固體培養基上進行發酵，蛇孢假殼素類化合物存在于發酵產物中。
所述的固體培養基的配方優選包含如下配比的成分:基質50g，酵母提取物0.86g，酒石酸銨2.37g, MgSO4 0.17g, KH2PO4 0.25g ;所述的基質優選為秈米、玉米或小麥粉碎顆粒物。
所述的種子液優選為種齡2`-3天的種子液。
所述的種子液與固體培養基的比例優選為10mL/100g。
所述的發酵條件優選為:培養溫度20_25°C，相對濕度40-50%，鹽度2_3% (g/mL),容器裝量10-50g/700mL，發酵周期15-20天。
所述的利用上述焦曲霉TKYX429制備蛇孢假殼素類化合物的方法，還包括蛇孢假殼素類化合物的粗提取步驟，具體為:稱取一定質量發酵產物，按質量體積比(g/mL)= 1:2加80% (V/V)丙酮,經破碎機破碎后,超聲20min,8000rpmX IOmin離心,取上清液,用旋轉蒸發儀蒸干丙酮，剩余液體用等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并乙酸乙酯，用旋轉蒸發儀蒸干乙酸乙酯得到蛇孢假殼素類化合物的粗提物。
本發明相對于現有技術具有如下優點和效果: 本發明利用菌株焦曲霉TKYX429，通過發酵工藝優化，用固體發酵的方式將ophiobolins的產率由原來液體發酵的40mg/L提高到3950mg/kg,并且在發酵產物的粗提物中ophiobolins的含量約占80%,而其中的95%為ophiobolin K,有利于后續的分離純化。且發酵所用原料易得，成本低。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
蛇孢假殼素類(ophiobolins)化合物的含量檢測方法如下: 稱取待檢樣品，按按終濃度25mg/mL加甲醇(色譜級)溶解。用WATERS 2998 HPLC,phenomenex C18(250mmX4.60mm)反相色譜柱,進樣 IOyL,全波長檢測，λ max=230_240nm,流速 lmL/min,甲醇:水=85:15(V/V),沖洗 30min, tmin=8-30min,用外標法計算 ophiobolins產率。外標方程為y=3X 107 x-760408，R2 =0.9959。通過與標準品的保留時間作對比，判斷ophiobolins的種類。
實施例1高產蛇孢假殼素類化合物菌株焦曲霉TKYX429的獲得 將焦曲酶094102的孢子送往“神州8號”搭載，返回后制備孢子懸液，分離單菌落，挑取286株菌發酵，檢測蛇孢假殼素類化合物合成量，初篩獲得49株正變株，再經過復篩和遺傳穩定性測試獲得高產蛇孢假殼素類化合物菌株焦曲霉TKYX429。
該菌株已于2013年5月2日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址:中國武漢、武漢大學，其分類命名為焦曲霉TKYX429 Aspergillus ustus TKYX429，保藏編號為CCTCC NO:M2013166o
實施例2焦曲霉TKYX429種子液的制備 將焦曲霉TKYX429的孢子懸浮液接種到IOOmL真菌2號培養基中，在28°C、搖床轉速220rpm下培養3天得到種子液；其中，真菌2號培養基組成(g/L):甘露醇20.0、麥芽糖20.0、葡萄糖10.0、味精10.0、酵母提取物3.0、玉米漿1.0、磷酸二氫鉀0.5、硫酸鎂0.3，余量為水，pH6.5。
實施例3固體培養基的配制 取IOg碎秈米粒(或者碎玉米/碎小麥)放到700mL容器中，加蒸餾水沒過玉米，浸泡后將水浙干，稱取酵母提取物0.172g，酒石酸銨0.474g，MgSO4 0.034g, KH2PO4 0.05g，海鹽(購于武漢厚積生物技術有限·公司)0.08g，加水4 mL，溶解后倒入碎玉米粒中并攪拌均勻，在121°C下滅菌60min。通過在固體培養基中加入海鹽和水，使后續發酵中相對濕度為40%，鹽度為2%。
實施例4焦曲霉TKYX429的固體發酵 將固體培養基用接種鏟鏟碎，按10% (mL/100g)的接種量用移液槍取ImL搖好的種子液接到培養基中，將接種好的培養基放到25°C的恒溫箱中，培養18天。
實施例5固體發酵產物的粗提取 稱取實施例4 一定質量發酵產物，按質量體積比(g/mL)= 1:2加80% (V/V)丙酮，經破碎機破碎后，超聲20min,8000rpmX IOmin離心,取上清液,用旋轉蒸發儀蒸干丙酮,剩余液體用等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并乙酸乙酯，用旋轉蒸發儀蒸干乙酸乙酯。經HPLC檢測蛇孢假殼素類化合物產率為3950mg/kg，其中Ophiobolin K約3750mg。在發酵產物的粗提物中ophiobolins的含量約占80%,而其中的95%為ophiobolin K。
實施例6焦曲霉TKYX429的液體發酵 按10% (mL/100g)的接種量用移液槍取搖好的種子液用移液槍接種到真菌2號培養基中，將接種好的培養基放到25°C的恒溫箱中，培養18天。經HPLC檢測發酵產物中蛇孢假殼素類化合物產率為40mg/L。
實施例7焦曲霉TKYX429的固體發酵器擴大發酵 用BMR-EG型50L固體發酵罐，投料量為IOkg玉米粉碎顆粒物，酵母提取物172g，酒石酸銨 474g，MgS04 34g, KH2PO4 5g，海鹽 8g，加水 400 mL，115°C滅菌 30min，按 10%(mL/100g)的接種量接種培養基，溫度為25°C，培養18天。將發酵產物粗提取后經HPLC檢測蛇孢假殼素類化合物產率為2700mg/kg。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所做的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的 置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種高產蛇孢假殼素類化合物菌株焦曲霉TKYX429，其特征在于該菌株保藏于中國典型培養物保藏中心，分類命名為焦曲霉TKYX429 Aspergillus ustus TKYX429，保藏編號為 CCTCC NO:M2013166o
2.根據權利要求1所述的高產蛇孢假殼素類化合物菌株焦曲霉TKYX429，其特征在于具有如下生物學特征:菌落在查氏培養基28°C培養7天直徑25-35mm，培養15天直徑45-60mm ;菌落呈灰褐色，有白色邊緣，質地棉絮狀，無滲出液；菌落反面不均勻的黃褐色；分生孢子梗發生于氣生菌絲，分生孢子頭幼時為球形，老后成為輻射形；孢梗莖400-800 μ mX 10-16 μ m,具褐色，壁光滑；頂囊球形或半球形，6-13 μ m,大部分表面可育；產孢結構雙層，梗基4-9 μ mX 3-3.5 μ m,瓶梗4-10 μ mX 2-3 μ m ;分生孢子球形，3-5 μ m，明顯粗糙，具小突起。
3.根據權利要求1所述的高產蛇孢假殼素類化合物菌株焦曲霉TKYX429，其特征在于具有如下分子生物學特征:ITS和18S序列如SEQ ID N0.1和2所示。
4.權利要求1-3任一項所述的高產蛇孢假殼素類化合物菌株焦曲霉TKYX429在制備蛇孢假殼素類化合物中的應用。
5.利用權利要求1-3任一 項所述的高產蛇孢假殼素類化合物菌株焦曲霉TKYX429制備蛇孢假殼素類化合物的方法，其特征在于包括如下步驟:將焦曲霉TKYX429種子液接種到固體培養基上進行發酵。
6.根據權利要求5所述的制備蛇孢假殼素類化合物的方法，其特征在于: 所述的固體培養基的配方包含如下配比的成分:基質50g，酵母提取物0.86g，酒石酸銨2.37g，MgSO4 0.17g，KH2PO4 0.25g ;所述的基質為秈米、玉米或小麥粉碎顆粒物。
7.根據權利要求5所述的制備蛇孢假殼素類化合物的方法，其特征在于:所述的種子液為種齡2-3天的種子液。
8.根據權利要求5所述的制備蛇孢假殼素類化合物的方法，其特征在于:所述的種子液與固體培養基的比例為10mL/100g。
9.根據權利要求5所述的制備蛇孢假殼素類化合物的方法，其特征在于:所述的發酵條件為:培養溫度20-25°C，相對濕度40-50%，鹽度2_3%，容器裝量10-50g/700mL，發酵周期15-20 天。
10.根據權利要求5所述的制備蛇孢假殼素類化合物的方法，其特征在于還包括蛇孢假殼素類化合物的粗提取步驟，具體為:稱取一定質量發酵產物，按質量體積比=1:2加80%丙酮,經破碎機破碎后,超聲20min,8000rpmX IOmin離心,取上清液,用旋轉蒸發儀蒸干丙酮，剩余液體用等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并乙酸乙酯，用旋轉蒸發儀蒸干乙酸乙酯得到蛇孢假殼素類化合物的粗提物。
全文摘要
本發明涉及一種高產蛇孢假殼素類化合物菌株焦曲霉TKYX429及其應用，屬于生物工程領域。焦曲霉TKYX429通過太空誘變獲得，其保藏于中國典型培養物保藏中心，分類命名為焦曲霉TKYX429AspergillusustusTKYX429，保藏編號為CCTCCNOM2013166。焦曲霉TKYX429可用于制備蛇孢假殼素類化合物。將焦曲霉TKYX429種子液接種到固體培養基上進行發酵，可大大提高其產率；將發酵產物進行粗提取后，由原來液體發酵的40mg/L提高到3950mg/kg，粗提物中蛇孢假殼素類化合物的含量約占80%，而其中的95%為ophiobolinK，有利于后續的分離純化。
文檔編號C12N1/14GK103232945SQ20131018648
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月20日 優先權日2013年5月20日
發明者洪葵, 楊雪 申請人:武漢大學