C攪拌反應3h，反應結束后將反應液減壓蒸除溶劑，得到 式（I)所示的丙氨環丙沙星粗品。通過制備液相(Column: Sunf ire，（ 3 · 5um，150*4 · 6mm)流動 相八：出0(0.01%丁卩八）-8:乙腈（0.01%丁卩八）1-911^115%8-95%8,9-1411^11，95%8，14-1511^11 95 % B-5 % B，流速1. OmL/min，柱溫40 °C)制得丙氨環丙沙星純品。
[0046] 用紅外光譜掃描儀、ESI-MS與核磁共振法進行鑒定。
[0047]
[0048]式（I)丙氨環丙沙星的紅外光譜顯示，波數3373CHT1處寬大吸收峰為半抗原中羧羥 基吸收峰；3518CHT1處吸收峰為半抗原中-NH2吸收峰，3012〇11_1，1628〇11 _1芳香環吸收峰， 2711(^1、1497〇11'805(^1為伯胺的伸縮振動和面內搖擺震動的特征吸收；1709〇11 _1強吸收 峰為羰基特征峰。因此可認為3-溴丙氨與環丙沙星連結成功。丙氨環丙沙星的紅外光譜見 說明書附圖1.
[0049] 式（I)丙氨環丙沙星的( + )ESI-MS(電噴霧質譜)全掃描質譜圖譜中，出現m/z 389 的[M+1 ]+準分子離子峰與m/z 372的[(M+l)-NH2]+離子峰，與半抗原分子質量對應;式⑴丙 氨環丙沙星的( + )ESI-MS質譜圖譜見附圖2W/Z389可能的碎裂機理如下：
[0050]
[0051] 進一步對m/z 389.3的分于離于進行（ + )ESI-MS2分析，m/z 389的分于離于裂解后 出現m/z 332、241、213、186、173等碎片離子峰，都能合理歸屬;其ESI-MS質譜圖譜見說明書 附圖3 W/Z389分子離子歸屬為半抗原環丙沙星單-丙氨基。
[0052] 式（I)丙氨環丙沙星^-NMR: (500MHz，DMS0-d6)Sl5.13(s，lH，Ar-C00H)，8.69(s， 1H，2-H)，7.96(d，lH，J=13,5-H)，7.62(d，lH，J=13Hz，8-H)，3.86(m，lH，ll-H)，3.45(m， 8H，piperazine)，3.24(m，4H 19,21-H)，2.92(m，2H，20-H).2.0(s，2H，-N坦），1.33(m，2H， 13-!〇，1.20(111，2!1，12-!〇 ;式（1)丙氨環丙沙星1!1-匪1?圖譜見說明書附圖4。
[0053] 式（I)丙氨環丙沙星 13C-NMR: (500MHz，DMS0-d6)Sl76.3(C-4)，165.8(C-14)，153.9 (C-6)，151.8(02)，148.2(07)，143.8(0 10)，139.0(09)，111 .1(05)，106.9(03)， 106.7(C-8)，52.8(C-16，17)，50.7(C-15，18)，46.5(C-19)，36.3(21-C)，35.9(C-20)，21.7 (C-11)，7.56(C-12,13)。從氫歸屬情況可推斷環丙沙星成功連接了3-丙氨基，并暴露出了 氨基(S2.0s，2H);式（I)丙氨環丙沙星 13C-NMR圖譜見說明書附圖5。
[0054] 實施例2:戊二醛法合成環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白包被抗原(CIP-C3H6-NH2-BSA)
[0055] 分析天平稱取實施例1準備的丙氨環丙沙星0.10g，溶于5mL 0.6mol/L的HC1溶液 中，加入30mg鋅粉，80°C水浴鍋加熱30min，得溶液A。稱取100mg牛血清蛋白（BSA)溶解于2mL 的0.02mol/L的PBS液中，得溶液B。將溶液A緩慢滴加到溶液B中充分混合，滴加 0. lml的25% 戊二醛，室溫攪拌6h。混合液裝入透析袋，用0.01mol/L的PBS液(PH7.4)4°C下透析72h，制得 環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白（CIP-C 3H6-NH2-BSA)。于-20°C保存。
[0056] 對實施例1制備的式（I)丙氨環丙沙星(CIP-C3H6_NH 2)、實施例2制備的環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白（CIP-C3H6-NH 2-BSA)、牛血清蛋白（BSA)進行紫外掃描。紫外掃描圖譜顯 示，環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白紫外掃描曲線具有半抗原式（I)丙氨環丙沙星和載體蛋白 曲線的共同特征，根據吸收峰相加性可判斷丙氨環丙沙星與牛血清蛋白偶聯成功;其紫外 掃描圖譜見說明書附圖6。
[0057] 將本實驗制備得到的包被抗原免疫新西蘭兔，得到了高特異性的環丙沙星抗體。
[0058] 實施例3碳二亞胺法合成環丙沙星-丙氨-卵清蛋白（CIP-C3H6-NH 2-〇VA)包被抗原
[0059 ] 取實施例1制備的丙氨環丙沙星0.10g，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得溶液C， 取1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)30mg充分溶于4mL蒸餾水中，緩慢滴 加至溶液C中，室溫攪拌反應24h，得溶液D。離心，取上清液緩慢滴加至5mL含50mg卵清蛋白 (0VA)的碳酸鈉緩沖溶液(0.1m 〇l/L)中。4°C冰箱攪拌72h，得環丙沙星-丙氨-卵清蛋白抗原 (CIP-C3H 6-順2-0VA))，- 20°C保存。
[0060] 對實施例1制備的式（I)丙氨環丙沙星(CIP-C3H6-NH 2)、實施例3制備的環丙沙星-丙氨-卵清蛋白（CIP-C3H6-NH2-V0A)、牛血清蛋白（BSA)進行紫外掃描。紫外掃描圖譜顯示， 環丙沙星-丙氨-卵清蛋白紫外掃描曲線具有半抗原式(I)丙氨環丙沙星和載體蛋白曲線的 共同特征，根據吸收峰相加性可判斷丙氨環丙沙星與卵清蛋白偶聯成功;其紫外掃描圖譜 見說明書附圖7。
[0061] 將本實驗制備得到的包被抗原免疫新西蘭兔，得到了高特異性的環丙沙星抗體。
【主權項】
1. 一種如下式(I)所示的丙氨環丙沙星化合物：2. -種式(I)化合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 取鹽酸環丙沙星〇.33g，溶于10mlN，N-二甲基甲酰胺溶液中，80°C攪拌； (2) 逐滴加入氫溴酸3 -溴丙氨0.26g，80°C攪拌3h; (3) 將步驟(2)制備得到的反應液減壓蒸餾，得到式(I)化合物。3. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟還包括:通過制備液相色譜， 純化式(I)化合物； 其中所述制備液相色譜的色譜柱尺寸為150mm X 4.6mm，色譜柱的固定相填充顆粒的粒 徑為3.5um;流動相流速1 .OmL/min，柱溫40°C ; 所述制備色譜色譜的流動相為乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液：以體積百分比計， 1 - 9分鐘為5 % -95 %的乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液，9-14分鐘為95 %的乙腈的三氟 乙酸水溶液，14-15分鐘為95% - 5%的乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液，其中所述三氟 乙酸水溶液為含體積濃度〇. 01 %的三氟乙酸的水溶液;收集制備液相色譜柱的流出液，得 純化的式(I)化合物。4. 式(I)化合物用于制備環丙沙星抗原的用途。5. -種制備環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白的方法，包含以下步驟： (1) 取式（I)化合物〇· 1 〇g，溶于5mL 0·6mo 1 /L的鹽酸溶液中，加入30mg鋅粉，80°C水浴 鍋加熱30min，得溶液A; (2) 稱取100mg牛血清蛋白溶解于2mL的0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液中，得溶液B; (3) 將溶液A緩慢滴加到溶液B中充分混合，滴加體積濃度25 %的戊二醛水溶液0. lml， 室溫攪拌6小時;混合液裝入透析袋，PH值7.4的0.0 lmol/L的磷酸鹽緩沖液液4°C透析72小 時，得環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白。6. 根據權利要求5所述制備方法得到的環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白。7. 根據權利要求6所述的環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白的應用，在于以所述環丙沙星-丙 氨-卵清蛋白作為抗原免疫新西蘭兔制備環丙沙星抗體。8. -種制備環丙沙星-丙氨-卵清蛋白的制備方法，包含以下步驟： (1) 式(I)化合物0.10g，溶于N，N-二甲基甲酰胺，得溶液C; (2) 取1 - (3-二甲氨基丙基）-3 -乙基碳二亞胺鹽酸鹽30mg，溶于4mL蒸餾水，緩慢滴加至 溶液C中，室溫攪拌24小時，得溶液D; (3) 將步驟（2)制備的溶液D離心，取上清液，緩慢滴加至5mL含50mg卵清蛋白的碳酸鈉 緩沖水溶液中，所述碳酸鈉緩沖水溶液的濃度為〇. lmol/L，4°C攪拌72小時，得環丙沙星-丙 氨-卵清蛋白。9. 根據權利要求8所述制備方法得到的環丙沙星-丙氨-卵清蛋白。10.根據權利要求9所述的環丙沙星-丙氨-卵清蛋白的應用，在于以所述環丙沙星-丙 氨-卵清蛋白作為抗原免疫新西蘭兔制備環丙沙星抗體。
【專利摘要】本發明提供了一種環丙沙星半抗原及其制備方法和用途，以及以此環丙沙星半抗原制備的環丙沙星抗原。將該環丙沙星抗原免疫新西蘭兔，可得到高特異性的抗體。
【IPC分類】C07D215/56, C07K14/765, C07K14/77, C07K1/107, C07K16/44
【公開號】CN105622506
【申請號】CN201610005017
【發明人】馮亭亭, 魏東, 李永民, 龐永宏, 范建國, 郭芬芳, 孫慧芝, 張愛峰, 李續俊, 梁建飛
【申請人】河北北方學院
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年1月4日