一種磁性殼聚糖微球固定化黃嘌呤氧化酶的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及固定化酶領域，具體設及一種磁性殼聚糖微球固定化黃嚷嶺氧化酶的 制備方法。
【背景技術】
[0002] 磁性材料是一種用途廣泛，歷史悠久的功能材料。早在3000年W前，古人便將天然 磁鐵作為指南針使用，在現代，磁性材料被用作永磁馬達、磁軟盤、變壓器中的鐵屯、材料，作 為存儲器使用的磁光盤，計算機用磁記錄軟盤等等。磁性殼聚糖微球作為高分子材料與磁 性材料的復合物，一方面有著優良的超順磁性，使其很容易在外加磁場下實現對祀向物質 的富集、分離和回收利用；另一方面，又可通過活化修飾引入如醒基、簇基、環氧基等的功能 性基團而使其具有更多的功能特性。運些性質使磁性殼聚糖微球具有標記、固定、引導和磁 分離的功能，從而在酶工程、細胞生物學、分離工程、分子生物學等領域有著良好的發展前 景。
[0003] 近年來，關于磁性殼聚糖微球制備及其應用的研究越來越廣泛，尤其是在固定化 酶方面。例如研究發現利用磁性殼聚糖磁性微球，用于固定化血紅密孔菌漆酶 (Biochemical Engineering Journal,2005,25(1): 15-23)、月旨肪酉每（Biomass and Bioenergy ,2012,36:373-80)及纖維素酶(華南理工大學2012年碩±學位論文），可使酶的 熱穩定性、pH穩定性、操作穩定性、儲存穩定性W及酶的工作效率等得到很大程度的改善。
[0004] 黃嚷嶺氧化酶/脫氨酶廣泛存在于植物(小麥、魏豆苗、擬南芥等）、動物(牛奶、小 鼠乳腺及肝臟等)及微生物(節桿菌、鏈霉菌、光合細菌等）中，是一種含鋼、無機硫化物、非 血紅素鐵的黃素酶，能夠催化次黃嚷嶺、黃嚷嶺生成尿酸，直接調控著體內尿酸水平的高 低，是體內嚷嶺代謝的關鍵酶。黃嚷嶺氧化酶作為一種重要的代謝調控酶，在醫學診斷及工 業應用中具有遠大前景，但游離酶較差的穩定性直接影響其應用。
[0005] 國內外關于黃嚷嶺氧化酶穩定性的研究主要集中于改變溶液環境提高其穩定性， 對固定化方法的研究較少。張玉然等用修飾的瓊脂糖介質及大孔陰離子交換樹脂固定化黃 嚷嶺氧化酶，發現W谷氨酸為連接臂的瓊脂糖介質（Sepharose-Glu)固定化效果最佳，酶活 回收率達到15.5% (食品與生物技術學報，2014,33(1) :16-21)。陳國南等研究W黃嚷嶺氧 化酶修飾的電加熱碳糊電極，發現電極的電化學發光強度與次黃嚷嶺的濃度呈線性關系， 另外，不同于一般的溫敏電極，該電極的溫度是可控的（Analytical化emis化y ,2008,80 (8): 2826-2831) sRa化el Radi等將黃嚷嶺氧化酶固定在由裡皂石納米顆粒構成的玻碳電 極上進行電化學研究，所制備的固定化酶不僅保留其生物活性，而且顯示良好的電化學性 能（Biosensors and Bioelectronics,2009,24(12):3556-3561)。
[0006] 專利公開號為CN1368552A的專利公開了 "一種可見光交聯復合樹脂固定黃嚷嶺氧 化酶活性細胞的方法"，公開日期為2002年9月11日，申請人為武漢大學。該方法W可見光交 聯復合樹脂作為載體，將黃嚷嶺氧化酶活性細胞包埋于其中，經可見光照射，制備了固定化 細胞。制備的固定化細胞具有抗微生物分解性能好，機械強度高，化學性能穩定，重復反應 穩定性高，酶活保留高等方面的優點。
[0007] 專利公開號為CN1834241A的專利公開了 "一種固定化黃嚷嶺氧化酶及其制備方法 和用途"，公開日期為2006年9月20日，申請人為武漢大學。方法如下:將碳納米管開管氧化， 用水洗涂至中性并烘干，將烘干后的碳納米管和雙十六烷基憐酸加入蒸饋水中，超聲分散 得分散液;將分散液涂附在基體上，烘干，得到混合膜;將混合膜放入黃嚷嶺氧化酶溶液吸 附，得到固定化黃嚷嶺氧化酶。該專利的突出特點是能同時得到黃嚷嶺氧化酶Ξ對氧化還 原中屯、的電化學信號，并且黃嚷嶺氧化酶保持其生物活性，能催化其底物-硝酸根的還原， 有較好的穩定性和重現性。
[0008] 專利公開號為CN103558306A的專利公開了 "一種篩選黃嚷嶺氧化酶抑制劑的復合 物及其應用方法"，公開日期為2014年2月5日，申請人為中南大學。該專利通過戊二醒作為 交聯劑，將黃嚷嶺氧化酶固定在氨基化的四氧化Ξ鐵納米粒子表面，得到黃嚷嶺氧化酶修 飾的磁性納米四氧化Ξ鐵粒子，用于快速篩選中草藥中抑制黃嚷嶺氧化酶的活性物質。
[0009] 綜上所述，關于固定化方法的研究，大多數是將黃嚷嶺氧化酶固定成酶電極，用作 電化學研究。目前關于磁性殼聚糖微球固定化黃嚷嶺氧化酶的報道尚無，而本發明提供了 一種新的固定化黃嚷嶺氧化酶的方法，且該方法得到的固定化酶機械強度高，穩定性好，生 物活性高，可用于后續的蛋白分離與純化研究。
【發明內容】
[0010] 本發明的目的是提供一種磁性殼聚糖微球固定化黃嚷嶺氧化酶的制備方法，該方 法得到的固定化酶不僅保留其高效的生物活性，還具有良好的穩定性和重復利用性，而且 該方法本身具有操作簡單，條件易于控制等優點。
[0011] 本發明的目的通過W下技術方案實現：
[0012] -種磁性殼聚糖微球固定化黃嚷嶺氧化酶的制備方法，該方法利用化學共沉淀法 審恪Fe3〇4磁性顆粒，并WFe3〇4磁性顆粒為磁核通過乳化交聯法制備磁性殼聚糖微球，用環 氧氯丙烷對磁性殼聚糖微球表面進行活化，用于黃嚷嶺氧化酶的固定化研究。
[0013] 進一步地，所述化學共沉淀法制備Fe3〇4磁性顆粒的步驟為:將摩爾比為3:1~1:1 的FeCl3 ·細2〇和FeCl2 · 4此0混合，氮氣保護下滴加化0H溶液，至溶液變為黑亮色，30~50 °C下攬拌30~40min，結束后加入0.5~1血油酸，于70~80°C水浴振蕩下熟化30~60min，超 聲10~20min;冷卻后用磁鐵吸附，用無水乙醇和去離子水洗涂，干燥，得化3化磁性顆粒。
[0014] 更進一步地，所述化學共沉淀法制備化3〇4磁性顆粒的步驟為:將摩爾比為3:1~1: 1的FeCl3 · 6出0和化Cl2 · 4出0混合，氮氣保護下滴加化0田容液，至溶液變為黑亮色，30°C下 攬拌30min，結束后加入0.5mL油酸，于80°C水浴振蕩下熟化30min，超聲lOmin;冷卻后用磁 鐵吸附，用無水乙醇和去離子水洗涂，干燥，得化3化磁性顆粒。
[001引更進一步地，所述FeCb · 6出0和FeCl2 · 4出0的摩爾比為4:3~2:1。
[0016]進一步地，所述乳化交聯法制備磁性殼聚糖微球的步驟為：制備10~15mg/mL的殼 聚糖醋酸溶液，在溶液中加入Fe3〇4磁性顆粒，超聲分散30~40min;分散結束后，加入80~ 120mL液體石蠟、1.5~3mL吐溫-80、1.5~3g Span-80，在40~60°C水浴條件下攬拌30~ 40min;逐滴加入1~5ml戊二醒溶液，升溫至60~70°C，攬拌1~1.化，逐滴滴加化0田容液調 節pH至9.0~11.0,置于70-75°C恒溫振蕩1~1.5h，超聲10~15min;冷卻后用磁鐵吸附分 離，用無水乙醇和去離子水洗涂，干燥，得磁性殼聚糖微球。
[0017]更進一步地，所述乳化交聯法制備磁性殼聚糖微球的步驟為：制備10~15mg/血的 殼聚糖醋酸溶液，在溶液中加入Fe3〇4磁性顆粒，超聲分散30min ;分散結束后，加入80~ 1201^液體石蠟、1.5~31^吐溫-80、1.5~3旨59311-80，在40°(3水浴條件下攬拌30111111;逐滴 加入2ml戊二醒溶液，升溫至60°C，攬拌化，逐滴滴加化OH溶液調節抑至9.0~11.0左右，置 于70°C恒溫振蕩化，超聲10~15min;冷卻后用磁鐵吸附分離，用無水乙醇和去離子水洗涂， 干燥，得磁性殼聚糖微球。
[0018] 更進一步地，殼聚糖與Fe3〇4磁性顆粒的質量比為2:1~1:2,水相與油相的體積比 為1:3~1:6,戊二醒的體積分數為10~50%。
[0019] 進一步地，所述對磁性殼聚糖微球表面進行活化的步驟為:稱取磁性殼聚糖微球 于離屯、管內，加入化0田容液與環氧氯丙烷溶液，攬拌混勻，加入NaBH4溶液，恒溫水浴振蕩反 應3~化。
[0020] 更進一步地，恒溫水浴振蕩反應地。
[0021] 進一步地，所述化0田容液的濃度為0.2~1.6mol/L，環氧氯丙烷溶液的體積分數為 10~50 %，NaBH4溶液的濃度為0.3~1.5g/L。
[0022] 進一步地，對所制備的Fe3〇4磁性顆粒和磁性殼聚糖微球進行了紅外、粒徑及熱重 分析，證明化3化磁性顆粒成功包裹在殼聚糖中。
[0023] 進一步地，所述黃嚷嶺氧化酶的固定化步驟為:稱取0.01~0.05g經過活化的磁性 殼聚糖微球于離屯、管中，加入100~50化L黃嚷嶺氧化酶酶液，2~4mL化is-HCl緩沖液，在 水浴震蕩下進行固定化，得磁性殼聚糖微球固定化黃嚷嶺氧化酶。
[0024] 進一步地，所述固定化時間為30~ISOmin，固定化溫度為25~60°C，固定化pH為 6.0 ~10.0。
[0025] 黃嚷嶺氧化酶酶活測定方法:稱取0.01~0.05g的磁性殼聚糖微球固定化黃嚷嶺 氧化酶于離屯、管中，加入40化L 1~lOmmol/L的黃嚷嶺標準液，3mL顯色液，水浴保溫20min 后磁鐵分離，取清液在508nm下測定吸光值。W顯色液作為參比溶液。
[0026] 固定化黃嚷嶺氧化酶活力單位(U/g)定義:在30°C下每克磁性殼聚糖微球固定化 黃嚷嶺氧化酶每分鐘催化ΙμL?ο?黃嚷嶺，出0和化生成Ιμπιο?出化和尿酸為1個活力單位。
[0027]
[002引式中：C為此化濃度，mmo 1/1; V為溶液總體積，mM t為反應時間，min ;m為微球質量，邑。
[0029]
[0030] 與現有技術相比，本發明具有如下優點與技術效果：
[0031 ] (1)制備步驟簡單易行，利于工業生產；
[0032] (2)載體具有較好的機械強度，不會因機械攬拌或其他作用力影響破碎或脫落，載 體可有效回收利用；
[0033] (3)本發明制備的固定化酶保持其生物活性，有較好的重現性；
[0034] (4)本發明制備的固定化酶具有良好的熱穩定性，pH穩定性及操作穩定性。
【附圖說明】
[0035] 圖1為實施例lFe3化磁性顆粒、殼聚糖、未活化和已活化磁性殼聚糖微球的傅里葉 變換紅外光譜圖。
[0036] 圖2為實施例lFe3化磁性顆粒、未活化和已活化磁性殼聚糖微球的粒徑分布圖。
[0037] 圖3為實施例1磁性殼聚糖微球的熱重分析(DTG)和差示掃描量熱分析(DSC)圖。
[0038] 圖4為實施例1固定化酶的最適溫度曲線圖。
[0039] 圖5為實施例1固定化酶的最適pH曲線圖。
[0040] 圖6為實施例1固定化酶的熱穩定性曲線圖。
[0041] 圖7為實施例1固定化酶的pH穩定性曲線圖。
[0042] 圖8為實施例1固定化酶的操作穩定性圖。
【具體實施方式】
[0043] 下面結合實施例對本發明作進一步說明，但本發明的實