一株高產耐高溫真菌α-淀粉酶的里氏木霉的制作方法
【技術領域】
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[0001]本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一株高產耐高溫真菌α -淀粉酶的里氏木霉。
【背景技術】
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[0002]α-淀粉酶全稱為ct-l，4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.1)，作用于淀粉時，可從分子內部切開ct -1,4-糖苷鍵而生成糊精和還原糖，由于產物的末端葡萄糖殘基Cl碳原子為α-構型，故得名為α-淀粉酶。
[0003]常見的Ct-淀粉酶有二種:細菌α-淀粉酶、真菌α -淀粉酶和麥芽α -淀粉酶。細菌Ct-淀粉酶是由細菌如枯草桿菌、地衣芽孢桿菌等產生的，細菌α-淀粉酶的熱穩定性較強。
[0004]真菌α -淀粉酶最早于1896年由日本的高峰讓吉從米曲霉中提取，并作為消化劑使用。50年代以來，真菌α-淀粉酶的應用范圍逐漸擴大，開始應用于淀粉制糖、釀造、面包、果蔬飲料、醫藥和飼料等領域。用于淀粉制糖可以生產出以麥芽三糖為主的新型糖漿；與葡萄糖苷轉移酶合用，可以制備異麥芽低聚糖；在傳統的飴糖、黃酒生產中使用此酶，可以簡化生產工藝，提高原料利用率，節省糧食，降低生產成本；用于面包制作可以縮短發酵周期，制成的面包氣孔分布均勻，體積大，保鮮期長，還可替代以往常用的面包添加劑溴酸鉀；用于醫藥可作為消化劑，代替動物中提取的酶；用于果蔬飲料可以消除渾濁，提高收率；用于飼料可以提高飼料利用率。因此，真菌α-淀粉酶的應用具有廣闊的市場前景。
[0005]但真菌α -淀粉酶的最適作用溫度在55°C左右，當溫度高于60°C便會逐漸失活，且熱穩定相對較低，不適用于較高溫度的反應過程，因此其應用與發展受到一定程度的限制。
【發明內容】
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[0006]為了解決上述技術問題，本發明提供了一株高產耐高溫真菌α-淀粉酶的里氏木霉。
[0007]本發明提供的高產耐高溫真菌α-淀粉酶的里氏木霉具體為里氏木霉901-18Trichoderma reesei901_18。該菌株已于2013年11月24日保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:中國.武漢.武漢大學)，保藏號CCTCC N0:M2013602o
[0008]所述菌株特點如下:
[0009]該菌株在PDA固體培養基上生長，形成的菌落特征為菌落呈棉絮狀，菌落呈淡綠色，菌落扁平，高0.2-0.8mm,菌落邊緣白色，整齊；生長速度快，48h菌落直徑達
1.5-8.5mm, 72h達30_55mm ;菌絲白色，有隔膜，菌絲壁光滑，直徑在2_5 μ m。分生孢子梗從菌絲的短側枝發生，側枝上對生。
[0010]所述里氏木霉901_18Trichoderma reesei901_18由一株分離自津市市河堤食用菌培植基地土壤樣本的里氏木霉菌株經紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變篩選獲得，具體篩選步驟如下:
[0011](I)將出發菌株接種到馬鈴薯斜面培養基上，連續傳代三次，活化菌種，加入無菌水振蕩洗下成熟的孢子，攪拌分散孢子得孢子懸浮液，將攪拌好的孢子懸浮液置于紫外燈下，垂直距離30cm攪拌照射200s，上述紫外照射都必須在避光的條件下進行。
[0012]將經過照射的懸液經梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經紫外照射的菌液稀釋涂平板做對照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報紙包好，置30°C培養48h，在長出的菌落中篩選出水解圈最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經梯度稀釋后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于30°C震蕩處理40min，將處理過的菌液經梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板。
[0013](2)高產菌種的初篩
[0014]將上述涂布均勻的平板，置30°C培養48h，篩出水解圈較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌 901-11,901-15, 901-18。
[0015](3)搖瓶發酵復篩
[0016]將獲得的三株菌901-11,901-15，901-18在含有30mL馬鈴薯液體培養基的250mL搖瓶中進行搖瓶發酵，種子接種量10% (V/V)，300C、150r/min培養72h，離心取發酵上清液制得粗酶液。
[0017](4)酶活測定
[0018]酶活單位的定義:lmL粗酶液,于65°C、ρΗ5.5條件下，Imin液化Img可溶性淀粉，即為I個酶活力單位，以U/mL表示。
[0019]經測定,菌株901-18，為穩定的最高產菌株。
[0020]培養特征:該菌株產真菌α -淀粉酶的最適pH3.0-6.5 ;最適溫度為27?30°C。
[0021]將所得的901-18菌株經發酵條件優化后可得耐高溫、熱穩定性好且酶活高的真菌α-淀粉酶，具體如下:
[0022]采用變溫調節的方法生產真菌α -淀粉酶，其發酵罐培養階段包括如下步驟:
[0023]將種子液以6%接種量接入發酵罐，培養溫度27?30°C，攪拌速度120_180r/m，通風量(V/V) 1:1-3，培養時間10-15h ;然后以l-2°c /h降溫速率緩慢降溫至10_15°C，恒溫培養15-20h ;繼續以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將一級種子罐發酵液以4%接種量追加接入發酵罐，恒溫培養20-30h ;最后以1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C，恒溫培養15-20h ;繼續以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至27?30°C，恒溫培養15_20h ；
[0024]補料控制:當發酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時,開始添加補料培養基，補料量以維持發酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ；
[0025]放罐標準:60-80 %菌體衰老自溶,酶活力增長緩慢。
[0026]所述發酵培養基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆餅粉15_25g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉 l-5g,消泡劑 0.Ι-lg,純凈水 100mL, pH 值 5-6.5，121。。滅菌 20min ；
[0027]所述補料培養基重量組成為:麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15-25 %，不足部分純凈水補足，pH值5-6.5，121-123°C滅菌30_40min。
[0028]發酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得真菌α -淀粉酶，其酶學性質如下:
[0029](I)該酶溫度適用范圍較寬，為50_75°C之間，最適作用溫度在65°C，70°C下保存3h仍具有80%以上酶活。
[0030](2)該酶最適反應pH值為5.5，在pH值4.5-7.0之間酶活保持在70%以上。
[0031](3)酶活:由本發明所提供的突變株901-18制備的耐高溫ct-淀粉酶酶活力可達12000-15000U/ml，相較出發菌株酶活提高3.6倍。
[0032]有益效果:
[0033]1、本發明使用紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變的方法獲得了一株高產真菌α -淀粉酶的里氏木霉菌株，該菌株變溫發酵生產條件下所產酶具有耐高溫、熱穩定性好，活力高的特點。
[0034]2、有該菌株生產所得的耐高溫真菌α -淀粉酶酶活力高達12000-15000U/ml，是原始菌株的3.6倍；該酶溫度適應范圍較寬，在50-75°C之間，耐溫度高，特別適合反應溫度高、液化工藝與糖化工藝并存的工業化需求。
【具體實施方式】
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[0035]下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發明的保護范圍。
[0036]實施例1:紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變篩選
[0037](I)孢子懸液的制備
[0038]將活化后的出發菌株斜面中加入1mL無菌水，充分震蕩制成孢子懸液。
[0039](2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變
[0040]將3mL孢子懸液置于無菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射200s。將經過照射的孢子懸液經梯度稀釋后(11-1O5)涂布于氯化鋰平板，并以未經紫外照射的孢子懸液稀釋涂平板做對照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報紙包好，置30°C培