具有提高免疫活性的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有提高免疫活性的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物及其制備方法，多糖硫酸化修飾產物中硫酸基含量為24.79％，多糖含量為52.10％，多糖由摩爾比為0.45:18.96:1.0:0.53的甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖組成。本發明通過大量實驗優選提取分離工藝，采用水提醇沉法得到粗多糖，再脫蛋白，然后采用DEAE?52纖維素樹脂進行純化，制得純度高的黃蜀葵莖葉多糖，再采用氨基磺酸法修飾得到黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物。本發明充分利用廢棄的黃蜀葵莖葉資源，變廢為寶，得到可提高免疫活性的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物，可實現中藥資源的可持續化應用，具有很好的經濟價值和生態環境保護意義。
【專利說明】
具有提高免疫活性的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物及其制 備方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種植物多糖，具體涉及一種具有提高免疫活性的黃蜀葵莖葉多糖硫 酸化修飾產物及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 中藥資源是保障國民健康、發展民族醫藥的堅實基礎。近年來中藥及天然藥用生 物資源的生產面積已超過2.40 X 106hm2，藥材產量可達5.40 X 106t，而廢棄的植物根系以及 地上莖葉的生物量高達I. I X IO7~1.6 X 107t，是藥材產量2~3倍，造成了嚴重的資源浪費 和環境污染。因此，在中藥資源產業化過程中提高藥用生物資源的利用價值、尤其是提升其 藥用價值，對于中醫藥產業的健康發展以及發展資源節約型、環境友好型的經濟具有重大 意義。
[0003] 黃蜀葵(Abelmoschus manihot L.Medic)為錦葵科秋葵屬植物，始載于《嘉祐本 草》，《本草綱目》中記載："其花氣味甘、寒、滑、無毒，主治小便淋及催生，治諸惡瘡膿水久不 瘥者，作末敷之即愈，為瘡家要藥"等。其根、莖、葉均具有一定的藥用價值。黃蜀葵花為主要 用藥部位，在采收過程中其莖葉部分多被丟棄或是焚燒，造成了黃蜀葵莖葉資源的極大浪 費以及環境的污染。
[0004] 多糖是一類結構復雜的高分子物質，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗突變、抗輻射 和增強免疫等多種生物學功效。但一般情況下，天然提取的多糖生物活性較弱。在天然多糖 分子中引入某種離子基團并且具有恰當的取代度時，不僅能夠顯著改善多糖在水中的溶解 度，而且可以使多糖的鏈構象發生改變，從而使其具有某種特定的結構而提高生物活性。多 糖的硫酸酯化修飾即是將多糖分子的羥基末端、羧基末端或者氨基末端用硫酸基團取代， 可導致原有多糖的生物活性發生明顯改變。
[0005] 目前，國內外對黃蜀葵莖葉多糖的研究主要集中在理化性質以及單糖的分析，對 其活性的研究較少。因此，應用硫酸化修飾技術改變黃蜀葵莖葉多糖的結構、改善其理化性 質，獲得真正具有活性的多糖，對黃蜀葵莖葉資源的高效利用以及生態環境的保護意義重 大。
【發明內容】
[0006] 發明目的：本發明的目的是為了解決現有技術的不足，以黃蜀葵莖葉廢棄物為原 料，通過優選方法制備得到黃蜀葵莖葉粗多糖，然后采用硫酸酯化修飾，得到具有提高免疫 活性的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物。本發明另一個目的是提供黃蜀葵莖葉多糖硫酸化 修飾產物的制備方法和其應用。本發明充分利用廢棄的黃蜀葵莖葉資源，變廢為寶，高免疫 活性的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物，可實現中藥資源的可持續化應用，具有很好的經 濟價值和生態環境的保護意義。
[0007] 技術方案:為了實現以上目的，本發明采用的技術方案為：
[0008] 一種黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物，黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物中硫酸基 含量為24.79%，多糖含量為52.10%，多糖由摩爾比為0.45:18.96:1.0:0.53的甘露糖、葡 萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖組成。
[0009] 作為優選方案，黃蜀葵莖葉多糖及黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物的分子量分別 為760·24kDa和236·75kDa。
[0010] 作為優選方案，以上所述的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物的制備方法，包括以 下步驟：
[0011] (1)取黃蜀葵莖葉乙醇提取后的藥渣，加入藥渣重量1 〇~30倍體積的水，回流提取 2~3次，每次1~2小時，過濾，合并濾液，減壓濃縮;Sevag法除蛋白，離心，取上清液，加入無 水乙醇，醇沉過夜，抽濾，取沉淀，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，烘干，得黃蜀葵莖葉粗 多糖；
[0012] (2)黃蜀葵莖葉粗多糖的分級
[0013] 稱取步驟（1)制備得到的黃蜀葵莖葉粗多糖，加蒸餾水溶解，加樣于DEAE-52層析 柱中，用0.0、0.1、0.3、0.5mo 1/L NaCl溶液梯度洗脫，并采用苯酚-硫酸法檢測多糖含量，分 別收集不同的洗脫峰，減壓濃縮，透析，最后將透析液真空冷凍干燥，獲得黃蜀葵莖葉多糖；
[0014] (3)黃蜀葵莖葉多糖的硫酸化修飾
[0015] 取步驟(2)制備得到的黃蜀葵莖葉多糖，采用氨基磺酸法進行修飾:準確稱取黃蜀 葵莖葉多糖，在室溫條件下攪拌溶于二甲基甲酰胺中，加入氨基磺酸，于80~90°C攪拌反 應。反應結束后，冰水浴冷卻至室溫，用NaOH調節pH至中性，透析，取透析液，濃縮，凍干，得 黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物。
[0016] 作為優選方案，以上所述的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物的制備方法，步驟(3) 準確稱取黃蜀葵莖葉多糖40mg，在室溫條件下攪拌30min，溶于15mL二甲基甲酰胺中，加入 120mg氨基磺酸，于80 °C攪拌反應3h，反應結束后，冰水浴冷卻至室溫，用NaOH調節pH至中 性，透析3天，取透析液，濃縮，凍干，得黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物。
[0017] 本發明通過實驗研究表明，經過硫酸化修飾得到的的黃蜀葵莖葉多糖產物具有顯 著的促進脾淋巴細胞增殖的作用，可用于制備提高免疫力的藥物或保健品。
[0018] 本發明所述的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物在制備提高免疫力的藥物或保健 品中的應用，可將黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物和藥學上可接受的載體制成片劑、膠囊 劑、顆粒劑或微囊劑型的藥物。
[0019] 本發明在制成片劑時，在黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物中添加載體乳糖或玉米 淀粉，需要時加入潤滑劑硬脂酸鎂，混合均勻，然后壓片制成片劑。
[0020] 在制成膠囊劑時，將黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物和載體乳糖或玉米淀粉混合 均勻，整粒，然后裝膠囊制成膠囊劑。
[0021 ]本發明在制成顆粒劑時，把黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物和稀釋劑乳糖或玉米 淀粉混合均勾，整粒，干燥，制成顆粒劑。
[0022] 有益效果:本發明提供的具有提高免疫活性的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物和 現有技術相比具有有點：
[0023] 1、本發明通過大量實驗優選提取分離工藝，首先采用水提醇沉法得到粗多糖，再 脫除蛋白，然后采用DEAE-52纖維素樹脂進行純化，制得純度高的黃蜀葵莖葉多糖，然后再 采用氨基磺酸法進行修飾，純化，得到黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物。本發明充分利用廢 棄的黃蜀葵莖葉資源，變廢為寶，制備得到可提高免疫活性的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾 產物，可實現中藥資源的可持續化應用，具有很好的經濟價值和生態環境的保護意義。
[0024] 2、本發明經過體外小鼠脾淋巴細胞的增殖活性試驗表明，黃蜀葵莖葉多糖并無明 顯的免疫調節活性，但是經硫酸化修飾后，在25~200yg/mL劑量范圍內表現出顯著的免疫 調節活性，取得了非常好的預料不到的技術效果。
【附圖說明】
[0025] 圖1為黃蜀葵莖葉粗多糖的紅外光譜圖。
[0026] 圖2為黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物的紅外光譜圖。
[0027] 圖3為黃蜀葵莖葉多糖及其硫酸化修飾產物的脾細胞增殖活性柱狀圖。
【具體實施方式】
[0028]根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限 制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0029] 實施例1
[0030] 黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物的制備方法，包括以下步驟：
[0031] (1)黃蜀葵莖葉粗多糖的制備
[0032] 取黃蜀葵莖葉經乙醇回流提取后的干燥藥渣100g，加入藥渣重量30倍體積量的 水，100 °C水浴回流提取3次，每次Ih。過濾，合并濾液，減壓濃縮。Sevag法除蛋白，離心 (4000r/min，IOmin)，取上清液，加入四倍體積的無水乙醇，醇沉過夜，抽濾，沉淀依次用無 水乙醇、丙酮、乙醚洗滌三次，50°C烘干，即得黃蜀葵莖葉粗多糖。
[0033] (2)黃蜀葵莖葉粗多糖的分級
[0034]稱取步驟(1)制備得到的黃蜀葵莖葉粗多糖3g，加適量蒸餾水溶解，配制質量濃度 為30mg/ml的多糖溶液，加樣于DEAE-52層析柱中。用0 ·0、0 · 1、0 · 3、0 · 5mol/L NaCl溶液梯度 洗脫，流速1.0mL/min(10min/管），采用苯酚-硫酸法檢測多糖含量，分別收集不同的洗脫 峰，減壓濃縮，透析，最后將透析液真空冷凍干燥，獲得黃蜀葵莖葉粗多糖（多糖含量達 99%)〇
[0035] (3)黃蜀葵莖葉多糖的硫酸化修飾
[0036] 取步驟(2)制備得到的黃蜀葵莖葉粗多糖，采用氨基磺酸法進行修飾。準確稱取黃 蜀葵莖葉粗多糖40mg，在室溫條件下攪拌30min溶于15mL DMF中。加入120mg氨基磺酸，于80 °(：攪拌反應3h。反應結束后，冰水浴冷卻至室溫，用NaOH調節pH至中性，透析3天，濃縮，凍 干，得黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物。
[0037] 實施例2黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物總糖含量與取代度的測定
[0038] 1、以D-無水葡萄糖為標準品，采用苯酚-硫酸法測定硫酸化修飾前后黃蜀葵莖葉 粗多糖的總糖含量；WK 2SO4為標準品，采用氯化鋇-明膠比濁法測定硫酸根含量，按照下式 計算取代度(DS)。 Γ ? 1.62 XS % 0039] D、= -- -~- 32-1.02X5%
[0040] 式中：S%為硫元素含量
[0041] 2、單糖組成分析
[0042] 采用三氟乙酸水解、PMP衍生多糖樣品，以混合單糖為標準品，采用高效液相色譜 法根據出峰時間確定單糖的組成，根據峰面積繪制各單糖的標準曲線測定樣品的單糖含 量。
[0043] 3、紅外光譜分析
[0044]取經過干燥的黃蜀葵莖葉粗多糖和黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物樣品各Img， 與100~200mg經干燥的溴化鉀粉末于瑪瑙研缽研磨均勻，分別壓成薄片，分別在紅外光譜 儀上測定4000~400CHT 1的紅外光譜。
[0045] 4、小鼠脾淋巴細胞增殖試驗
[0046] 無菌取脾，制備小鼠脾淋巴細胞懸液，調整細胞濃度為6 X IO6個/mL，于96孔板接 種IOOyL/孔，再分別加入培養液(空白對照）、IOyg/mL ConA(刀豆球蛋白A，陽性對照），不同 濃度的黃蜀葵莖葉粗多糖和不同濃度的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物樣品溶液各?〇〇μ L/孔，每個濃度均設4個復孔，混合均勻后置于37 °C、5 % CO2培養24h。培養結束前4h，每孔加 入MTT(5mg/mL) IOyL，于上述條件中繼續培養4h，離心棄上清，加入IOOyL DMSO，充分震蕩后 用酶標儀測定波長570nm的吸光值。
[0047]淋巴細胞增殖指數=樣品組吸光值/空白對照組吸光值 [0048] 5、實驗結果
[0049] 5.1總糖以及取代度的測定分析結果，如表1所示：
[0050] 表1黃蜀葵莖葉粗多糖和黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物的總糖含量與取代度的 測定
[0052]如表1所示，黃蜀葵莖葉粗多糖的總糖含量為99.76%，不含硫酸基，修飾后的硫酸 基含量為24.79%，總糖含量為52.10%，主要是被大量的硫酸基取代，黃蜀葵莖葉多糖硫酸 化修飾產物的硫酸基取代度為0.57，糖鏈上已連上硫酸基。
[0053] 5.2單糖組成分析結果如表2所示：
[0054]表2黃蜀葵莖葉粗多糖及其硫酸化修飾產物的單糖組成摩爾比
[0056]黃蜀葵莖葉粗多糖及其硫酸化修飾產物的單糖組成的摩爾比如表2所示，黃蜀葵 莖葉粗多糖由甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖組成，其中葡萄糖的比例最高，其它三 種糖的比例較低。硫酸化修飾后，其葡萄糖的含量有所下降，主要是部分糖鏈被硫酸基取 代。黃蜀葵莖葉多糖和黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物的分子量分別為760.24kDa和 236.75kDa。在修飾過程中，黃蜀葵莖葉多糖發生了部分降解。
[0057] 5.3紅外光譜分析
[0058]如圖1和圖2所示，黃蜀葵莖葉粗多糖在3400CHT1左右的吸收峰為O-H鍵的伸縮振 動，2900cm-1左右的吸收峰為C-H鍵的伸縮振動，為糖類特征吸收。黃蜀葵莖葉多糖硫酸化 修飾產物除了保留黃蜀葵莖葉粗多糖的主體特征吸收外，其在1251cm- 1處出現的明顯的不 對稱S = 0伸縮振動的吸收峰，以及在820CHT1處的C-O-S的拉伸振動吸收峰，表明糖鏈上已經 引入了硫酸基團，硫酸化修飾成功。
[0059] 5.4脾細胞增殖活性分析
[0060]黃蜀葵莖葉粗多糖及其硫酸化修飾產物的脾細胞增殖活性實驗結果如圖3所示。 圖中a表示與對照組相比，增強作用差異顯著(p<0.05);圖中b表示與對照組相比，增強作 用差異極顯著(P<〇.01);圖中c表示與對照組相比，增強作用差異極其顯著(p<0.001);圖 中e表示與SLAMP-a組相比，增強作用差異極顯著(p<0.01);圖中f表示與SLAMP-a組相比， 增強作用極其差異顯著(P<〇.001)。
[0061 ] 對照組的增殖指數為0.998，陽性組為1.744。
[0062]由圖3可知，與對照組相比，黃蜀葵莖葉粗多糖在25~200yg/mL濃度范圍內不能刺 激脾淋巴細胞的增殖，而黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物具有顯著的促進脾淋巴細胞增殖 的作用。黃蜀葵莖葉粗多糖在lOOμg/ml劑量時具有最強的增殖作用，增殖指數為1.472,在 25μg/ml時增殖指數最低，為1.267，而修飾前的最高刺激指數僅為1.079，取得了非常好的 技術效果。
[0063]以上實施方式只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的 人了解本
【發明內容】
并加以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍，凡根據本發明精神實 質所做的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物，其特征在于，黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產 物中硫酸基含量為24.79%，多糖含量為52.10%，多糖由摩爾比為0.45:18.96:1.0:0.53的 甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖組成。2. 權利要求1所述的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 取黃蜀葵莖葉乙醇提取后的藥渣，加入藥渣重量10~30倍體積的水，回流提取2~3 次，每次1~2小時，過濾，合并濾液，減壓濃縮;Sevag法除蛋白，離心，取上清液，加入無水乙 醇，醇沉過夜，抽濾，取沉淀，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，烘干，得黃蜀葵莖葉粗多糖； (2) 黃蜀葵莖葉粗多糖的分級 稱取步驟（1)制備得到的黃蜀葵莖葉粗多糖，加蒸餾水溶解，加樣于DEAE-52層析柱中， 用0.0、0.1、0.3、0.5mo 1/L NaCl溶液梯度洗脫，并采用苯酚-硫酸法檢測多糖含量，分別收 集不同的洗脫峰，減壓濃縮，透析，最后將透析液真空冷凍干燥，獲得黃蜀葵莖葉多糖； (3) 黃蜀葵莖葉多糖的硫酸化修飾 取步驟(2)制備得到的黃蜀葵莖葉多糖，采用氨基磺酸法進行修飾:準確稱取黃蜀葵莖 葉多糖，在室溫條件下攪拌溶于二甲基甲酰胺中，加入氨基磺酸，于80~90°C攪拌反應。反 應結束后，冰水浴冷卻至室溫，用NaOH調節pH至中性，透析，取透析液，濃縮，凍干，得黃蜀葵 莖葉多糖硫酸化修飾產物。3. 根據權利要求2所述的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物的制備方法，其特征在于，步 驟(3)準確稱取黃蜀葵莖葉多糖40mg，在室溫條件下攪拌30min，溶于15mL二甲基甲酰胺中， 加入120mg氨基磺酸，于80 °C攪拌反應3h，反應結束后，冰水浴冷卻至室溫，用NaOH調節pH至 中性，透析3天，取透析液，濃縮，凍干，得黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物。4. 權利要求1所述的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物在制備提高免疫力的藥物或保健 品中的應用。5. 根據權利要求4所述的黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物在制備提高免疫力的藥物或 保健品中的應用，其特征在于，把黃蜀葵莖葉多糖硫酸化修飾產物和藥學上可接受的載體 制成片劑、膠囊劑、顆粒劑或微囊劑型的藥物。
【文檔編號】A61K31/737GK105859907SQ201610409994
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月12日
【發明人】江曙, 潘欣欣, 段金廒, 朱悅, 錢大瑋, 嚴輝
【申請人】南京中醫藥大學