一種酶法輔助制備泡葉藻多糖的方法與流程

本發明涉及生物制劑的技術領域，尤其涉及一種酶法輔助制備泡葉藻多糖的方法。

背景技術：

泡葉藻(ascophyllumnodosum)，又稱巖衣藻，是一種大型的海洋褐藻,主要在北大西洋沿岸生長繁殖。和其他褐藻(比如海帶)相似。泡葉藻含有豐富的褐藻膠(alginateacid)(約占藻體所含總糖質的79％)，是工業生產褐藻膠、碘和甘露醇的主要原料之一。除褐藻膠外，泡葉藻還含有約占藻體總糖質的13％的泡葉藻聚糖(ascophyllan)和8％的巖藻聚糖(fucoidan)。在我國，泡葉藻在工業上主要被用作提取褐藻膠的原料；農業生產上用來制作化肥、飼料等；在食品行業中主要用來制作海藻粉。

泡葉藻聚糖，又稱泡葉藻糖膠。早在20世紀60年代，挪威科學家larsen指出泡葉藻中存在一種區別于褐藻膠和巖藻聚糖的多糖硫酸酯，并將其命名為泡葉藻聚糖(ascophyllan)。由于很長一段時間沒有從結構及生物活性方面將泡葉藻聚糖與巖藻聚糖相區分，從而忽視了對其進行深入研究。近年來，研究指出泡葉藻聚糖具有多種優良的生物活性，如免疫刺激、抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥活性等，但傳統的泡葉藻多糖提取法提取率只有6％左右且顏色較深對其在食品領域的應用有很大的限制作用。多糖的提取方法有水提法、酸堿提法、微波提取、超聲提取、生物酶法等與其他方法相比，酶法輔助提取多糖具有條件溫和，操作方便，經濟節約等優點。多糖的脫色方法有活性炭吸附、有機溶劑萃取、大孔樹脂吸附、h2o2氧化脫色等，不同的脫色方法在不同的多糖脫色過程中呈現不同的效果。

有鑒于此，本發明人研究和設計了一種酶法輔助制備泡葉藻多糖的方法，本案由此產生。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種酶法輔助制備泡葉藻多糖的方法，旨在提高其提取率的同時對其顏色進行有效脫除，使其在食品領域和生物醫藥領域有重要的應用價值和良好的開發前景。

為了實現上述目的，本發明解決其技術問題所采取的技術方案是：

一種酶法輔助制備泡葉藻多糖的方法,包括以下步驟：

步驟一、泡葉藻粉的制備：

將泡葉藻洗凈、烘干后、粉碎，過60目標準篩，制得泡葉藻粉；

步驟二、纖維素酶處理：

將泡葉藻粉浸泡于10-50倍體積的水中，再添加100iu/ml-300iu/ml的纖維素酶制劑，并在40℃-60℃溫浴1h-3h；

步驟三、水提：將步驟二得到的纖維素酶處理液取出，不斷攪拌，沸水浸提2h；

步驟四、除雜：將步驟三得到的提取液冷卻至室溫，在5000×g，20min條件下離心除去藻渣；用hcl調上清液ph至1.3，于4℃下過夜放置，在5000×g，20min條件下經冷凍離心去除沉淀褐藻膠；

步驟五、醇沉：將步驟四得到的上清液用naoh調至中性后，于4℃下用質量分數為50％的乙醇過夜沉淀，在5000×g的條件下冷凍離心獲取沉淀，沉淀過程重復2次，并合并沉淀物，經3500da分子量截留的透析袋透析后，冷凍干燥獲得泡葉藻多糖。

優選地，還包括步驟六、脫色：取泡葉藻多糖溶液于脫色釜中，加入雙氧水至終濃度體積分數為1.4％-8.6％，置于電熱恒溫水槽中，ph7.0，脫色溫度20℃-80℃，脫色時間0.5h-4.0h后，取出，經3500da分子量截留的透析袋透析后，冷凍干燥得成品。

優選地，所述步驟二中，水與泡葉藻粉的質量比為30。

優選地，所述步驟二中，酶制劑的添加量為200iu/ml。

優選地，所述步驟二中，酶解溫度為50℃，酶解時間為2h。

優選地，所述步驟六中，加入雙氧水至終濃度為8.6％。

優選地，所述步驟六中，脫色溫度60℃。

優選地，所述步驟六中，脫色時間4.0h。

本發明的技術效果是加入纖維素酶制劑可以提高泡葉藻多糖的提取率，可使多糖的提取率與不加酶處理的最高提高50％。同時經雙氧水脫色后多糖白度值和多糖保留率分別可達到61.1％、90.0％，此條件下，泡葉藻聚糖白度值、保留率以及免疫刺激活性均處于較優的水平，脫色成本和設備要求較低，有利于泡葉藻多糖的工業化生產。

附圖說明

圖1為正交實驗組多糖誘導raw264.7細胞放出no的測定結果。

具體實施方式

實施例1

一種酶法輔助制備泡葉藻多糖的方法,包括以下步驟：

步驟一、泡葉藻粉的制備：

將泡葉藻洗凈、烘干后、粉碎，過60目標準篩，制得泡葉藻粉；

步驟二、纖維素酶處理：

將泡葉藻粉浸泡于10-50倍體積的水中，再添加100iu/ml-300iu/ml的纖維素酶制劑，并在40℃-60℃溫浴1h-3h；

步驟三、水提：將步驟二得到的纖維素酶處理液取出，不斷攪拌，沸水浸提2h；

步驟四、除雜：將步驟三得到的提取液冷卻至室溫，在5000×g，20min條件下離心除去藻渣；用hcl調上清液ph至1.3，于4℃下過夜放置，在5000×g，20min條件下經冷凍離心去除沉淀褐藻膠；

步驟五、醇沉：將步驟四得到的上清液用naoh調至中性后，于4℃下用質量分數為50％的乙醇過夜沉淀，在5000×g的條件下冷凍離心獲取沉淀，沉淀過程重復2次，并合并沉淀物，經3500da分子量截留的透析袋透析后，冷凍干燥獲得泡葉藻多糖。

實施例2

一種酶法輔助制備泡葉藻多糖的方法,包括以下步驟：

步驟一、泡葉藻粉的制備：

將泡葉藻洗凈、烘干后、粉碎，過60目標準篩，制得泡葉藻粉；

步驟二、纖維素酶處理：

將泡葉藻粉浸泡于30倍體積的水中，再添加300iu/ml的纖維素酶制劑，并在50℃溫浴3h；

步驟三、水提：將步驟二得到的纖維素酶處理液取出，不斷攪拌，沸水浸提2h；

步驟四、除雜：將步驟三得到的提取液冷卻至室溫，在5000×g，20min條件下離心除去藻渣；用hcl調上清液ph至1.3，于4℃下過夜放置，在5000×g，20min條件下經冷凍離心去除沉淀褐藻膠；

步驟五、醇沉：將步驟四得到的上清液用naoh調至中性后，于4℃下用質量分數為50％的乙醇過夜沉淀，在5000×g的條件下冷凍離心獲取沉淀，沉淀過程重復2次，并合并沉淀物，經3500da分子量截留的透析袋透析后，冷凍干燥獲得泡葉藻多糖。根據稱量得到泡葉藻聚糖質量得到提取率為11.43％。

實施例3

一種酶法輔助制備泡葉藻多糖的方法,包括以下步驟：

步驟一、泡葉藻粉的制備：

將泡葉藻洗凈、烘干后、粉碎，過60目標準篩，制得泡葉藻粉；

步驟二、纖維素酶處理：

將泡葉藻粉浸泡于30倍體積的水中，再添加200iu/ml的纖維素酶制劑，并在60℃溫浴1h；

步驟三、水提：將步驟二得到的纖維素酶處理液取出，不斷攪拌，沸水浸提2h；

步驟四、除雜：將步驟三得到的提取液冷卻至室溫，在5000×g，20min條件下離心除去藻渣；用hcl調上清液ph至1.3，于4℃下過夜放置，在5000×g，20min條件下經冷凍離心去除沉淀褐藻膠；

步驟五、醇沉：將步驟四得到的上清液用naoh調至中性后，于4℃下用質量分數為50％的乙醇過夜沉淀，在5000×g的條件下冷凍離心獲取沉淀，沉淀過程重復2次，并合并沉淀物，經3500da分子量截留的透析袋透析后，冷凍干燥獲得泡葉藻多糖。根據稱量得到泡葉藻聚糖質量得到提取率為14.39％。

實施例4泡葉藻聚糖酶輔助提取響應面試驗

以酶濃度，酶解時間，酶解溫度為三因素對纖維素酶提取泡葉藻聚糖進行響應面試驗，如表1所示，結果如表2所示。

表1box‐behnken實驗因素和水平編碼值表

表2中心組合試驗方案及泡葉藻聚糖提取率結果

實施例5不同脫色方法對泡葉藻聚糖脫色效果的影響

將泡葉藻多糖通過活性炭吸附法脫色：取15.0ml泡葉藻聚糖溶液(4.0mg/ml)，按質量體積比加入3.0％的活性炭，室溫脫色12h，離心(5000×g，5min)，上清液冷凍干燥至恒重備用；

有機溶劑萃取法脫色：取60.0mg泡葉藻聚糖粉末5份，分別加入15.0ml甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮和四氫呋喃試劑沉淀聚糖，室溫脫色12h后，離心(5000×g，5min)棄上清，取出沉淀，烘干至恒重后備用；

大孔樹脂吸附法脫色：將大孔樹脂(d101、d101-1和dm130)活化后，填入層析柱(2.6cmi.d.×20cm)，取5.0ml泡葉藻聚糖溶液(4.0mg/ml)，上樣進入大孔樹脂的層析柱，室溫孵育12h，蒸餾水洗至洗脫液無色，收集洗脫液溶液，冷凍干燥至恒重備用；

h2o2氧化法脫色：15.0ml泡葉藻聚糖溶液(4.0mg/ml)，分別加入1.4、3.0、7.5ml的體積分數為30％的h2o2溶液，至h2o2溶液終濃度的體積分數分別為2.5、5.0、10.0％，室溫孵育12h，經純水透析(3500dacut-off)后冷凍干燥至恒重，備用。

分別以干燥后泡葉藻聚糖保留率和白度為指標比較不同脫色方法對泡葉藻聚糖脫色效果的影響。以脫色率和多糖保留率為指標，各脫色劑脫色效果見表3，確定雙氧水為理想脫色劑。

表3不同脫色方法對泡葉藻聚糖脫色效果的影響

對泡葉藻聚糖的h2o2氧化脫色法進行因素水平正交試驗，如表4所示，結果如表5所示。

表4泡葉藻聚糖脫色正交試驗因素及水平

表5泡葉藻聚糖的h2o2氧化脫色法因素水平正交試驗設計及結果

對上述正交實驗組(如表5所示的實驗組號1-9)及未脫色處理(as)的多糖誘導raw264.7細胞放出no的測定，實驗組號1-9分別對應d1-as、d2-as、d3-as、d4-as、d5-as、d6-as、d7-as、d8-as、d9-as，結果如圖1所示。

其中，取15.0ml泡葉藻聚糖溶液(20.0mg/ml)，ph調至7.0，加入8.0ml的30％h2o2至h2o2終濃度為8.6％、置于60℃的電熱恒溫水槽脫色4.0h，脫色后泡葉藻聚糖樣品經純水透析(3500dacut-off)后冷凍干燥至恒重，計算泡葉藻聚糖保留率為90.0％，并用白度儀測定泡葉藻聚糖的藍光白度值為61.1％，再對脫色后的泡葉藻聚糖誘導raw264.7細胞放出no進行測定，結果表明脫色后的泡葉藻聚糖對巨噬細胞刺激產生的no可達到原多糖的76.7％。

其中，取15.0ml泡葉藻聚糖溶液(20.0mg/ml)，ph調至7.0，加入8.0ml的30％h2o2至h2o2終濃度為8.6％、置于60℃的電熱恒溫水槽脫色2.0h，脫色后泡葉藻聚糖樣品經純水透析(3500dacut-off)后冷凍干燥至恒重，計算泡葉藻聚糖保留率為93.4％，并用白度儀測定泡葉藻聚糖的藍光白度值為32.8％，再對脫色后的泡葉藻聚糖誘導raw264.7細胞放出no進行測定，結果表明脫色后的泡葉藻聚糖對巨噬細胞刺激產生的no可達到原多糖的126.7％。

以上所述，僅為本發明較佳實施例而已，故不能依此限定本發明實施的范圍，即依本發明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明涵蓋的范圍內。